一種可表達vsv?g的重組畢赤酵母菌及其制備和應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可表達VSV?G的重組畢赤酵母菌及其制備和應用，重組畢赤酵母菌具有畢赤酵母菌KM71的形態(tài)、遺傳和生理生化特征，且通過發(fā)酵能夠表達VSV?G。制備方法包括（1）采用PCR反應從質粒pLP/VSV?G中克隆VSV?G基因片段；（2）制備重組質粒pGM?T?VSV?G；（3）制備重組質粒pPIC3.5K?VSV?G；（4）重組表達載體通過電轉化法轉化畢赤酵母KM71，利用組氨酸缺陷平板、遺傳霉素平板及PCR篩選陽性重組子；（5）取陽性重組子進行培養(yǎng)誘導離心收集菌體并用酸性玻璃珠裂解。本發(fā)明采取的表達策略為胞內表達，有效消除了甲醇對細胞裂解液的污染。利用畢赤酵母表達系統(tǒng)制備VSV?G蛋白，裂解液經(jīng)過濾除菌后可直接用于細胞轉染。為VSV?G的大批量制備提供了基礎，也對VSV?G的研究及相應疾病治療具有重要意義。
【專利說明】
一種可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌及其制備和應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及合成生物學技術，基因工程技術，尤其涉及一種可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌及其制備和應用。
【背景技術】
[0002]水皰型口炎病毒糖蛋白G(下稱VSV-G)是錨定與水皰型口炎病毒(下稱VSV)表面，并含有C末端跨膜結構的三聚體病毒膜蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，VSV-G在介導水皰性口炎病毒進入宿主細胞上起主要作用，且水皰性口炎病毒感染物種的普遍性也與此蛋白有關。VSV-G在較低PH值的環(huán)境中會發(fā)生構象變化，該變化導致可促進病毒體進入被感染細胞的一系列反應，包括受體細胞識別和粘附，激活受體細胞內吞以及融合受體細胞膜，病毒最終在細胞中釋放病毒遺傳物質，進而擴增。
[0003]由于VSV感染物種的多樣性和穩(wěn)定性，其表面融合蛋白VSV-G已經(jīng)被研究并用做假病毒體的制備，以介導向細胞內的物質傳遞。另外，當VSV-G被整合至人工脂質體膜上時，會形成一種類似病毒的運載體，可用于向靶細胞內運輸生物大分子如抗體、DNA及一些復雜的細胞器，實驗證實，該運載體的物質傳遞效率較高。
[0004]目前，VSV-G的制備方式主要為從VSV病毒體直接提取或制備轉染了VSV-G基因的細胞條件培養(yǎng)液。然而，一些復雜耗時的步驟，如蔗糖密度梯度離心；以及細胞培養(yǎng)基的高成本限制了 VSV-G的大批量生產。
[0005]畢赤酵母(P.pas1ris)表達系統(tǒng)是近幾年成功建立的，較為成熟可靠的蛋白質大批量生產工具。目前，很多生物活性物質已由該系統(tǒng)生產成功，如抗體和酶。由于轉入畢赤酵母內的表達載體會以同源重組的方式整合在酵母基因組上，使得該系統(tǒng)具有外源基因遺傳的穩(wěn)定性。此外，畢赤酵母還具有成熟的蛋白修飾系統(tǒng)，分子操作簡單易行和成本低廉等優(yōu)勢。此前，已有數(shù)種病毒膜蛋白在此系統(tǒng)中成功表達，如HIV-1表面蛋白gpl20，HBsAg和登革熱病毒E蛋白。
[0006]由于VSV-G蛋白在基礎研究和疾病治療上具有重要意義，構建一種能夠表達VSV-G的重組畢赤酵母工程菌對VSV-G的研究以及大規(guī)模制備奠定了基礎。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明實施例所要解決的技術問題在于，提供一種可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌及其制備和應用解決現(xiàn)有技術存在的問題。
[0008]為了實現(xiàn)上述的目的，采用如下的技術方案:
一種可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌，具有畢赤酵母菌KM71的形態(tài)、遺傳和生理生化特征，且通過發(fā)酵能夠表達VSV-G。
[0009]進一步的，所述VSV-G以生物活性的方式存在于所述畢赤酵母菌KM71的裂解液中。
[0010]所述可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌中含有可表達VSV-G蛋白的基因序列，該序列如下:atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgcaagttcaccatagtttttccacacaaccaaaaaggaaactggaaaaatgttccttctaattaccattattgcccgtcaagctcagatttaaattggcataatgacttaataggcacagccttacaagtcaaaatgcccaagagtcacaaggctattcaagcagacggttggatgtgtcatgcttccaaatgggtcactacttgtgatttccgctggtatggaccgaagtatataacacattccatccgatcctteactccatctgtagaacaatgcaaggaaagcattgaacaaacgaaacaaggaacttggctgaatccaggcttccctcctcaaagttgtggatatgcaactgtgacggatgccgaagcagtgattgtccaggtgactcctcaccatgtgctggttgatgaatacacaggagaatgggttgattcacagttcatcaacggaaaatgcagcaattacatatgccccactgtccataactctacaacctggcattctgactataaggtcaaagggctatgtgattctaacctcatttccatggacatcaccttcttctcagaggacggagagctatcatccctgggaaaggagggcacagggttcagaagtaactactttgcttatgaaactggaggcaaggcctgcaaaatgcaatactgcaagcattggggagtcagactcccatcaggtgtctggttcgagatggctgataaggatctctttgctgcagccagattccctgaatgcccagaagggtcaagtatctctgctccatctcagacctcagtggatgtaagtctaattcaggacgttgagaggatcttggattattccctctgccaagaaacctggagcaaaatcagagcgggtcttccaatctctccagtggatctcagctatcttgctcctaaaaacccaggaaccggtcctgctttcaccataatcaatggtaccctaaaatactttgagaccagatacatcagagtcgatattgctgctccaatcctctcaagaatggtcggaatgatcagtggaactaccacagaaagggaactgtgggatgactgggcaccatatgaagacgtggaaattggacccaatggagttctgaggaccagttcaggatataagtttcctttatacatgattggacatggtatgttggactccgatcttcatcttagctcaaaggctcaggtgttcgaacatcctcacattcaagacgctgcttcgcaacttcctgatgatgagagtttattttttggtgatactgggctatccaaaaatccaatcgagcttgtagaaggttggttcagtagttggaaaagctctattgcctcttttttctttatcatagggttaatcattggactattcttggttctccgagttggtatccatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagatttatacagacatagagatgaaccgacttggaaagtaa
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[0011 ] VSV-G基因必須編碼下列氨基酸序列:
MkcllylaflfigvnckftivfphnqkgnwknvpsnyhycpsssdlnwhndligtalqvkmpkshkaiqadgwmchaskwvttcdfrwygpkyithsirsftpsveqckesieqtkqgtwlnpgfppqscgyatvtdaeavivqvtphhvIvdeytgewvdsqfingkcsnyicptvhnsttwhsdykvkglcdsnlismditffsedgelsslgkegtgfrsnyfayetggkackmqyckhwgvrlpsgvwfemadkdlfaaarfpecpegssisapsqtsvdvsliqdveriIdysIcqetwskiraglpispvdlsylapknpgtgpaftiingtlkyfetryirvdiaapilsrmvgmisgttterelwddwapyedveigpngvlrtssgykfplymighgmldsdlhlsskaqvfehphiqdaasqlpddeslffgdtglsknpielvegwfsswkssiasfffiigliiglflvlrvgihlciklkhtkkrqiytdiemnrlgko
[0012]進一步的，上述可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌的制備方法，主要包括以下步驟:
(I)采用PCR反應從質粒pLP/VSV-G中克隆VSV-G基因片段；
(2 )回收步驟(I)所得VSV-G基因片段，并將所述VSV-G基因片段與pGM-T載體進行T-A連接，轉化入大腸桿菌Top 10,擴增培養(yǎng)，酶切檢測并測序，得到重組質粒pGM-T-VSV-G，以獲得EcoR頂每切位點；
(3)利用EcoRI對步驟(2)所得pGM-T-VSV-G酶切后得到VSV-G片段，連入表達載體PPIC3.5K，轉化入大腸桿菌Top 10，擴增培養(yǎng)，酶切檢測并測序，得到重組表達載體PPIC3.5K-VSV-G；
(4)將步驟(3)所得重組表達載體pPIC3.5K-VSV-G通過電轉化法轉化畢赤酵母KM71，利用組氨酸缺陷平板、遺傳霉素平板及PCR篩選，以陽性重組子； (5)取步驟(4)所得陽性重組子接種于BMGY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24 h，再轉入BMMY培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)96 h，離心收集菌體并用酸性玻璃珠裂解，再利用Western Blot檢測蛋白表達情況，確認VSV-G蛋白的表達。
[0013]進一步的，所述PCR反應的引物和反應條件如下:
引物I(F): 5 ’-CCATGGCCTGTTGCTC CACCAGCTT-3 ’
引物2 (R): 5 ’ -AAGCTTTCAGCAGTGGCTCACAGCAG-3 ’
反應條件為:94°C預變性3 min;94°C解旋30 s，59.5°C I min，60°C延伸30 s，30個循環(huán);72°C保溫 10 min。
[0014]進一步的，步驟(5)所述BMMY培養(yǎng)基中含有1%甲醇;所述誘導培養(yǎng)過程時每隔24h補加甲醇一次。
[0015]—種上述可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌的裂解液，能夠促進哺乳動物細胞DNA轉染。
[0016]—種上述裂解液制備方法，主要包括:將誘導后的可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌重懸于含有I mM PMSF的roS(20 mM, pH 7.4)中，加入等體積酸洗玻璃珠后，將混合物劇烈渦旋震蕩I min，立即置于冰上I min;重復多次后混合物在4°C下離心收集上清，再用0.22μπι濾膜過濾。
[0017]—種上述裂解液的應用，用于介導DNA轉染及其他相關領域中。該裂解液含有具有生物活性的VSV-G蛋白，能夠有效提高DNA的轉染效率。
[0018]酵母表達蛋白產物檢測:利用WesternBlot技術對表達產物進行檢測，具體步驟如下:酵母裂解液與PAGE Gel Loading Buffer混合，于沸水浴中加熱lOmin，取10-20 μ?混合液，上樣于SDS-PAGE凝膠(10%分離膠，5%濃縮膠)。電泳后利用半干轉方式將蛋白轉移至PVDF膜上。將膜漂洗后室溫下與封閉液孵育I h;漂洗后轉移至1:3000兔抗VSV-G—抗溶液中，4 °C孵育過夜;漂洗后在室溫與I: 50000鼠抗兔的二抗孵育I h。漂洗后用ECL顯色液曝光顯色。
[0019]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明制備VSV-G的方法具有操作相對簡便，不需要復雜的實驗步驟，重組畢赤酵母菌制備成功后可長期保存、反復使用；同時具有成本低廉的優(yōu)勢，不需要成分復雜且昂貴的細胞培養(yǎng)基。且誘導培養(yǎng)之后僅需對酵母菌進行裂解即可產出具有VSV-G生物活性的裂解液，可直接用于細胞實驗。在DNA轉染中，能夠有效提高質粒DNA轉染動物細胞的效率。本發(fā)明采取的表達策略為胞內表達，有效消除了甲醇對細胞裂解液的污染。本發(fā)明開創(chuàng)性地利用畢赤酵母表達系統(tǒng)制備VSV-G蛋白，這不但為VSV-G的大批量制備提供了基礎，也對VSV-G的研究及相應疾病治療具有重要意義。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明的可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌的制備方法示意圖；
圖2為本發(fā)明的酵母裂解液介導細胞間蛋白傳遞的檢測和功能驗證的熒光照片；
圖3為本發(fā)明酵母裂解液與質粒pGL3-C0ntr0l孵育后轉染Ad293細胞48 h后的效果統(tǒng)計圖；
圖4為本發(fā)明酵母裂解液與質粒pGL3-C0ntr0l孵育后轉染HeLa細胞48 h后的效果統(tǒng)計圖； 圖5為本發(fā)明酵母裂解液與質粒pCMV-DsRed孵育后轉染Ad293細胞24 h后的熒光照片；圖6為本發(fā)明酵母裂解液與質粒pCMV-DsRed孵育后轉染Ad293細胞24 h后的陽性細胞數(shù)量統(tǒng)計圖；
圖7為本發(fā)明酵母裂解液與質粒pCMV-DsRed孵育后轉染HeLa細胞24 h后的熒光照片；圖8為本發(fā)明酵母裂解液與質粒pCMV-DsRed孵育后轉染HeLa細胞24 h后的陽性細胞數(shù)量統(tǒng)計圖。
【具體實施方式】
[0021]為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明作進一步地詳細描述。
[0022]實施例1
1、制備可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌的方法和步驟，如圖1所示，主要包括以下步驟:
(1)采用PCR反應從質粒pLP/VSV-G中克隆VSV-G基因片段，引物和反應條件如下；
引物I(F): 5 ’-CCATGGCCTGTTGCTC CACCAGCTT-3 ’
引物2 (R): 5 ’ -AAGCTTTCAGCAGTGGCTCACAGCAG-3 ’
反應條件為:94°C預變性3 min;94°C解旋30 s，59.5°C I min，60°C延伸30 s，30個循環(huán);72 °C 保溫 1 min
(2)回收DNA片段，并將片段與pGM-T載體進行T-A連接，轉化入大腸桿菌Top10,擴增培養(yǎng)，酶切檢測并測序，得到重組質粒pGM-T-VSV-G;
(3)利用EcoRI對pGM-T-VSV-G酶切后得到VSV-G片段，連入表達載體pPIC3.5K，轉化入大腸桿菌Top 10,擴增培養(yǎng)，酶切檢測并測序，得到重組質粒pPIC3.5K-VSV-G;
(4)重組表達載體通過電轉化法轉化畢赤酵母KM71，利用組氨酸缺陷平板、遺傳霉素平板及PCR篩選陽性重組子；
(5)取陽性重組子接種于BMGY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24h，再轉入BMMY(含1%甲醇)培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)96 h(每隔24 h補加甲醇一次)。離心收集菌體并用酸性玻璃珠裂解，利用Western Blot檢測蛋白表達情況。
[0023]2、酵母裂解液的制備，主要包括以下步驟:誘導后的可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌重懸于I ml含有I mM PMSF的I3BS (20 mM, pH 7.4)中，加入等體積酸洗玻璃珠后，將混合物劇烈渦旋震蕩I min，立即置于冰上I min。該步驟重復10次?；旌衔镌?°C下以13000g離心收集上清。該上清用0.22μπι濾膜過濾后即為酵母裂解液。
[0024]3、酵母表達蛋白產物檢測:
利用Western Blot技術對表達產物進行檢測，具體步驟如下:
酵母裂解液與PAGE Gel Loading Buffer混合，于沸水浴中加熱10 min，取10-20 μ I混合液，上樣于SDS-PAGE凝膠(10%分離膠，5%濃縮膠)。電泳后利用半干轉方式將蛋白轉移至PVDF膜上。將膜漂洗后室溫下與封閉液孵育I h;漂洗后轉移至1:3000兔抗VSV-G—抗溶液中，4 0C孵育過夜;漂洗后在室溫與I: 50000鼠抗兔的二抗孵育I h ο漂洗后用ECL顯色液曝光顯色。
[0025]實施例2
酵母裂解液介導細胞間蛋白傳遞的檢測和功能驗證。
[0026]用pCAG-CreER和pCMV-DsRed/loxP2-EGFP分別轉染Ad293細胞。轉染后24h，將細胞消化，并以PCAG-CreER: pCMV-DsRed/loxP2-EGFP為2:1的比例鋪于96孔板中。待細胞完全貼壁后，將上述實施例1獲得的含有VSV-G的酵母裂解液用培養(yǎng)液加入到Ad293當中去，3 h后吸出80%裂解液并加入等體積檸檬酸鈉緩沖液(pH5.4)室溫孵育I min，吸出緩沖液，加入新鮮細胞培養(yǎng)液及10 mM的4-羥基它莫昔芬(4-HT)后置于37°C培養(yǎng)24 h，在熒光顯微鏡下觀察。CreER融合蛋白可以從細胞質進入細胞核，并在1xP位點之間進行DNA重組，使受體細胞從紅色轉為綠色。從圖2可以看到明顯的EGFP陽性細胞，說明酵母裂解液能成功傳遞CreER融合蛋白，而且進入細胞后，能成功釋放紅色蛋白質，證明了VSV-G細胞膜顆粒能夠有效傳遞蛋白質并發(fā)揮生物學功能。
實施例3
酵母裂解液促進質粒DNA轉染。
[0027]用PolyJet與Lipofectamine 2000轉染試劑按說明書要求與pGL3_control質粒孵育，分別轉染Ad293與HeLa細胞。細胞以I X 14每孔的密度提前鋪于96孔板中。轉染試劑與DNA復合物加入細胞后，再加入酵母裂解液，于37°C培養(yǎng)12 h后換液，于48 h時進行熒光素酶檢測。從圖3和圖4可以明顯看出使用重組酵母菌裂解液孵育，轉染時間為24 h時，Ad293細胞與HeLa細胞相對光強度單位(白色柱)均在5 μ?加入量處有最大值，約為空白對照的3倍。相應的，用野生型ΚΜ71裂解液孵育(黑色柱)時，則無明顯的效果。
[0028]用PolyJet與Lipofectamine 2000轉染試劑按說明書要求與pCMV-DsRed質粒孵育，分別轉染Ad293與HeLa細胞。細胞以I X 14每孔的密度提前鋪于96孔板中。轉染試劑與DNA復合物加入細胞后，再加入酵母裂解液，于37°C培養(yǎng)12 h后換液，于48 h時一部分細胞在熒光顯微鏡下觀察，另一部分細胞消化后用流式細胞儀統(tǒng)計發(fā)光細胞所占比例。從圖5與圖7可以看出，與VSV-G孵育后，Ad293與HeLa細胞紅色數(shù)量顯著增加;從圖6與圖8可以看出，Ad293紅色數(shù)量占細胞總數(shù)的比例增加約10%，He La紅色細胞數(shù)量占細胞總數(shù)的比例提升約I倍。上述實驗結果表明，表達VSV-G的重組畢赤酵母裂解液能夠有效提高哺乳動物細胞DNA轉染效率。
[0029]以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發(fā)明之權利范圍，因此依本發(fā)明權利要求所作的等同變化，仍屬本發(fā)明所涵蓋的范圍。
【主權項】
1.一種可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌，其特征在于，具有畢赤酵母菌KM71的形態(tài)、遺傳和生理生化特征，且通過發(fā)酵能夠表達VSV-G。2.根據(jù)權利要求1所述可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌，其特征在于，所述VSV-G以生物活性的方式存在于所述畢赤酵母菌KM71的裂解液中。3.根據(jù)權利要求2所述可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌的制備方法，其特征在于，主要包括以下步驟: (I)采用PCR反應從質粒pLP/VSV-G中克隆VSV-G基因片段； (2 )回收步驟(I)所得VSV-G基因片段，并將所述VSV-G基因片段與pGM-T載體進行T-A連接，轉化入大腸桿菌Top 10,擴增培養(yǎng)，酶切檢測并測序，得到重組質粒pGM-T-VSV-G，以獲得EcoR頂每切位點； (3)利用EcoRI對步驟(2)所得pGM-T-VSV-G酶切后得到VSV-G片段，連入表達載體PPIC3.5K，轉化入大腸桿菌Top 10，擴增培養(yǎng)，酶切檢測并測序，得到重組表達載體PPIC3.5K-VSV-G； (4)將步驟(3)所得重組表達載體pPIC3.5K-VSV-G通過電轉化法轉化畢赤酵母KM71，利用組氨酸缺陷平板、遺傳霉素平板及PCR篩選，以陽性重組子； (5)取步驟(4)所得陽性重組子接種于BMGY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24h，再轉入BMMY培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)96 h，離心收集菌體并用酸性玻璃珠裂解，再利用Western Blot檢測蛋白表達情況，確認VSV-G蛋白的表達。4.根據(jù)權利要求3所述制備方法，其特征在于，所述PCR反應的引物和反應條件如下:引物 I (F ): 5 ’ -CCATGGCCTGTTGCTC CACCAGCTT-3 ’引物2 (R): 5 ’ -AAGCTTTCAGCAGTGGCTCACAGCAG-3 ’ 反應條件為:94°C預變性3 min;94°C解旋30 s，59.5°C I min，60°C延伸30 s，30個循環(huán);72°C保溫 10 min。5.根據(jù)權利要求3所述制備方法，其特征在于，步驟(5)所述BMMY培養(yǎng)基中含有1%甲醇；所述誘導培養(yǎng)過程時每隔24 h補加甲醇一次。6.一種根據(jù)權利要求2所述可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌的裂解液，其特征在于，能夠促進哺乳動物細胞DNA轉染。7.根據(jù)權利要求6所述裂解液的制備方法，其特征在于，主要包括:將誘導后的可表達VSV-G的重組畢赤酵母菌重懸于含有I mM PMSF的I3BS中，加入等體積酸洗玻璃珠后，將混合物劇烈渦旋震蕩I min，立即置于冰上I min;重復多次后混合物在4°C下離心收集上清，再用0.22μηι濾膜過濾。8.根據(jù)權利要求6所述裂解液的應用，其特征在于，用于介導DNA轉染。
【文檔編號】C12N15/81GK106047739SQ201610488661
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】魏熾炬, 王靖荃, 董瑩, 劉鑫, 李龍
【申請人】汕頭大學