一種利用精氨酸標記細菌的silac培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用【專利摘要】本發(fā)明公開一種利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用。該培養(yǎng)基包括無機鹽、碳源、氮源、脯氨酸和重穩(wěn)定同位素標記精氨酸。該培養(yǎng)基還包括甘、丙、纈、亮、異亮、苯丙、脯、色、絲、酪、半胱、蛋、蘇、天冬、谷、賴、組等氨酸以及天冬酰胺、谷氨酰胺。本發(fā)明使用脯氨酸，阻止重穩(wěn)定同位素標記精氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸，從而提高蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量和定量準確性；而添加了其他19種常見的氨基酸讓該培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分齊全，使該培養(yǎng)基適用于多種細菌，細菌在該培養(yǎng)基中生長速度快，標記速度快，1～3代可以完成標記；并且使SILAC技術(shù)用于細菌蛋白質(zhì)組中操作簡單、重復性好等?！緦＠f明】-種利用精氨酸標巧細菌的sILAC培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明設(shè)及一種培養(yǎng)基，特別設(shè)及一種利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]細菌是自然界中種類和數(shù)量眾多的群體。它與人類活動息息相關(guān)，有許多細菌是致病的，甚至能致命，相反也有許多細菌是有益的，特別是許多工程菌服務(wù)于人類，同時在人體的消化道中也有許多益生菌有助于人類健康。自人類基因組計劃完成后，許多細菌如大腸桿菌等，其基因組也紛紛被測序解讀，運也就為蛋白質(zhì)組學的發(fā)展提供了契機。蛋白質(zhì)組學能W-個細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)來解讀生命現(xiàn)象，運為尋找藥物祀點，生物標簽W及了解微生物提供了有效的手段。[0003]如上所述的蛋白質(zhì)組學研究方法中，早期用于研究細菌蛋白質(zhì)組學的是雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定。然而，雙向電泳有諸多局限，如蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量少，實驗程序繁瑣，疏漏了分子量較大、分子量較小W及極端等電點蛋白質(zhì)，還疏漏了許多疏水性蛋白質(zhì)。而在細菌中，疏水的膜蛋白質(zhì)占有很大的比重，因此雙向電泳技術(shù)損失了很多蛋白質(zhì)的信息。WiTRAQ為代表的化學標記W及非標記定量也可W用于細菌蛋白質(zhì)的定量。其中iTRAQ高效的標記樣品中的膚段，而不受制約蛋白本身的理化性質(zhì)，然而iTRAQ試劑盒昂貴，而且在標記前分別處理樣品，特別是對下游進一步做膚段進行富集的實驗，容易引入隨機誤差。但是與代謝標記和非標記定量技術(shù)相比，化學標記的膚段鑒定數(shù)量較少。非標記定量對樣品的要求低，但是對質(zhì)譜要求較高，而且多維度預分離導致了更差的再現(xiàn)性，因此由于實驗的可重復性差種種原因限制了非標記定量技術(shù)的在蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。[0004]因此，相對而言，代謝標記是比較理想的定量細菌蛋白質(zhì)組學的方法。在細菌的代謝標記中，1?標記雖然已經(jīng)很好的應(yīng)用于細菌中，但是運也同時要求細菌必須能生長在只W無機1?為氮源的能自身合成氨基酸等各種含氮產(chǎn)物的微生物中，然而許多的微生物為氨基酸或者維生素營養(yǎng)缺陷型，也就導致了細菌無法生長在運些只W無機錠鹽為氮源的培養(yǎng)基中。同時，1?標記對捜索引擎提出了強大的挑戰(zhàn)。另外一種代謝標記技術(shù)-SILAC(Stableisotopelabelingbyaminoacidincellculture,細胞穩(wěn)定同位素標記技術(shù))有蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量多，定量準確，容易操作，W及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。然而SILAC在細菌蛋白組學中的應(yīng)用卻寥寥無幾，并且通常要求細菌為營養(yǎng)缺陷株。Soufi，B.等人（Stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture(SILAC)appliedtoquantitativeproteomicsofBacillussubtilis.Journalofproteomeresearch9,3638-3646)提供了一種利用賴氨酸標記枯草芽抱桿菌的方法，同時用該方法進行了枯草芽抱桿菌的蛋白質(zhì)組研究，在該方法中，為了能夠保證重穩(wěn)定同位素標記賴氨酸的標記效率，上述方法的實驗者將枯草芽抱桿菌中的賴氨酸合成酶基因敲除。徐平等人(一種利用SILAC標記大腸桿菌蛋白質(zhì)組的方法及其專用培養(yǎng)基（CN201210276080.4)W及論文：如anti化tiveproteomicsreve曰Issignific曰ntch曰ngesincellsh曰pe曰nd曰nenergyshift曰fterIPTGinductionviaanoptimizedSILACapproachforEscherichiacoli.Journalofproteomeresearch12,5978-5988)提供了一種利用重穩(wěn)定同位素標記賴氨酸標記大腸桿菌的SILAC培養(yǎng)基。FrohlichF等人（NativeSILAC:me1:aboliclabelingofproteinsinprototrophmicroorganismsbasedonlysinesynthesisregulation.Molecularfecellularp;roteomics:MCP12,1995-2005)提供了一種利用重穩(wěn)定同位素標記賴氨酸標記酵母菌的方法。[0005]由W上已經(jīng)發(fā)表的專利和論文，可W看出目前SILAC技術(shù)在細菌等微生物中應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)中，均只能實現(xiàn)單個賴氨酸標記，甚至需要敲除賴氨酸合成酶的基因。然而，在蛋白質(zhì)組研究的過程中，用于水解蛋白質(zhì)的一般是膜酶，它特異性地識別并且切斷膚段中精氨酸和賴氨酸C末端的膚鍵。因此使用單個賴氨酸標記細菌的SILAC技術(shù)，對C末端W精氨酸結(jié)尾的多膚無法進行定量，因此損失約一半的蛋白質(zhì)定量分析。并且，對于某些含賴氨酸低或者不含有賴氨酸的蛋白質(zhì)無法，最終容易導致定量結(jié)果不準確。[0006]SILAC應(yīng)用于哺乳動物細胞中時，均實現(xiàn)了賴氨酸和精氨酸的雙標記。由于如下細菌自身的原因，導致精氨酸標記一直無法在細菌中實現(xiàn)。一是由于許多細菌為氨基酸自養(yǎng)型生物，能夠合成自身所需要的氨基酸。若該細菌能夠合成精氨酸而不利用環(huán)境中提供的重穩(wěn)定同位素標記的精氨酸，則導致重穩(wěn)定同位素標記的精氨酸的標記效率低，而無法實現(xiàn)雙氨基酸標記。二是由于許多細菌，如枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌、啤酒酵母構(gòu)巢曲霉和粗糖鏈抱菌、金黃色葡萄球菌，都能夠利用精氨酸合成脯氨酸。如果重穩(wěn)定同位素標記精氨酸能夠標記細菌蛋白質(zhì)，那么當細菌利用重穩(wěn)定同位素標記精氨酸合成脯氨酸時，蛋白質(zhì)中的脯氨酸將同時或分別含有重穩(wěn)定同位素1?和i5N:若精氨酸為kArginine-i3C6i5N4時，則轉(zhuǎn)化為kProlineUCsi^i;若精氨酸為kArginine-UCs，則轉(zhuǎn)化為心?'〇1ineUCs。含有重穩(wěn)定同位素的脯氨酸將改變多膚的質(zhì)量，改變多膚的質(zhì)荷比，導致該多膚無法被鑒定到，最終導致蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量的減少和蛋白質(zhì)定量的誤差增大。甚至，由于氨基酸通過=簇酸循環(huán)能夠用于合成其代謝所需要的物質(zhì)，若重穩(wěn)定同位素標記精氨酸或者賴氨酸通過=簇酸循環(huán)而合成其他物質(zhì)，將導致鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量更加少，定量更加不準確。[0007]基于W上運些原因，導致了SILAC用于細菌中時只能使用單個氨基酸，即賴氨酸作為標記氨基酸。因此，要實現(xiàn)穩(wěn)定同位素標記精氨酸用于細菌的蛋白質(zhì)組學研究中，必須要解決細菌自身合成氨基酸W及重穩(wěn)定同位素標記氨基酸轉(zhuǎn)化成其他氨基酸的問題?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明首要的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基。通過向該培養(yǎng)基添加了脯氨酸，抑制了重鏈同位素標記精氨酸轉(zhuǎn)化成脯氨酸，促使精氨酸也可W作為標記氨基酸應(yīng)用于細菌的SILAC標記中。[0009]-種利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，包括無機鹽、碳源、氮源，還包括脯氨酸和重穩(wěn)定同位素標記精氨酸。[0010]優(yōu)選地，所述的重穩(wěn)定同位素標記精氨酸為心日巧1'111；[]1日-1化614抓或心日'旨1'；[]1；[]16-1化6柳4。[0011]優(yōu)選地，所述利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基還包括甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸。所述的培養(yǎng)基為限制性培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分相對有限，當細菌生長在其中時，由于培養(yǎng)基中含有充足的重穩(wěn)定同位素標記精氨酸，細菌容易將重穩(wěn)定同位素標記精氨酸進行脫氨基作用，進而使重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的碳骨架進入=簇酸循環(huán)，用于合成其他生命過程所需的物質(zhì)，如合成其他氨基酸。重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的碳骨架含有同位素1叱，當該骨架用于合成其他氨基酸時候會改變氨基酸的分子量，導致在質(zhì)譜儀分析后的質(zhì)核比無法與數(shù)據(jù)庫匹配而造成蛋白質(zhì)鑒定量的減少或定量的錯誤。加入其他氨基酸，能有效的抑制相對應(yīng)氨基酸的生物合成，提高蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量W及提供蛋白質(zhì)定量的準確性。其次是許多細菌為氨基酸缺陷型，或為了需要，需要敲除細菌的某些基因，導致在缺少某種氨基酸的培養(yǎng)基中細菌無法生長，加入各種常見的氨基酸在培養(yǎng)基中能使培養(yǎng)基具有最廣泛的適用性。[0012]優(yōu)選地，在所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述的甘氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的丙氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的鄉(xiāng)氨酸的含量為100~400mg/レ所述的亮氨酸的含量為100~400mg/l;所述的異亮氨酸的含量為100~400mg/l;所述的苯丙氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的色氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的絲氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的酪氨酸的含量為100~400mg/l;所述的半脫氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的蛋氨酸的含量為100~400mg/l;所述的天冬酷胺的含量為100~400mg/L所述的谷氨酷胺的含量為100~40〇111旨/1;所述的蘇氨酸的含量為100~400mg/l;所述的天冬氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的谷氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的組氨酸的含量為100~40〇111旨/1;所述的賴氨酸的含量為100~400mg/l;發(fā)明人經(jīng)過反復的實驗和摸索，最終確定在上述各種氨基酸在該濃度范圍內(nèi)既能夠有效的抑制相應(yīng)氨基酸的生物合成，又不會造成細菌通過自身代謝途徑合成精氨酸，而導致重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的標記效率不合格。同時，細菌還能在該培養(yǎng)基中快速的生長。[0013]作為優(yōu)選地，所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基中，還包括巧樣酸、硫胺素、尼克酸、泛酸、生物素、Tris堿。添加上述物質(zhì)能夠使細菌更好地生長。自然界中或者為了某些需要會造成許多細菌為維生素的營養(yǎng)缺陷型或某些特定物質(zhì)的營養(yǎng)缺陷型，增加巧樣酸、硫胺素、尼克酸、泛酸、生物素能夠增加所述SILAC培養(yǎng)基的適用性。Tris堿溶液是良好的緩沖液，配合HC1使用可W配置所需的抑，使培養(yǎng)基更適合多種不同細菌的生長。[0014]優(yōu)選地，所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述無機鹽為氯化巧、氯化鐘、氯化鋼、硫酸儀、憐酸二氨鐘、硫酸儘、硫酸亞鐵;所述碳源為葡萄糖;所述氮源為無機氮源，更優(yōu)選為硫酸錠。發(fā)明人經(jīng)過反復實驗，在盡量兼顧多種細菌生長的前提下，挑選了上述各種無機鹽，有利于細菌在本發(fā)明所提供的SILAC培養(yǎng)基中生長狀態(tài)更好。[0015]優(yōu)選地，所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述脯氨酸的濃度為200~400mg/L。發(fā)明人經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，當脯氨酸低于200mg/L時，并不能完全的抑制重穩(wěn)定同位素標記精氨酸轉(zhuǎn)化成脯氨酸，而過高的濃度的脯氨酸會造成浪費。[0016]優(yōu)選地，所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的濃度為30~400mg/l;優(yōu)選為100~400mg/l;更優(yōu)選為200~400mg/L。當重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的濃度低于30mg/L時，許多細菌會生長緩慢，如金黃色葡萄球菌，甚至會導致標記效率過低而無法用于定量蛋白質(zhì)。其次重穩(wěn)定同位素標記精氨酸價格相當昂貴，過高的濃度會造成極大的浪費。[0017]優(yōu)選地，所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述氯化巧的濃度為16.58mg/L，所述氯化鐘的濃度為3000mg/L，所述氯化鋼的濃度為9500mg/L，所述硫酸儀的濃度為633mg/L，所述憐酸二氨鐘的濃度為140mg/L，所述硫酸儘?此0的濃度lOmg/L，所述巧樣酸的濃度為6mg/L，所述硫胺素的濃度為2mg/L，所述尼克酸的濃度為2mg/L，所述泛酸的濃度為2mg/L，所述生物素的濃度為2mg/L，所述硫酸亞鐵?7此0的濃度為6mg/L，所述硫酸錠的濃度為4000mg/L，所述葡萄糖的濃度為5000mg/L，所述化is-base(化is堿)的濃度為12100mg/l;所述甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸氨酸、組氨酸、脯氨酸、重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的濃度均為200mg/L。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，在兼顧細菌生長速度，標記效率，氨基酸的相互轉(zhuǎn)化各方面的問題的前提下，確定了SILAC培養(yǎng)基中各個組分的最優(yōu)濃度，在上述條件下，細菌能夠快速的生長；同時能夠兼顧多種細菌的生長，能有效的防止氨基酸的相互轉(zhuǎn)化，并且獲得合格的，即大于等于95%的重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的標記效率。[0018]優(yōu)選地，所述利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基中，所述的細菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、銅綠假單胞桿菌和鮑曼不動桿菌中的至少一種。上述細菌中包含了革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌，且上述多種細菌均為常見的模式生物，上述細菌能夠被標記表明所述的SILAC培養(yǎng)基具有最廣泛的適用性。[0019]本發(fā)明所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，在標記細菌蛋白質(zhì)組中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。用本發(fā)明所述的SILAC培養(yǎng)基進行標記細菌進而獲得細菌的定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，具有操作簡單，所需時間短，定量準確率高，鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量多，重復性好的優(yōu)點。[0020]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：[0021]在研究的過程，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，添加到培養(yǎng)基中的重穩(wěn)定同位素標記的氨基酸的標記效率會隨著添加的氨基酸濃度的升高而提高;發(fā)明人猜想細菌會優(yōu)先利用培養(yǎng)基中的氨基酸而抑制其自身相應(yīng)氨基酸的合成，從而使重穩(wěn)定同位素標記精氨酸在膚段中的占有率足夠高，即保證足夠高的標記效率。而且細菌在運種添加了豐富氨基酸的培養(yǎng)基中生長速度快，同時標記效率也高。[0022]本發(fā)明通過向培養(yǎng)基中添加脯氨酸，阻止了重穩(wěn)定同位素標記精氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸，促使重穩(wěn)定同位素標記精氨酸應(yīng)用于標記細菌蛋白質(zhì)組，因此提高了蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量和定量準確性；同時在培養(yǎng)基中添加了其他19種常見的氨基酸讓該培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分齊全，使得本發(fā)明所提供的SILAC培養(yǎng)基適用于多種細菌，細菌在該培養(yǎng)基中生長速度快，標記速度快，1~3代可W完成標記;并且使SILAC技術(shù)用于細菌蛋白質(zhì)組中操作簡單、重復性好等?！靖綀D說明】[0023]圖1為實施例1的蛋白質(zhì)定量相關(guān)性分析圖。【具體實施方式】[0024]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。[00巧]實施例一[0026]1、制備不同配比的SILAC培養(yǎng)基[0027](1)培養(yǎng)基A，具體成分和含量如表1所示:溶劑為水。[002引棄1[0029][0030][0031]所述重穩(wěn)定同位素標記精氨酸為L-a巧rinine-UC6i4N4。[0032](2)培養(yǎng)基B:與培養(yǎng)基A的區(qū)別僅在于培養(yǎng)基B還包括表2中的各組分;且所述重穩(wěn)定同位素標記精氨酸為心曰巧!'inine-UC6i5N4，濃度為30mg/l;[0033]表2[0034][0035](3)培養(yǎng)基C:與培養(yǎng)基B的區(qū)別僅在于重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的濃度為lOOmg/L。[0036](4)培養(yǎng)基D:與培養(yǎng)基B的區(qū)別僅在于重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的濃度為200mg/L。[0037](5)培養(yǎng)基E:與培養(yǎng)基B的區(qū)別僅在于重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的濃度為300mg/L。[0038](6)培養(yǎng)基F:與培養(yǎng)基B的區(qū)別僅在于重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的濃度為400mg/L。[0039](7)培養(yǎng)基G:培養(yǎng)基D的區(qū)別僅在于所述甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸的濃度均為1OOmg/L。[0040](8)培養(yǎng)基H:培養(yǎng)基D的區(qū)別僅在于所述甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、蛋氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸的濃度均為400mg/L。[0041](9)培養(yǎng)基I:與培養(yǎng)基D的區(qū)別僅在于不含有脯氨酸。[0042](10)培養(yǎng)基J:與培養(yǎng)基D的區(qū)別僅在于脯氨酸濃度為lOOmg/L。[0043](11)培養(yǎng)基K:與培養(yǎng)基D的區(qū)別僅在于脯氨酸濃度為400mg/L。[0044]2、培養(yǎng)基A~哺勺標記細菌的效果檢測。[0045]將每種培養(yǎng)基分別用于培養(yǎng)大腸桿菌(BW25113,中國微生物菌種保藏中屯、）、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、枯草芽抱桿菌(美國168)、銅綠假單胞桿菌(ATCC9027)、鮑曼不動桿菌(ATCC19606)，于37°C、220巧m搖床培養(yǎng)獲細菌。按文獻"Soufi，B.，Kumar，C.，Gnad,F.,Mann,M.,Mijakovic,I.,andMacek,B.(2010)Stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture(SILAC)appliedtoquantitativeproteomicsofBacillussubtilis.Journalofproteomeresearch9,3638-3646"操作，提取并且用膜酶水解細菌蛋白質(zhì)獲得多膚;將多膚用液相串聯(lián)質(zhì)譜儀分析后，用Max如ant進行捜索，在捜索結(jié)果中的"peptide.txt"文件中，根據(jù)捜索結(jié)果中含有重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的多膚與含有非重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的多膚的比值，即重鏈與輕鏈的比值，計算得出含有重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的多膚的占有率，即標記效率。結(jié)果如表3所示。本實施例所用菌株從美國菌種保藏中屯、或中國微生物菌種保藏中屯、購買獲得。[0046]表3、各種細菌的重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的標記效率（％)[0047][0([0049]表3中表示沒有此數(shù)據(jù)。[(K)加]3、培養(yǎng)基D、I、J、K的效果檢測。[0化1]將金黃色葡萄球菌(ATCC29213)分別培養(yǎng)于培養(yǎng)基D、I、J、K，獲得細菌，提取細菌蛋白質(zhì)，再用膜酶將蛋白質(zhì)進行水解；所得多膚用液相串聯(lián)質(zhì)譜儀分析；將所得數(shù)據(jù)用MaxQuant進行捜索，選擇參數(shù)時，在可變修飾項目中選擇"Pro6"。在捜索結(jié)果中，計算"msms.txt"文件中Pro6占全部脯氨酸的比例;結(jié)果如下表4所示;所述Pro6為細菌W重穩(wěn)定同位素標記精氨酸化-argrinine-UC6i5N4)為原料合成的帶有重穩(wěn)定同位素的脯氨酸化-Proline口C日1日化）。[0052]表4、細菌蛋白質(zhì)中Pro6占所有脯氨酸的比例（％)[0化3][0054]由于Pro6的存在會導致在捜庫時B、Y離子無法與數(shù)據(jù)庫匹配，或者形成錯配，導致蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量的減少和造成定量不準確。如上表所示，本發(fā)明在在培養(yǎng)基中添加了脯氨酸后，能有效的抑制金黃色葡萄球菌利用精氨酸合成脯氨酸。當培養(yǎng)基中的脯氨酸濃度達到200111旨/1時，即培養(yǎng)基0，？'〇6的含量會降至2.31%，約等于背景水平。如此，有利于提高準確鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量和提高蛋白質(zhì)定量信息的準確性，同時也促使了SILAC用于細菌中可W實現(xiàn)用精氨酸作為標記氨基酸，為雙標記SILAC技術(shù)應(yīng)用于細菌提供了保證。[0化5]4、定量蛋白質(zhì)組可重復性檢測。[0化6]取所配制的SILAC培養(yǎng)基D于37°C、220rpm搖床培養(yǎng)金黃色葡萄球菌ATCC29213,并且加入環(huán)丙沙星(CPFX)至濃度為0.化g/L。同時，在相應(yīng)的輕鏈培養(yǎng)基（即用相應(yīng)的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基中的同位素氨基酸換成非同位素標記氨基酸)培養(yǎng)金黃色葡萄球菌ATCC29213作為對照。將被穩(wěn)定同位素標記的和非標記的細菌等量混合進行定量蛋白質(zhì)組分析，實驗進行生物學重復兩次，對同一蛋白質(zhì)的兩次變化值進行相關(guān)性分析，求得皮爾遜相關(guān)系數(shù)r=0.9578,具體方法參見（NativeSILAC:metaboliclabelingofproteinsinprototrophmicroorganismsbasedonlysinesynthesisregulation.Molecular&cellularproteomics:MCP12,1995-2005)，實驗重復結(jié)果一致性好，結(jié)果如圖1所示。該結(jié)果表明，SILAC技術(shù)用于定量金黃色葡萄球菌差異蛋白質(zhì)組時，具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和高的重復性。[0057]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)?！局鳈?quán)項】1.一種利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，包括無機鹽、碳源、氮源，其特征在于:還包括脯氨酸和重穩(wěn)定同位素標記精氨酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:還包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于：所述的甘氨酸的含量為100~400mg/L;所述的丙氨酸的含量為100~400mg/L;所述的纈氨酸的含量為100~400mg/L;所述的亮氨酸的含量為100~400mg/L;所述的異亮氨酸的含量為100~400mg/L;所述的苯丙氨酸的含量為100~400mg/L;所述的色氨酸的含量為100~400mg/L;所述的絲氨酸的含量為100~400mg/L;所述的酪氨酸的含量為100~400mg/L;所述的半胱氨酸的含量為100~400mg/L;所述的蛋氨酸的含量為100~400mg/L;所述的天冬酰胺的含量為100~400mg/L;所述的谷氨酰胺的含量為100~400mg/L;所述的蘇氨酸的含量為100~400mg/L;所述的天冬氨酸的含量為100~400mg/L;所述的谷氨酸的含量為100~400mg/L;所述的組氨酸的含量為100~400mg/L;所述的賴氨酸的含量為100~400mg/L。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:還包括檸檬酸、硫胺素、尼克酸、泛酸、生物素、Tris堿。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:所述無機鹽為氯化鈣、氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸亞鐵;所述碳源為葡萄糖；所述氮源為硫酸銨。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:所述脯氨酸的濃度為200~400mg/L。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:所述重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的濃度為30~400mg/L。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:所述氯化鈣的濃度為16.58mg/L，所述氯化鉀的濃度為3000mg/L，所述氯化鈉的濃度為9500mg/L，所述硫酸鎂的濃度為633mg/L，所述磷酸二氫鉀的濃度為140mg/L，所述硫酸錳·H20的濃度10mg/L，所述梓檬酸的濃度為6mg/L，所述硫胺素的濃度為2mg/L，所述尼克酸的濃度為2mg/L，所述泛酸的濃度為2mg/L，所述生物素的濃度為2mg/L，所述硫酸亞鐵·7H20的濃度為6mg/L，所述硫酸銨的濃度為4000mg/L，所述葡萄糖的濃度為5000mg/L，所述Tris-base的濃度為12100mg/L;所述甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸氨酸、組氨酸、脯氨酸、重穩(wěn)定同位素標記精氨酸的濃度均為200mg/L。9.根據(jù)權(quán)利要求1~8任一項所述利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基，其特征在于:所述的細菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞桿菌和鮑曼不動桿菌中的至少一種。10.權(quán)利要求1~8任意一項所述的利用精氨酸標記細菌的SILAC培養(yǎng)基在標記細菌蛋白質(zhì)組中的應(yīng)用?！疚臋n編號】C12R1/125GK106047752SQ201610391015【公開日】2016年10月26日【申請日】2016年6月2日【發(fā)明人】孫雪松,韓俊隆,易淑紅【申請人】暨南大學