鰻弧菌o3血清型菌株及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株鰻弧菌O3血清型菌株及其應(yīng)用方法，該菌分離自大菱鲆魚體內(nèi)，是一株具有較強(qiáng)毒力的野生菌株，其保藏號(hào)為：CCTCC M 2016261。該菌的抗原制備方法包括滅活菌體、菌蛻成分、減毒菌株、抗原亞單位、抗原基因表達(dá)產(chǎn)物的任何一種或一種以上；生產(chǎn)的疫苗可以是使用該菌株制備的抗原的單一成分，也可以是使用該菌株制備的抗原與其他細(xì)菌的抗原混合生產(chǎn)聯(lián)合疫苗，也可以將制備的單一或聯(lián)合疫苗的抗原加佐劑生產(chǎn)疫苗；疫苗應(yīng)用中疫苗的接種方式可以采用注射免疫、浸浴免疫或口服免疫。CCTCC NO:M201626120160516
【專利說明】
魚曼弧菌03血清型菌株及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及水產(chǎn)微生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株媛弧菌（Vibrio anguillar皿)03血清型菌株SMP3及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 媛弧菌（V;Lb;rio anguillarum)也稱媛利斯頓氏菌(Xistonella anguillarum)，是 有鞭毛的革蘭氏陰性彎曲短桿狀細(xì)菌，生長需要鹽，無芙膜，不形成芽抱，兼性厭氧，屬于弧 菌科弧菌屬成員。媛弧菌對(duì)多種海水和淡水魚類有致病性，引起魚類的出血性敗血癥，在世 界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。已報(bào)道可感染的魚類有：娃魚（Salmo salar L)、虹縛 (Oncorhynchus mykiss,Walbaum)、大菱魚平（Scophthalmus maximus和Psetta maxima)、海 食盧（Sparus aurata L)、真觸（Sparus aurata)、大西洋轄魚（Gadus morhua)、歐洲島曼 (Anguilla angu i 1 la)、香魚（P1 ecogl os sus a 11 i ve 1 i s )、牙魚平（Para 1 i chthy s olivaceus)、半滑舌錦（Cynoglossus semilaevis Gunther)、大黃魚（Pseudosciaena crocea)、絲足魚（Trichogaster trichopterus)、斑馬魚（Danio rerio)等。該菌也有感染 雙殼貝類(扇貝，牡頗)和甲殼類（中國對(duì)郵）的報(bào)道。W往采用抗生素和化學(xué)藥物等進(jìn)行預(yù) 防和治療水產(chǎn)細(xì)菌病害，諸多問題已經(jīng)出現(xiàn)，如病原的耐藥性、藥物殘留、食品安全及環(huán)境 污染等問題。近年來，采用疫苗免疫進(jìn)行病害控制已被許多國家認(rèn)可。
[0003] 媛弧菌的血清型分型主要依據(jù)菌體0抗原的凝集反應(yīng)特征，各國學(xué)者針對(duì)對(duì)分離 自不同魚類、不同地理位置的媛弧菌菌株進(jìn)行了血清分型研究。Pacha(1969)等人將分離自 美國太平洋西北娃魚的13株媛弧菌分為巧巾血清型;Kitao(1983)等人將分離自日本香魚、 島曼綱、虹縛的267株媛弧菌分為6種血清型(A，B，C，D，E，F(xiàn))，分析結(jié)果表明有243株屬于A型， 均為非致病性菌株；S0rensen (1986)將來自挪威、丹麥、法國、瑞典、西班牙、英國、意大 利、德國、美國、加拿大、日本的495株媛弧菌菌株分為10種血清型(01-010)，其中有270株菌 分離自野生和養(yǎng)殖魚，189株分離自環(huán)境，36株分離自無脊椎動(dòng)物;Pedersen (1999)等人結(jié) 合菌體姆亢原和LPS圖譜的特征，在S0rensen等人研究的基礎(chǔ)上將媛弧菌血清型拓展到23 種(01-023)，因而目前普遍認(rèn)為媛弧菌的血清型至少有23種，對(duì)魚類有致病性的媛弧菌通 常為01、02和部分03血清型菌株。Tiainen( 1997)等人進(jìn)一步結(jié)合0抗原凝集和WS圖譜的分 析結(jié)果，對(duì)129株02血清型菌株進(jìn)行亞型分型，將其中86%的菌株定為0姑亞型，將12%的菌 株定為02b亞型，有2%的菌株未能定到亞型，說明還可能存在新的亞型。從海水、底泥和植 物表面通常分離到04-023血清型菌株，它們是非致病性的環(huán)境菌株。
[0004] 上世紀(jì)八十年代W來，國內(nèi)外就開展了許多媛弧菌疫苗的研究工作，在國際市場(chǎng) 上有多種商品化疫苗用于預(yù)防媛弧菌病，如MICR0ViB，ALPHA MARI肥?Vibrio，AquaVacii V;Lb;rio，N〇rva￡'Vib:riose Marine,運(yùn)些疫苗均是為W媛弧菌01和02血清型菌株為抗原組 分的滅活二價(jià)疫苗，主要用于娃魚、虹縛、驢魚、轄魚、觸、慘、黃飾的養(yǎng)殖，對(duì)預(yù)防媛弧菌病 具有極好的免疫保護(hù)效果。媛弧菌疫苗的研究也在國內(nèi)廣泛開展，不同研究者采用各自分 離的媛弧菌菌株研制疫苗，其中一些成果已形成專利。如國斌倫等（2010)的發(fā)明 (201010290119.9)公開了 1種媛弧菌滅活疫苗的制備方法及其在半滑舌錦的應(yīng)用；莫照蘭 等(2016)的發(fā)明專利(C201310165116.6)公開了一種媛弧菌01血清型滅活疫苗和一種媛弧 菌二價(jià)滅活疫苗；馬悅等（2003)的發(fā)明（200310109025.7)和孫黎（2012)等的發(fā)明 (201210292485.7)各自公開了巧巾媛弧菌減毒疫苗及其應(yīng)用。文獻(xiàn)報(bào)道中，有研究者進(jìn)行了 媛弧菌疫苗的初步應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，如肖慧等人(2003)?分離自發(fā)病驢魚的1株媛弧菌W-1制備滅 活菌苗，分別浸泡免疫驢魚苗和注射成魚，經(jīng)疫苗浸泡免疫4周后的驢魚苗免疫保護(hù)力達(dá) 64.7 %，90d后同批次的驢魚再注射免疫，其免疫保護(hù)力(RPS)為78.9 %，血清中抗體凝集效 價(jià)為1:192;僅進(jìn)行注射免疫組，其免疫保護(hù)力為57.9%，血清中抗體凝集效價(jià)為1:224。肖 鵬等人(2007)?兩株媛弧菌為抗原制備了油乳化二價(jià)疫苗，通過巧料包埋后連續(xù)7天口服 免疫大菱解魚，在停止免疫后的第1天，在免疫魚后腸即可檢測(cè)到顯著提高的溶菌酶和抗蛋 白酶活性W及抗體水平，通過原位雜交在免疫魚后腸粘膜皺權(quán)內(nèi)檢測(cè)到IgM抗體，在免疫魚 血清也檢測(cè)到顯著提高的抗體水平，說明該口服疫苗不僅能夠有效刺激大菱解產(chǎn)生非特異 性和特異性反應(yīng)，還能誘導(dǎo)局部和系統(tǒng)免疫反應(yīng)，免疫魚對(duì)M3和SMP1的感染分別獲得100% 和50%的免疫保護(hù)率，而未乳化疫苗獲得的免疫保護(hù)率分別為57.9%和0%。
[0005]國際市場(chǎng)上商品化的媛弧菌疫苗W及部分設(shè)及媛弧菌疫苗的公開專利多是W01 和02血清型菌株制備的單價(jià)或二價(jià)疫苗，國內(nèi)的公開專利W及文獻(xiàn)報(bào)道未設(shè)及媛弧菌疫苗 03血清型疫苗的研制和應(yīng)用。根據(jù)疫苗的特異性免疫保護(hù)作用，由不同血清型病原引起的 疾病用相應(yīng)血清型抗原制備的疫苗能夠提供較高效的免疫保護(hù)。因此有針對(duì)性地選擇流行 性的臨床菌株用于疫苗開發(fā)是研究人員的共同意識(shí)。趙魯寧等人(2015)的研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)海 水養(yǎng)殖魚類和養(yǎng)殖環(huán)境中的流行性媛弧菌有01、02、03血清型，為開發(fā)有針對(duì)性的疫苗用于 疾病的防治奠定提供了依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一株媛弧菌(Vibrio anguilla;rum)03血清型菌株SMP3及其 應(yīng)用。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[000引一種媛弧菌菌株，媛弧菌菌株SMP3,其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，地址為中 國武漢市武昌塔挪山，保藏日為2016年5月16日，保藏編號(hào)為:CCTCC M 2016261。
[0009] 所述菌株是分離自海水養(yǎng)殖魚類的野生媛弧菌菌株SMP3，其0抗原血清型為03血 清型。
[0010] 所述菌株的16sRNA、toxR、recA基因部分核酸序列如沈Q ID No:l、SEQ ID No:2、 沈Q ID No :3所示。
[0011] 所述菌株對(duì)海淡水魚類具有較強(qiáng)的致病性，注射攻毒的半數(shù)致死劑量為3. OX 1〇4-7.6X1〇5cFU/尾。
[0012] 該菌株可培養(yǎng)于TSB、LB、2216E或TCBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法如下：從保存的菌種中挑 取少量劃線于上述培養(yǎng)基的瓊脂平板，培養(yǎng)溫度為25-3(TC，在TSB和LB瓊脂平板中，培養(yǎng) 24h后可形成直徑小于2mm的淡黃色、半透明圓形菌落;在2216E瓊脂平板中，培養(yǎng)24h后可形 成直徑小于1mm的乳白色、半透明圓形菌落;在TCBS平板中，培養(yǎng)24h后可形成直徑小于2mm 的黃色、圓形凸起菌落。將單菌落接種于上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中，在25-30°C、120r/min搖瓶 條件下，培養(yǎng)12-1化可獲得該菌株的新鮮菌液。
[0013] 該菌株具有氨節(jié)青霉素抗性，可培養(yǎng)于含有氨節(jié)青霉素濃度范圍為50-150iig/ml 的培養(yǎng)基中。
[0014] -種媛弧菌菌株SMP3在制備媛弧菌疫苗中的應(yīng)用。
[0015] 進(jìn)一步地說，W所述SMP3菌株抗原為成分，制備疫苗或微膠囊包囊疫苗；
[0016] 或W所述SMP3菌株抗原再與其它細(xì)菌抗原混合作為混合抗原，W混合抗原制備聯(lián) 和疫苗或微膠囊包囊聯(lián)和疫苗；
[0017] 或W所述SMP3菌株抗原與佐劑混合制備疫苗；
[0018] 或W所述SMP3菌株抗原與其它細(xì)菌抗原混合作為混合抗原，混合抗原與佐劑混合 制備疫苗。
[0019] 所述SMP3抗原或其它細(xì)菌的抗原通過滅活菌體、菌蟻成分、減毒菌株、抗原亞單 位、抗原基因表達(dá)產(chǎn)物的任何一種或一種W上的方式獲得。
[0020] 其中，其它細(xì)菌抗原通過滅活菌體、菌蟻成分、減毒菌株、抗原亞單位、抗原基因表 達(dá)產(chǎn)物的任何一種或一種W上的方式獲得。
[0021 ]所生產(chǎn)的疫苗可W采用注射免疫、口服免疫、浸泡免疫等免疫接種方式。
[0022] 其免疫接種的動(dòng)物包括多種海水和淡水魚類和其他動(dòng)物水生動(dòng)物，用于預(yù)防免疫 接種的動(dòng)物發(fā)生媛弧菌病。
[0023] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明獲得具有較高毒力的媛弧菌03血清型菌株 SMP3，SMP3滅活菌苗W 108CFU/尾直接注射免疫牙解，對(duì)媛弧菌03血清型感染提供的RPS達(dá) 到lOO%，對(duì)媛弧菌01、02血清型的病原感染提供的RPS在46.7-56.7%，可見該菌株的抗原 包含針對(duì)媛弧菌03血清型的保護(hù)性抗原和針對(duì)媛弧菌01血清型、媛弧菌02血清型的交叉保 護(hù)性抗原，適合制備媛弧菌03血清型的各類疫苗抗原，用SMP3菌株制備的疫苗可通過注射、 浸泡或口服途徑對(duì)媛弧菌03血清型感染具有有效的免疫保護(hù)作用，對(duì)媛弧菌01血清型、島曼 弧菌02血清型的感染有較好的交叉免疫保護(hù)作用，該菌株可用于不同類型疫苗抗原的制備 及其免疫技術(shù)中的應(yīng)用，適合用作疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用，其應(yīng)用所產(chǎn)生的疫苗產(chǎn)品可用于海 水和淡水養(yǎng)殖魚類弧菌病的有效預(yù)防，降低養(yǎng)殖魚類由于病害引起的損失，減少抗生素和 消毒劑等化學(xué)試劑的濫用，防治耐藥菌的產(chǎn)生，減少環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)，提高養(yǎng)殖動(dòng)物和水產(chǎn)品 的安全。
【附圖說明】
[0024] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的媛弧菌SMP3的16SrRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0025] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的媛弧菌SMP3的toxR基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0026] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的媛弧菌SMP3的recA基因的序列系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0027] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的媛弧菌SMP3的h邱基因的克隆和體外表達(dá)圖；其中，圖 4A是hep基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道2為擴(kuò)增得到的hep條帶；圖4B是h邱在大腸桿菌的表達(dá)結(jié) 果，泳道3為未純化的蛋白，泳道4-6為純化的化P蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1:媛弧菌SMP3的分離和培養(yǎng)
[0029] 取具有典型出血性敗血癥狀的溯死大菱解，用70%酒精棉球?qū)Σ◆~體表進(jìn)行消 毒，剖解取出病魚脾、腎、肝等組織塊放入1ml無菌EP管，加適量無菌生理鹽水后，用研磨小 棒研磨病灶組織，取50-lOOul病灶組織的勻漿液涂布221犯海水瓊脂平板(膜化蛋白腺5g， 酵母浸出膏l(xiāng)g，F(xiàn)eP〇4 O.lg，瓊脂20g，抑7.6-7.8，陳海水定容至化），25°(：培養(yǎng)24-4化，從平 板挑取優(yōu)勢(shì)菌落中的單菌落進(jìn)行2-3次重復(fù)劃線純化，純化后的菌落即為媛弧菌SMP3,保存 于試管斜面或重懸在15-20 %甘油中保存于-80°C冰箱。
[0030] 媛弧菌SMP3在2216E海水瓊脂平板生長24h的菌落直徑小于1mm的乳白色、半透明、 圓形凸起。純化后的菌落可進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化、血清學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定。
[0031] 媛弧菌菌株SMP3可W在LB培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基和TCBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)方法如 下:從保存的菌種中挑取少量劃線于上述培養(yǎng)基的瓊脂平板，培養(yǎng)溫度為25-3(TC，在TSB和 LB瓊脂平板中，培養(yǎng)24h后可形成直徑小于2mm的淡黃色、半透明、圓形凸起的菌落;在TCBS 瓊脂平板中，培養(yǎng)24h后可形成直徑小于2mm的黃色、圓形凸起菌落。將單菌落接種于 20ml2216E海水培養(yǎng)基中，在25-30°C、180rpm振蕩培養(yǎng)12-1化后作為種子液，將種子液轉(zhuǎn)接 于裝有化2216E液體培養(yǎng)基的發(fā)酵灌中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度25-30°C，發(fā)酵液OD540為1.6- 1.別寸終止培養(yǎng)，得到新鮮發(fā)酵菌液。
[0032] 實(shí)施例2:媛弧菌SMP3的生理生化特征和藥敏特征
[0033] 用API ID 3沈細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(法國bioMerieux)和用ATB VET(法國bioMerieux)比 較SMP3和媛弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43307 (03血清型）的生理生化特征和藥敏特征。菌株在TSA培 養(yǎng)24h后，用ATO比濁儀制備濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，分別轉(zhuǎn)接入生化試紙條和藥敏試 紙條，在28°C恒溫培養(yǎng)2地，用ATB? E邱ression?檢測(cè)生化反應(yīng)和藥敏反應(yīng)。生化結(jié)果如表 1所示，在所測(cè)定的32項(xiàng)生理生化反應(yīng)中，SMP3和ATCC43307有22項(xiàng)反應(yīng)特征相同，有10項(xiàng)反 應(yīng)特征有所不同，即在鳥氨酸脫簇酶、精氨酸雙水解酶、e-葡萄糖巧酶、嗎I噪、葡萄糖、L-阿 拉伯糖、a-半乳糖巧酶、e-半乳糖巧酶、5-酬基葡萄糖酸鋼、麥芽糖的反應(yīng)不同，說明SMP3菌 株的生理生化反應(yīng)具有媛弧菌的特征，同時(shí)具有該菌株自有的特征。
[0034] 表1媛弧菌SMP3的API ID 3沈鑒定結(jié)果
[00351
[0036] 藥敏結(jié)果如表2所示，在所檢測(cè)的28項(xiàng)藥物中，SMP3和ATCC43307對(duì)氣甲哇、奧索利 酸、依氣沙星、巧喃妥因、大觀霉素、卡那霉素、慶大霉素、安普霉素等8種抗生素敏感，對(duì)紅 霉素、林可霉素、原始霉素、夫西地酸、甲硝挫、青霉素、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、苯挫 西林、頭抱嚷吩、頭抱贓酬等U種抗生素不敏感，兩株菌的藥物敏感譜表現(xiàn)出該菌特有的遺 傳特征。SMP3對(duì)水產(chǎn)常用抗生素，如利福平、四環(huán)素等存在抗性，表明抗生素的應(yīng)用帶來了 微生物耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0037] 表2媛弧菌SMP3的ATB VET檢測(cè)結(jié)果
[00；3 引
[0039] MIC,最小抑制濃度;R，耐藥;S，敏感
[0040] 實(shí)施例3:媛弧菌菌株SMP3的血清型分析
[0041 ] (1)標(biāo)準(zhǔn)媛弧菌菌株0抗原制備。將5種血清型的媛弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43305(01血 清型）、ATCC43306(02血清型）、ATCC43307(03 血清型）、ATCC43308(04血清型）、ATCC43309 (05血清型）的菌種分別劃線接種到TSA平板，在25-28°C培養(yǎng)2也從每種菌株中挑取單個(gè)菌 落分別培養(yǎng)在5ml TSB培養(yǎng)基中，在28°C、180巧m震蕩培養(yǎng)12-1化后，分別轉(zhuǎn)接100ml TSB， 在25-28°C培養(yǎng)24h，每種培養(yǎng)物在4°C、400化pm離屯、lOmin，收集細(xì)菌，用無菌PBS重懸至~ 108CFU/ml，置100°C水浴2~2.化，即得到5種媛弧菌標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株的0抗原，放4°C冰箱存 儲(chǔ)備用。
[0042] (2)兔抗血清制備。1.5-2kg新西蘭大白兔12只，平均分成6組，每組2只。每種姆亢原 與完全弗氏佐劑等量混合并乳化，制成乳化抗原，在對(duì)應(yīng)組兔子的頸部、背部、后腿的肌肉 和皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射，每只注射取1ml，對(duì)照組W同樣的途徑注射等量的生理鹽水。一免后 兩周進(jìn)行第二次免疫，每種0抗原與不完全弗氏佐劑等量混合并乳化，取0.5ml乳化抗原對(duì) 每只兔子進(jìn)行多點(diǎn)注射，另取不含佐劑的0抗原0.5ml通過耳緣靜脈進(jìn)行緩慢注射，對(duì)照組 W同樣的途徑注射等量的生理鹽水。二免后四周，W二免的程序?qū)γ拷M動(dòng)物進(jìn)行第=次免 疫。=免后二周，對(duì)兔子進(jìn)行采血并制備血清，每種0抗原血清用對(duì)照組血清進(jìn)行吸附處理， 得到5種媛弧菌血清型的兔抗血清。用試管凝集法測(cè)定每種血清的凝集效價(jià)，分裝成小份， 在-80 °C冰箱凍存。
[0043] (3)SMP3的血清型分析。將媛弧菌SMP3和5株媛弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別劃線接種到TSA 培養(yǎng)基，在25-28 °C培養(yǎng)18-2地。將每種血清的濃度稀釋到工作效價(jià)1:560,然后吸取稀釋的 血清15iU，依次置于同一塊干凈玻片上，在同一玻片上設(shè)置15iU PBS為陰性對(duì)照，從TSA培 養(yǎng)基挑取2-3個(gè)媛弧菌菌落分別與玻片上的每種血清和PBS混勻，肉眼觀察l-3min，出現(xiàn)凝 集顆粒的為陽性反應(yīng)，不出現(xiàn)凝集顆粒的為陰性反應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次W上。結(jié)果如表3所 示，每種血清均與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)媛弧菌抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，SMP3抗原與03血清發(fā)生凝集反應(yīng)， 因此SMP3鑒定為03血清型媛弧菌。
[0044] 表3媛弧菌SMP3的血清型鑒定 「nn/i。
[0046] +，陽性反應(yīng);-，陰性反應(yīng)
[0047] 實(shí)施例4:媛弧菌SMP3的16srRNA基因序列擴(kuò)增與分析
[004引（1)模板DNA的制備。將SMP3在TSA劃線培養(yǎng)18-2地，挑取單菌落懸浮到50化無菌雙 蒸水，在100°C進(jìn)行水浴lOmin，在12000g條件下離屯、Imin，將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的無菌EP 管，作為PCR反應(yīng)的DNA模板。
[0049] (2)PCR擴(kuò)增。采用細(xì)菌通用的16srRNA引物（27F/1492R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體 系為：10 X PCR buf f er (Mg2+打ee) 2.5iU，dNTP Mix(每種濃度2.5M) 2.0山，27F( lOmM)0.5iU， 1492R( l〇mM)0.5山，DNA模板1.化1，化9酶（5U/山）0.，無菌雙蒸水18.3iU JCR擴(kuò)增程序 為:94°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán);94°C變性30S，55°C退火45s，72°C延伸905,30個(gè)循環(huán);72°(：延 伸10min，l個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)試劑購自大連寶生物有限公司（Takara，日本），PCR產(chǎn)物用DNA瓊 脂糖膠回收試劑盒(Omega,美國）純化，送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。
[0化0] (3)序列分析。所測(cè)序列去除5'端和3'端20bp的堿基后得到1414bp的堿基序列 (SEQ ID NO: 1)，該序列在GenBank上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示同源性較高的前100個(gè)序列 為弧菌屬細(xì)菌的序列，SMP3的序列與它們的相似性為99~100 %。選取25個(gè)Genbank數(shù)據(jù)庫 中弧菌屬細(xì)菌的16srRNA序列用Cluste巧1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA5.2軟件中的 Nei曲hour-joining程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如附圖1所示，SMP3與16株媛弧菌/媛利斯頓氏菌 和1株病魚弧菌聚為一簇，與媛弧菌PF4(KC579365. 1 )的親緣關(guān)系最近，與Vibrio comi化nts NBRC 102077(AB681689.1)和Vibrio inusitatus NBRC 101082(NR_104031.1) 的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。根據(jù)Blast比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果，SMP3可進(jìn)一步鑒定為媛弧菌。 [0化1 ] 實(shí)施例5:媛弧菌SMP3的toxR基因序列擴(kuò)增與分析
[0052] (1)模板DNA的制備。同實(shí)施例4。
[0化3] (2)PCR 擴(kuò)增。根據(jù)媛弧菌 V.anguillarum775(GenBank:CP002284.1)全基因組序列 設(shè)計(jì)擴(kuò)增toxR的引物序列toxR-F(5 ' -GTGAACGCCCAAATGAAG-3 ' 和toxR-F(5 ' - CACCCGAGAACTCAGAAC-3')〇
[0054] PCR擴(kuò)增體系同實(shí)施例4ePCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán)；94°C變性 30S，53°C退火45s，72°C延伸90S，30個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmina個(gè)循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)實(shí)施 例4相同的步驟，最終獲得序列624bp的堿基序列（SEQ ID N0:2)。
[0055] (3)序列分析。將獲得的序列在GenBank上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示SMP3的序列與 6株媛弧菌的toxR序列有最高相似性，為99%，表明得到的序列為媛弧菌toxR序列。采用實(shí) 施例4的方法，對(duì)SMP3的toxR序列與GenBank的11個(gè)弧菌屬toxR序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建 系統(tǒng)進(jìn)化樹。如附圖2所示，SMP3與6株媛弧菌聚為一簇，與媛弧菌NB10 (LK021130.1)的親緣 關(guān)系最近，與藻膠弧菌al2(AB372534.1)、副溶血弧菌7110(AB300873.1)、坎貝氏弧菌NBRC 1563U冊(cè)318823.1)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。因此媛弧菌SMP3的toxR基因具有其獨(dú)特性。
[0化6] 實(shí)施例6:媛弧菌SMP3的recA基因序列擴(kuò)增與分析
[0057] (1)模板DNA的制備。同實(shí)施例4。
[005引（2)PCR擴(kuò)增。根據(jù)媛弧菌V.angui 1 larum 775(GenBank:CP002284.1)全基因組序 列設(shè)計(jì)擴(kuò)增recA的引物序列recA-F(5 ' -TAATAGAGCCTGTACGACG-3 ' 和recA-F(5 ' - GAGAAAGTAATGGACGAAA-3 '）。
[0059] PCR擴(kuò)增體系同實(shí)施例4ePCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán)；94°C變性 30S，48°C退火45s，72°C延伸90S，30個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmina個(gè)循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)實(shí)施 例4相同的步驟，最終獲得序列658bp的堿基序列（SEQ ID N0:2)。
[0060] (3)序列分析。將獲得的序列在GenBank上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示同源性較高的 前100個(gè)序列為弧菌屬細(xì)菌的序列，其中SMP3的序列與5株媛弧菌的相似性最高，為99%，表 明得到的序列為媛弧菌recA序列。采用實(shí)施例4的方法，對(duì)SMP3的recA序列與GenBank的19 個(gè)弧菌屬recA序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如附圖3所示，SMP3與5株媛弧菌和1 株病海魚弧菌聚為一簇，與媛利斯頓522UF311599.1)的親緣關(guān)系最近，與霍亂弧菌 化42384.1)和牙解弧菌IGJ1.11 (JQ283458.1)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。因此媛弧菌SMP3的recA基 因具有其獨(dú)特性。
[0061 ] 實(shí)施例7:媛弧菌SMP3對(duì)魚類的致病力
[0062] (1)媛弧菌SMP3培養(yǎng)。挑取SMP3單菌落到5ml 2216E培養(yǎng)液中，25-30°C、180巧m振 蕩培養(yǎng)12-1化后，轉(zhuǎn)接到200ml 2216E培養(yǎng)液中，25-30°C、180巧m振蕩培養(yǎng)18-2地，所得培 養(yǎng)液在4°C、5000g條件下離屯、lOmin，收集細(xì)菌，W無菌海水離屯、洗涂細(xì)菌3次，并用無菌海 水重懸細(xì)菌，制成濃度為~l〇9CFU/ml的菌懸液。
[0063] (2)實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)和管理。大菱解體重12±0.4g，牙解體重10.0±0.3g，絲足魚7.0± 0.2g，養(yǎng)殖水溫分別為18 ± 0.3 °C、20.0 ± 0.3 °C、24 ± 0.3 °C，定時(shí)投喂飼料暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)期 間對(duì)魚類健康狀況進(jìn)行檢測(cè)，每種魚隨機(jī)取3-5尾進(jìn)行無菌剖解，取魚的臟器組織進(jìn)行細(xì)菌 分離，確證未檢出細(xì)菌后，暫養(yǎng)魚方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0064] (3)感染實(shí)驗(yàn)。將步驟1制備的SMP3菌懸液用無菌海水進(jìn)行10倍稀釋，根據(jù)魚的種 類和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取合適稀釋度的菌液分別從魚的腹腔肌肉處進(jìn)行注射，注射量為每尾 0.1ml，每個(gè)濃度組注射10尾，對(duì)照組腹腔注射等量PBS。同時(shí)取lOOul各稀釋度的菌懸液涂 布221犯平板，在25-30°C培養(yǎng)24-4化，計(jì)算平板細(xì)菌數(shù)量，用W確定感染濃度。具體的結(jié)果 為:5組大菱解的感染濃度分別1.6 X 1〇4、1.6 X 1〇5、1.6 X 1〇6、1.6 X 1〇7、1.6 X 1〇8cFU/尾;5 組牙解的感染濃度分別2.4 X 1〇4、2.4 X 1〇5、2.4 X 1〇6、2.4 X 1〇7、2.4 X 10化即/尾;4組絲足 魚的感染濃度分別9.5X103、9.5X104、9.5X105、9.5X 1〇6cFU/尾。注射后觀察每組魚的發(fā) 病癥狀和死亡情況。
[0065] (4)統(tǒng)計(jì)與分析。在不同魚的感染實(shí)驗(yàn)中，對(duì)溯死魚的內(nèi)臟進(jìn)行細(xì)菌分離，對(duì)分離 得到的優(yōu)勢(shì)菌落，用玻片凝集試驗(yàn)分析其與兔抗媛弧菌03血清的凝集情況，并隨機(jī)挑取3-5 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行16srRNA序列分析，結(jié)果確定魚類為感染媛弧菌03血清型菌株致死。試驗(yàn)觀 察14天，統(tǒng)計(jì)各組魚的死亡情況，用Reed-Muench(1938)兩氏法計(jì)算SMP3感染不同魚類的半 數(shù)致死量(LDso)。結(jié)果如表4所示，媛弧菌SMP3感染大菱解、牙解、絲足魚的LDso分別為2.5X 1〇5、7.6X1〇5、3.0X1〇4cFU/尾。
[0066] 表4媛弧菌SMP3人工感染魚的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 [00671
[0068]實(shí)施例8:媛弧菌SMP3滅活菌苗的制備
[0069] (1)滅活菌苗制備。取-80°C保存的SMP3在2216E瓊脂培養(yǎng)基中劃線，在25-30°C培 養(yǎng)24-3化獲得單菌落，取單菌落接種于20ml 2216E海水培養(yǎng)基中，在25-30°C、180巧m振蕩 培養(yǎng)12-1化后作為種子液，將種子液轉(zhuǎn)接于裝有化2216E液體培養(yǎng)基的發(fā)酵灌中發(fā)酵培 養(yǎng)，發(fā)酵溫度為25-30°C，發(fā)酵液OD540為1.6-1.別寸終止培養(yǎng)，得到新鮮發(fā)酵菌液;加入福爾 馬林至終濃度為0.5 %，在室溫滅活24-3化;在5000g條件下離屯、15min獲取菌體，用無菌PBS 重懸，制得SMP3滅活菌苗。
[0070] (2)安全性檢驗(yàn)。取SMP3菌苗0.1ml分別接種至221犯瓊脂平板和2216E液體培養(yǎng) 基，在25-30°C培養(yǎng)24-4化，觀察培養(yǎng)基平板和液體均沒有細(xì)菌生長，表明菌苗滅活完全。取 滅活菌苗腹腔注射健康大菱解10尾、健康牙解10尾或健康絲足魚20尾，每尾0.1ml，對(duì)照組 魚注射0.1ml PBS，觀察14天內(nèi)魚的健康與存活情況。與對(duì)照相比，注射菌苗的魚攝食和活 動(dòng)正常，說明菌苗沒有對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成不良反應(yīng)，符合安全要求。
[0071 ]實(shí)施例9:媛弧菌SMP3滅活菌苗在大菱解的應(yīng)用
[0072] 健康大菱解體重16±0.6g，養(yǎng)殖管理同實(shí)施例7。暫養(yǎng)后將大菱解分組進(jìn)行如下免 疫接種：
[0073] (1)注射免疫。將大菱解分為4組，每組60尾。將實(shí)施例8的媛弧菌SMP3滅活菌苗用 PBS制成濃度為107、108、109cells/ml的菌懸液，取各濃度的菌苗W腹腔注射的方式免疫大 菱解，接種量0.1ml/尾，則每組魚的免疫劑量分別106、107、108cel Is/尾，對(duì)照組注射0.1ml 的PBS。免疫后4周，從各免疫組和對(duì)照組大菱解隨機(jī)取30尾，從腹部肌肉途徑注射攻毒 10LD5Q SMP3活菌（2.5 X 10化即/尾）。攻毒后觀察2周，每日統(tǒng)計(jì)大菱解死亡癥狀和死亡數(shù) 量，計(jì)算累積死亡率和相對(duì)免疫保護(hù)率(RPS)。結(jié)果如表5所示，W劑量為106~108cells/尾 的SMP3滅活菌苗注射接種大菱解，可顯著減少媛弧菌感染引起的死亡，為大菱解提供87~ 100%的RPS;WS隨著免疫劑量的增大而提高，劑量為108cells/尾時(shí)，WS達(dá)到100%。
[0074] (2)口服免疫。用0.3%醋酸鹽溶液溶解殼聚糖(購自美國51旨曰111曰-41化1證公司）， 制成濃度為3mg/ml的殼聚糖溶液;將實(shí)施例8制備的SMP3滅活菌苗與殼聚糖溶液等體積混 合，在縱滿混合器上混合化，在12000g、4°C離屯、30min，沉淀WPBS重懸，制成殼聚糖微包囊 菌苗;將殼聚糖微包囊菌苗拌入飼料，制成每g飼料含為l〇6、l〇7、l〇8cells的微包囊口服菌 苗，分組投喂大菱解，各濃度組60尾，對(duì)照組投喂不含菌苗的飼料，連續(xù)投喂7天后轉(zhuǎn)喂不含 菌苗的飼料。停止口服免疫后第4周，從各免疫組和對(duì)照組大菱解隨機(jī)取30尾，從腹部肌肉 途徑注射攻毒lOLDso SMP3活菌(2.5 X 106CFU/尾）。攻毒后觀察2周，每日統(tǒng)計(jì)大菱解死亡癥 狀和死亡數(shù)量，計(jì)算累積死亡率和相對(duì)免疫保護(hù)率RPS。結(jié)果如表5所示，與注射接種途徑比 較，SMP3滅活菌苗的口服接種途徑比注射途徑提供的免疫保護(hù)低，RPS隨著免疫劑量的增大 而有所提高，當(dāng)口服免疫劑量為1〇6~l〇8cells/ml，連續(xù)免疫7天，對(duì)lOLDso的媛弧菌感染濃 度可提供的WS為10~43.3%。
[0075] (3)浸泡免疫。用海水將實(shí)施例8的媛弧菌SMP3滅活菌苗制成濃度108c化/ml的疫 苗液，放入60尾大菱解，通氣浸浴30min，另取60尾大菱解放入不加菌苗的海水為空白對(duì)照 組。浸浴接種后4周，從免疫組和對(duì)照組牙解隨機(jī)取30尾，從腹部肌肉途徑注射攻毒 1化D5GSMP3活菌(2.5 X 106C即/尾），攻毒后觀察2周，每日統(tǒng)計(jì)大菱解死亡癥狀和死亡數(shù)量， 計(jì)算累積死亡率和相對(duì)免疫保護(hù)率RPS。結(jié)果如表5所示，與注射接種途徑比較，SMP3滅活菌 苗的浸泡接種途徑比注射途徑提供的免疫保護(hù)低，當(dāng)浸泡免疫劑量為1 〇8ce 11 s/ml時(shí)，對(duì) 100)5〇的媛弧菌感染濃度可提供的邸5為16.7%。
[0076] 表5媛弧菌SMP3滅活菌苗在大菱解的應(yīng)用
[0077]
[(
0079 0080 12 實(shí)施例10:媛弧菌SMP3滅活菌苗的交叉免疫保護(hù) 2 健康牙解體重12 ±0.4g，養(yǎng)殖水溫維持20.0 ± 0.3°C，養(yǎng)殖管理同實(shí)施例7。將牙解 分為免疫組和未免疫對(duì)照組，每組200尾。用濃度為10化即/ml媛弧菌SMP3滅活菌苗注射免 疫牙解，注射量為0.1ml/尾，則免疫劑量為108cel Is/尾，未免疫對(duì)照組注射0.1ml的PBS。免 疫后4周，將免疫組和對(duì)照組牙解隨機(jī)分為3組，每組30尾，用=株媛弧菌活菌從腹部肌肉途 徑進(jìn)行注射攻毒，攻毒劑量分別為：03血清型SMP3(2.3 X 106CFU/尾）、01血清型M3(1.7 X 106CFU/尾）、02血清型M0(2.1 X 106CFU/尾）。攻毒后觀察2周，每日統(tǒng)計(jì)大菱解死亡癥狀和死 亡數(shù)量，計(jì)算累積死亡率和相對(duì)免疫保護(hù)率RPS。結(jié)果如表6，SMP3滅活菌苗W 108cel 1 s/尾 的劑量注射免疫牙解，可顯著減少媛弧菌03血清型菌株感染引起的死亡，為牙解提供100% 的RPS，同時(shí)還明顯減少媛弧菌01血清型和02血清型菌株感染引起的死亡，為牙解提供 43.3%和53.3%的RPS，運(yùn)些結(jié)果說明SMP3滅活菌苗不僅對(duì)媛弧菌03血清型菌株的感染提 供有效的免疫保護(hù)，還對(duì)媛弧菌01血清型和02血清型菌株的感染提供良好的交叉免疫保 護(hù)。
[0081 ] 表6媛弧菌SMP3滅活菌苗注射免疫大菱解的免疫交叉保護(hù)效果
[pnso1
[0083] 實(shí)施例10:媛弧菌SMP3HCP抗原蛋白在大菱解的應(yīng)用
[0084] (1化CP的克隆。同實(shí)施例4制備SMP3的DNA模板。根據(jù)媛弧菌V.anguillarum 775 (GenBank : CP002 284 . 1 )全基因組序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增hep的引物序列hcp-F(5 ' - GGCGAATTCATGCCAACTGCATG
[0085] -3'，下劃線處為EcoRI酶切位點(diǎn)）和hcp-F(5'-ATCG四竺^TTACGCTTCAACAG-3'，下 劃線處為Sail酶切位點(diǎn)），WSMP3的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系同實(shí)施例4 ;PCR擴(kuò) 增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán);94°C變性30S，55°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循 環(huán);72°C延伸10min，l個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得一 個(gè)5(K)bp左右的DNA片段（附圖4AKPCR反應(yīng)試劑購自大連寶生物有限公司（Takara，日本）。 使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Invitrogen公司）回收目的片斷。所得的目的片斷用T4 DNA連接 酶（Takara，日本）與pGMT(Tiangen，北京）載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì) 胞，用含有氨節(jié)青霉素、IPTG和X-gal的平板篩選陽性重組菌落;對(duì)陽性重組菌提取質(zhì)粒并 進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)驗(yàn)證連接的DNA片段為序列正確的hep基因片段，將此重組質(zhì)粒命名為pGMT- hcp〇
[0086] (2；)化9的體外表達(dá)和純化。將9611'-11。9質(zhì)粒和祀132日載體(1'1日]1旨6]1，北京）用限制 性內(nèi)切酶EcoRI和SalI(Takara，日本)進(jìn)行雙酶切，回收hep的DNA片段和祀T32a載體的DNA 片段，酶切產(chǎn)物的目的片段，用T4 DNA連接酶(Takara，日本)將兩個(gè)DNA片段連接，連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL2UDE3)中，用氨節(jié)青霉素平板(50mg/ml)重組菌落;將陽性菌落接種于 50ml LB液體培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)12-16小時(shí)，Wl%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接300ml LB液體 培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)3-4小時(shí)至OD540達(dá)0.4-0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培 養(yǎng)4小時(shí)，在5000g、4°C離屯、收集菌體，用PBS洗涂兩次，用PBS重懸，用超聲波破碎細(xì)菌，超聲 破碎條件為:200W，超聲5s間隔10s，破碎時(shí)間為60-100min，直至菌液澄清。用Ni-Sepharose (Qiagen，德國）對(duì)細(xì)菌破碎液進(jìn)行蛋白純化，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。得到的純化蛋白經(jīng)過 SDS-PAGE電泳分析，確定蛋白純化的純度(附圖4B)，再蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析，確證純化的表達(dá)蛋 白為化P。
[0087] (3化CP免疫大菱解。健康大菱解體重16.7±0.5g，養(yǎng)殖管理同實(shí)施例7,分為4組， 每組30尾。將純化的化P蛋白與完全弗氏佐劑(Sigma,美國）等量混合，在縱滿混合器中攬拌 20分鐘進(jìn)行乳化，制成的乳化抗原W〇.5、l.0、化g蛋白/g魚體重的接種劑量，從大菱解腹腔 進(jìn)行注射接種，對(duì)照組注射等量的完全弗氏佐劑;第一次免疫30天后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，將純化 的Hep蛋白與不完全弗氏佐劑(Sigma,美國）等量混合，同上步驟進(jìn)行乳化制備乳化抗原，W 同于初免的劑量和免疫途徑對(duì)菱解進(jìn)行二免，對(duì)照組注射不加化P蛋白的不完全弗氏佐劑。 二免后第30天取免疫大菱解20尾，W濃度為2.2X107cells/ml的SMP3活菌進(jìn)行注射攻毒， 每尾注射0.1ml，則攻毒劑量為2.2X106cells/尾，攻毒后觀察2周，每日統(tǒng)計(jì)大菱解死亡癥 狀和死亡數(shù)量，計(jì)算累積死亡率和相對(duì)免疫保護(hù)率RPS。結(jié)果如表7所示，媛弧菌SMP3的化P 抗原蛋白W0.5-2.0蛋白/g體重的劑量注射免疫體重為16.7 ±0.5g的大菱解時(shí)，對(duì)2.2 X 106celIs/尾的媛弧菌感染可提供的WS為6.3-37.5%。
[0088] 表7媛弧菌SMP3的化P抗原蛋白在大菱解的應(yīng)用
[0089]
[0090] 實(shí)施例11:媛弧菌SMP3和殺娃氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗在大菱解的應(yīng)用
[0091] (1)二聯(lián)菌苗制備。取-80°C保存的SMP3和殺娃氣單胞菌MC5分別在TSA培養(yǎng)基中劃 線，在25-30°C培養(yǎng)24-3化獲得單菌落，各取單菌落接種于20ml TSB培養(yǎng)基中，在25-30°C、 ISOrpm振蕩培養(yǎng)12-1化后作為種子液，將種子液各自轉(zhuǎn)接于裝有化TSB培養(yǎng)基的發(fā)酵灌中 發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為25-30°C，發(fā)酵液0D54G為1.6-1.別寸終止培養(yǎng)，分別得到新鮮的SMP3和 M巧的發(fā)酵菌液；在發(fā)酵菌液中加入福爾馬林至終濃度為0.5%，在室溫滅活24-3化；在 5000g條件下離屯、15min，分別獲取SMP3和MC5菌體，用無菌PBS重懸后分別獲制得SMP3滅活 菌苗和M巧滅活菌苗。按實(shí)施例8步驟(2)的方法，分別進(jìn)行巧巾菌苗的安全性檢驗(yàn)。確認(rèn)菌苗 的安全性后，用PBS將巧巾分別制成濃度為109ce 11 s/ml的菌懸液，按照體積比為1:1的比例 將兩種菌苗進(jìn)行混合，得到媛弧菌與殺娃氣單胞菌的二聯(lián)滅活疫苗。
[0092] (2)免疫接種。健康大菱解體重21±0.5g，養(yǎng)殖管理同實(shí)施例7。暫養(yǎng)后將大菱解分 為2組，組1為免疫組，組2為對(duì)照組，每組90尾。取步驟1的二聯(lián)疫苗從腹腔注射免疫組1的大 菱解，接種量0.1ml/尾，則接種濃度為108celIs/尾；組2從腹腔注射0.1ml的PBS。接種后4 周，將免疫組對(duì)照組魚各分為2組，每組30尾，分別從腹部肌肉途徑注射攻毒SMP3活菌和M巧 活菌，攻毒濃度分別為3.6 X 106C即/尾、2.3 X 106C即/尾。攻毒后觀察2周，每日統(tǒng)計(jì)大菱解 死亡癥狀和死亡數(shù)量，計(jì)算累積死亡率和相對(duì)免疫保護(hù)率RPS。結(jié)果如表8所示，W劑量為 108cells/尾的二聯(lián)滅活菌苗注射接種大菱解，可顯著減少媛弧菌和殺娃氣單胞菌感染引 起的死亡率，分別為大菱解提供93.3 %和83.3 %的相對(duì)免疫保護(hù)率。
[0093] 表8媛弧菌SMP3與殺娃氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗在大菱解的應(yīng)用
[0106]
[010引序列特征：
[0109] 長度:623個(gè)堿基對(duì)
[0110]類型:核酸 [01川鏈型:雙鏈
[0112] 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0113] 分子類型:DNA
[0114] 特異性名稱:toxR基因序列
[0115] 最初來源:媛弧菌SMP3
[0116] 沈Q ID No:3 「rn d ~7l
0118 0119 0120 0121 0122 0123 0124 1234567 序列特征： 2 長度:658個(gè)堿基對(duì) 3 類型:核酸 4 鏈型:雙鏈 5 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性 6 分子類型:DNA 7 特異性名稱:recA基因序列 [01巧]最初來源:媛弧菌SMP3
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鰻弧菌菌株，其特征在于：鰻弧菌菌株SMP3，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，地址為中國武漢市武昌珞珈山，保藏日為2016年5月16日，保藏編號(hào)為：CCTCC Μ 2016261〇2. 按權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于:所述菌株是分離自海水養(yǎng)殖魚類的野生鰻弧 菌菌株SMP3，其0抗原血清型為03血清型。3. 按權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于:所述菌株的16sRNA、toxR、recA基因部分核酸 序列如SEQIDNo:l、SEQIDNo :2、SEQIDNo:3所示。4. 一種權(quán)利要求1所述的鰻弧菌菌株SMP3在制備鰻弧菌疫苗中的應(yīng)用。5. 按權(quán)利4所述的應(yīng)用，其特征在于：以所述SMP3菌株抗原為成分，制備疫苗或微膠囊 包囊疫苗； 或以所述SMP3菌株抗原再與其它細(xì)菌抗原混合作為混合抗原，以混合抗原制備聯(lián)和疫 苗或微膠囊包囊聯(lián)和疫苗； 或以所述SMP3菌株抗原與佐劑混合制備疫苗； 或以所述SMP3菌株抗原與其它細(xì)菌抗原混合作為混合抗原，混合抗原與佐劑混合制備 疫苗。6. 按權(quán)利5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述SMP3抗原或其它細(xì)菌的抗原通過滅活菌體、 菌蛻成分、減毒菌株、抗原亞單位、抗原基因表達(dá)產(chǎn)物的任何一種或一種以上的方式獲得。
【文檔編號(hào)】A61K39/106GK106047763SQ201610565205
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月18日
【發(fā)明人】莫照蘭, 李 杰, 李貴陽, 李淑芳
【申請(qǐng)人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所