經(jīng)修飾的自然殺傷t細(xì)胞、醫(yī)藥組合物和其用圖
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供經(jīng)修飾的自然殺傷T(NKT)細(xì)胞，包含所述經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞和至少一種醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑的醫(yī)藥組合物，和所述經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的用途。本文還公開(kāi)用于富集NKT細(xì)胞且產(chǎn)生所述經(jīng)修飾的自然殺傷T細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞以及醫(yī)藥組合物具有免疫抑制作用，可用于自體免疫疾病治療領(lǐng)域。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
經(jīng)修飾的自然殺傷T細(xì)胞、醫(yī)藥組合物和其用途
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)案的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2015年4月7日提交的美國(guó)申請(qǐng)案第62/144,066號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng) 案的全部公開(kāi)內(nèi)容W引用的方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及一種經(jīng)修飾的自然殺傷T細(xì)胞、醫(yī)藥組合物和 其用途。
【背景技術(shù)】
[0004] 自然殺傷T(NKT)細(xì)胞和常規(guī)T細(xì)胞在胸腺中發(fā)育自共同前體。然而，不同的胸腺內(nèi) T細(xì)胞受體(TCR)相互作用會(huì)激活細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄程序，所述程序指示每一細(xì)胞類(lèi)型的獨(dú)特 功能。NKT細(xì)胞通過(guò)與表達(dá)內(nèi)源性糖脂結(jié)合的CDld分子及表達(dá)CD4/CD8雙陽(yáng)性胸腺細(xì)胞的 TCR相互作用來(lái)選擇。相比之下，常規(guī)T細(xì)胞通過(guò)其TCR與胸腺上皮細(xì)胞的MHC分子及勝膚相 互作用來(lái)選擇(杰夫蘇布勒斯基(Jeff Subleski)等人NKT細(xì)胞在惡性病、自體免疫和過(guò)敏 病癥中的分裂人格（The split personality of NKT cells in mali邑nancy,autoimmune and allergic disorders).免疫療法（Immunotherapy) .2011年10月；3( 10): 1167-1184)。
[0005] 識(shí)別自身和非自身的確保機(jī)制崩潰為自體免疫疾病的標(biāo)志特征。祀向自身組織的 持久免疫反應(yīng)引起延長(zhǎng)的炎癥和后續(xù)的組織破壞。NKT細(xì)胞在患有自體免疫疾病的患者的 外周血液中的異常出現(xiàn)率和/或活性，說(shuō)明NKT細(xì)胞設(shè)及疾病病理學(xué)。
[0006] 運(yùn)些發(fā)現(xiàn)提高發(fā)展NKT細(xì)胞療法用于自體免疫疾病的可能性和為臨床應(yīng)用產(chǎn)生更 多可勝任于治療的NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法的可能性，因?yàn)槿源嬖趯?duì)于有效治療和/或預(yù)防自體 免疫疾病的未滿(mǎn)足的需求。
[0007] 本發(fā)明提供具有獨(dú)特表型W滿(mǎn)足運(yùn)些和其它需求的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞。經(jīng)修飾的 NKT細(xì)胞可用于自體療法或非自體療法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)修飾的自然殺傷T(NKT)細(xì)胞，其包含CD3+ CD56+CD8+NKT細(xì)胞表型；至少一種選自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的調(diào)節(jié)性T (lYeg)細(xì)胞表面 標(biāo)記物；W及選自PD-1的T輔助細(xì)胞表面標(biāo)記物。
[0009] 在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其包含CD3+CD56乂D8+NKT細(xì) 胞表型；至少一種選自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的Treg細(xì)胞表面標(biāo)記物;選自PD-1的T輔助 細(xì)胞表面標(biāo)記物，其中所述NKT細(xì)胞表型實(shí)質(zhì)上不含至少一種選自CDld-四聚體或TCR Va 24_Jal8的恒定型自然殺傷T(iNKT)細(xì)胞表面標(biāo)記物，其中所述NKT細(xì)胞表型實(shí)質(zhì)上不含至 少一種選自GITR、PI-16或IL-15RQ的細(xì)胞標(biāo)記物。
[0010] 在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其包含CD3+CD56乂D8+NKT細(xì) 胞表型；至少一種選自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的Treg細(xì)胞表面標(biāo)記物;選自PD-1的T輔助 細(xì)胞表面標(biāo)記物，選自IL-15Ra的T細(xì)胞生長(zhǎng)受體，其中所述NKT細(xì)胞表型實(shí)質(zhì)上不含至少一 種選自CDld-四聚體或TCR Va24_Jal8的iNKT細(xì)胞表面標(biāo)記物，其中所述NKT細(xì)胞表型實(shí)質(zhì) 上不含至少一種選自GITR或PI-16的細(xì)胞標(biāo)記物。
[0011] 在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供醫(yī)藥組合物，其包含一種或多種本文所述的經(jīng)修飾 的NKT細(xì)胞和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑。
[0012] 在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供本文所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞在制備治療自體免疫 疾病的藥物中的用途。
[0013] -些實(shí)施例提供用于治療自體免疫疾病的方法，其包含向有需要的個(gè)體投與有效 量的本文所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞或醫(yī)藥組合物，從而治療所述自體免疫疾病。
[0014] 本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生本文所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的方法，其包含(a)將富集的 單核細(xì)胞部分與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子e(TGF-e)和細(xì)胞培養(yǎng)基一起培養(yǎng)，其中所述富集的細(xì)胞部分 中的單核細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含W下細(xì)胞標(biāo)記物中的至少一種:CD14、CD19或CD25(下文為富集的 CD14-CD19-CD25-細(xì)胞部分），W及(b)使來(lái)自步驟(a)的經(jīng)培養(yǎng)的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞部分 與T細(xì)胞生長(zhǎng)因子接觸。
[0015] 在另一實(shí)施例中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的方法包含W下步驟：（a) 將富集的單核細(xì)胞部分與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子e(TGF-e)和細(xì)胞培養(yǎng)基一起培養(yǎng)，其中所述富集的 細(xì)胞部分中的單核細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含W下表面標(biāo)記物中的至少一種:〔04^014八016八019或 CD25(下文為富集的CDCCDirCDl擴(kuò)CD19-CD25-細(xì)胞部分），W及(b)使來(lái)自步驟(a)的經(jīng)培養(yǎng) 的CD4-CD14-CD1擴(kuò)CD19-CD25-細(xì)胞部分與T細(xì)胞生長(zhǎng)因子接觸。
[0016] 本文所述的富集和/或培養(yǎng)方法從固定量的樣品（例如10ml肝素化外周血液)產(chǎn)生 具有較高免疫抑制活性的更多數(shù)目的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞。
[0017] 用于此專(zhuān)利的術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明（invention)"、"本發(fā)明（the invention)"、"本發(fā)明 (this invention)"和"本發(fā)明（the present invention)"意欲廣泛地指此專(zhuān)利和隨附專(zhuān) 利權(quán)利要求書(shū)的所有主題。含有運(yùn)些術(shù)語(yǔ)的陳述應(yīng)理解為不限制本文所述的主題或不限制 隨附專(zhuān)利權(quán)利要求書(shū)的涵義或范圍。此專(zhuān)利涵蓋的本發(fā)明的實(shí)施例由隨附權(quán)利要求書(shū)而非 此
【發(fā)明內(nèi)容】
限定。此
【發(fā)明內(nèi)容】
為本發(fā)明的各種方面的高階綜述且引入一些進(jìn)一步描述于W 下【具體實(shí)施方式】部分中的概念。本
【發(fā)明內(nèi)容】
并不意欲識(shí)別所要求的主題的關(guān)鍵特征或基本 特征，也并非意圖單獨(dú)用于確定所要求的主題的范圍。主題應(yīng)參照整個(gè)說(shuō)明書(shū)的恰當(dāng)?shù)牟?分、任一或所有圖式和各權(quán)利要求來(lái)理解。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 所述專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)案含有至少一個(gè)彩制圖式。具有彩色圖式的此專(zhuān)利或?qū)＠?請(qǐng)案的拷貝將在請(qǐng)求和支付必需費(fèi)用之后由專(zhuān)利局提供。
[0019] 下文將參考W下圖式詳細(xì)描述本發(fā)明的說(shuō)明性實(shí)施例：
[0020] 圖1A示意性地示出單核細(xì)胞富集的兩個(gè)實(shí)施例且圖1B和圖1C示意性地示出用于 產(chǎn)生本發(fā)明的經(jīng)修飾的MT細(xì)胞的培養(yǎng)方法的兩個(gè)實(shí)施例。
[0021] 圖2A-2F為巧光激活細(xì)胞分選(FACS)圖像，其示出天然NKT細(xì)胞上CD4、CD14、CD16、 CD19和CD25細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)（圖2A-2B)，富集的CDI4-CDI9-CD25-細(xì)胞部分（圖2C和圖 2D)W及富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-細(xì)胞部分（圖沈和圖2F)。
[0022] 圖3A-3M為直方圖，其示出富集的CD14-CD19-CD25細(xì)胞部分的化邱3(圖3A)、CD25 (圖3B)、PD-1 (圖3C)、GITR(圖3D)、PI-16(圖3E)、CDld四聚體（圖3F)、TCR Va24_Jal8(圖 3G)、CTLA-4(圖3H)、LAP(圖3I)、IL-15Ra(圖3J)、CD14和CD19(圖3K)、CD4(圖：3L)W及CD3(圖 3M)的表達(dá)。
[0023] 圖4A-4L為直方圖，其示出富集的CDrCDHTDl擴(kuò)CD19-CD25-細(xì)胞部分的化邱3(圖 4A)、CD25(圖4B)、PD-1 (圖4C)、GITR(圖4D)、PI-16(圖4E)、CDld四聚體（圖4F)、TCR Va24_Ja 18(圖4G)、CTLA-4(圖4H)、LAP(圖41)、化-15Ra(圖41)、〔04、〔014、〔016和〔019(圖41〇^及 CD3(圖化）的表達(dá)。
[0024] 圖5A-5M為直方圖，其示出實(shí)例2中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的CD25(圖5A)、PD-1(圖 5B)、G口R(圖5C)、PI-16(圖加）、CDld四聚體（圖祀）、TCR Va24_Jal8(圖5F)、CTLA-4(圖5G)、 LAP(圖甜）、IL-15Ra(圖 51)、化邱3(圖 5J)、CD14 和 CD19(圖 5K)、CD4(圖化）W 及CD3(圖 5M)的 表達(dá)。
[002引圖6A-6L為直方圖，其示出實(shí)例3中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的CD25(圖6A)、PD-1(圖 6B)、G口R(圖6C)、PI-16(圖抓）、CDld四聚體（圖6E)、TCR Va24_Jal8(圖6F)、CTLA-4(圖6G)、 LAP(圖細(xì)）、IL-15Ra(圖61) Joxp3(圖61)、〔04、〔014、〔01巧0〔019(圖服）和〔03(圖61^的表 達(dá)。
[0026] 圖7A-7C為T(mén)淋己細(xì)胞的CFSE巧光的直方圖，其示出實(shí)例2中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞 (培養(yǎng)自富集的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞部分)對(duì)T淋己細(xì)胞增殖的抑制作用。圖7A展示T淋己細(xì) 胞在無(wú)任何刺激下的體外增殖，圖7B展示T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞在抗CD3和抗CD28抗體刺激下 的體外增殖，且圖7C展示經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞在抗CD3和抗CD28抗體刺激下對(duì)T淋己細(xì)胞應(yīng)答 細(xì)胞增殖的抑制作用。。
[0027] 圖8A-8C為T(mén)淋己細(xì)胞的CFSE巧光的直方圖，其示出實(shí)例3中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞 (培養(yǎng)自富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-細(xì)胞部分)對(duì)T淋己細(xì)胞增殖的抑制作用。圖8A展 示T淋己細(xì)胞在無(wú)任何刺激下的體外增殖，圖8B展示T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞在抗CD3和抗CD28 抗體刺激下的體外增殖，且圖8C展示經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞在抗CD3和抗CD28抗體刺激下對(duì)T淋 己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞增殖的抑制作用。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 如本文所用，冠詞"一個(gè)(a)"和"一個(gè)(an)"是指一個(gè)或一個(gè)W上（即，至少一個(gè))所 述冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。作為舉例，"一個(gè)經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞"意指一個(gè)經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞或一個(gè) W上經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞。
[0029] 如本文所用的"有效量"是指足W減少I(mǎi)L-10含量或自體免疫疾病的癥狀和征象 (其包括(但不限于)體重減輕、皮疹、腹痛、眼睛發(fā)癢、關(guān)節(jié)疼痛或腫脹)的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞 或醫(yī)藥組合物的劑量。
[0030] 術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"可指具有自體免疫疾病的脊椎動(dòng)物或認(rèn)為需要自體免疫疾病治療或 需要增加 IL-10含量的脊椎動(dòng)物。個(gè)體包括溫血?jiǎng)游?，如哺乳?dòng)物、如靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物且更優(yōu)選 地為人類(lèi)。非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物同樣為個(gè)體。術(shù)語(yǔ)個(gè)體包括經(jīng)馴養(yǎng)動(dòng)物(如貓、狗等）、家畜（例 如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、家兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠等）。由此，在本 文中涵蓋獸醫(yī)用途和醫(yī)用調(diào)配物。
[0031] NKT細(xì)胞表面上的細(xì)胞表面標(biāo)記物（如CD25、Fo邱3、PD-1)的表達(dá)含量或表面密度 只要所述表達(dá)相對(duì)于陰性對(duì)照群體(表示為為陽(yáng)性就為。在一個(gè)例示性實(shí)施例中， V'意指細(xì)胞表面標(biāo)記物相對(duì)于同型對(duì)照可檢測(cè)地存在于巧光激活細(xì)胞分選術(shù)或磁珠中； 或在定量或半定量RT-PCR中在背景之上可檢測(cè)到。在另一例示性實(shí)施例中，意指細(xì)胞標(biāo) 記物相對(duì)于同型對(duì)照不可檢測(cè)地存在于巧光激活細(xì)胞分選術(shù)或磁珠中；或在定量或半定量 RT-PCR中在背景之上不可檢測(cè)到。在一個(gè)實(shí)例中，表面標(biāo)記物的V'表達(dá)意指表面標(biāo)記物的 凈平均巧光強(qiáng)度(MFI)大于或等于約0、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、或約 5。在另一實(shí)例中，表面標(biāo)記物的表達(dá)意指表面標(biāo)記物的凈MFI小于或等于約5、約4.5、約 4、約 3.5、約 3、約 2.5、約 2、約 1.5、約 1、約 0.5、約 0。
[00創(chuàng)術(shù)語(yǔ)"T細(xì)胞"和"T淋己細(xì)胞'在整個(gè)此專(zhuān)利中可互換地使用。
[0033] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上不含"包括細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)或細(xì)胞標(biāo)記物的含量 通過(guò)所述領(lǐng)域中所用的常規(guī)分析方法不可檢測(cè)到或最低限度地檢測(cè)到。舉例來(lái)說(shuō)，熟練的 業(yè)內(nèi)人±已知FACS/流式細(xì)胞儀W及其它分析方法。
[0034] 本文中的所有數(shù)字可理解為由"約"修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，除非另外說(shuō)明，否則當(dāng) 提及可測(cè)量值，如量、時(shí)間的持續(xù)時(shí)間等時(shí)，術(shù)語(yǔ)"約"意欲涵蓋偏離指定值±10%、優(yōu)選地 ± 5 %、更優(yōu)選地± 1 %、且甚至更優(yōu)選地± 0.1 %的變化，照此變化適于治療劑的劑量。如本 文所用，除非另外說(shuō)明，否則當(dāng)提及范圍時(shí)，術(shù)語(yǔ)"約"意欲涵蓋偏離指定值在所述范圍的差 值中的± 10 %、優(yōu)選地± 5 %、更優(yōu)選地± 1 %、且甚至更優(yōu)選地± 0.1 %的變化，照此變化適 于治療劑的劑量。
[00巧]經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞
[0036] 天然存在的或常規(guī)NKT細(xì)胞具有CD3+CD56乂D8+表型。在一個(gè)例示性實(shí)施例中，天然 存在的或常規(guī)NKT 細(xì)胞具有 CD14-CD19-CD3 乂 D56+CD8+CD4-CD25 下oxp3TD-廠(chǎng) CTLA-4-G 口R-PI- 16X01 d 四聚體-LAPTCR Va24_Ja 18-表型。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其包含CD3+CD56+CD8+NKT細(xì) 胞表型；至少一種選自CD25、Fo邱3XTLA-4或LAP的調(diào)節(jié)性T(lYeg)細(xì)胞表面標(biāo)記物；W及T 輔助細(xì)胞表面標(biāo)記物，如PD-1，如表1、圖5A-圖5M和圖6A-圖化中所示。不受任何具體理論束 縛，據(jù)相信，本發(fā)明的經(jīng)修飾的NKT具有與化eg細(xì)胞和/或T輔助細(xì)胞的免疫抑制性質(zhì)相似的 免疫抑制性質(zhì)，如制造 IFN-丫。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其包含 CD3乂D56+CD8+NKT細(xì)胞，其中所述CD3+CD56乂D8+NKT細(xì)胞進(jìn)一步包含至少一種選自CD25、 Fo邱3、PD-1、CTLA-4或LAP的Treg細(xì)胞表面標(biāo)記物，和T輔助細(xì)胞表面標(biāo)記物，如PD-1，如表1 中所示。
[003引在一個(gè)例示性實(shí)施例中，經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞包含CD14-CD19-CD3+CD4-CD16-CD56乂D8 +CD25卞oxp3+PD-rCTLA-4+G口R-pi-1 擴(kuò)CDld四聚體-LAP+TCR Va24_Jal8-比-15Ra+表型。在另 一例示性實(shí)施例中，經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞包含〔014^019下03+〔04下016-〔056+〔08+〔025卞0邱3+ PD- rCTLA-4+G 口R-PI -1 擴(kuò)CD 1 d 四聚體-LAP+TCR Va 24_Ja 18- IL-15Rcf 表型。
[0039] 表1.常規(guī)NKT細(xì)胞和經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的表型
[0040]
[0041 ] a叉頭框P3
[0042] b程序性死亡-1
[0043] ^田胞毒性T淋己細(xì)胞相關(guān)分子-4
[0044] d糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體
[00例 e膚抑制劑16
[0046] f潛伏相關(guān)膚
[0047] 巧細(xì)胞受體Va24 Jal8 [004引h白介素-15受體曰
[0049] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其由富集的CD4-CD14-CD16-CD19- CD25-單核細(xì)胞部分產(chǎn)生，且包含CD3+CD56乂D8+NKT細(xì)胞表型；至少一種選自CD25、Fo邱3、 CTLA-4或LAP的beg細(xì)胞表面標(biāo)記物；W及選自PD-1的T輔助細(xì)胞表面標(biāo)記物，其中所述NKT 表型實(shí)質(zhì)上不含至少一種選自CDld-四聚體或TCR Va24_Jal8的iNKT細(xì)胞表面標(biāo)記物，其中 所述NKT表型實(shí)質(zhì)上不含至少一種選自GITR、PI-16或IL-15Ra的細(xì)胞表面標(biāo)記物。在另一實(shí) 施例中，經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞由富集的CD14-CD19-CD25-單核細(xì)胞部分產(chǎn)生，且包含CD3+CD56+ CD8+NKT細(xì)胞表型；至少一種選自CD25、Fo邱3、PD-1、CTLA-4或LAP的lYeg細(xì)胞表面標(biāo)記物； 選自PD-1的T輔助細(xì)胞表面標(biāo)記物；W及選自IL-15Ra的T細(xì)胞生長(zhǎng)受體，其中所述NKT表型 實(shí)質(zhì)上不含至少一種選自CDld-四聚體或TCR Va24_Jal8的iNKT細(xì)胞表面標(biāo)記物，其中所述 NKT表型實(shí)質(zhì)上不含至少一種選自GITR或PI-16的細(xì)胞表面受體。
[0050] 在一個(gè)實(shí)施例中，W下細(xì)胞標(biāo)記物的凈MFI大于或等于約0、約0.5、約1、約1.5、約 2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5或約5:CD3、CD56、CD8、CD25、Fo邱3、PD-l、CTLA-4、LAP或Iレ l5Ra。在另一實(shí)施例中，W下細(xì)胞標(biāo)記物的凈MFI小于或等于約5、約4.5、約4、約3.5、約3、約 2.5、約2、約1.5、約1、約0.5、約0:〔014、〔019、〔04、〔016、6口3、口1-16、〔01(1四聚體、1'0?￥〇 24_Jal8或IL-15Ra。
[0051] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含W下細(xì)胞表面標(biāo)記物中 的至少一種：〔〇14、〔019、〔04、〔016、6口3、？1-16、〔01(1四聚體、1'0?￥〇24_護(hù)18或比-151?〇。在 一個(gè)例示性實(shí)施例中，經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞包含CD3+CD56+CD8+NKT細(xì)胞表型，其中所述CD3+ CD56+CD8+NKT細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含至少一種選自CDld-四聚體(例如CDld-四聚體-)或TCR Va24_ Ja 18(例如TCR Va24_Ja 1礦)的iNKT細(xì)胞表面標(biāo)記物。在另一個(gè)例示性實(shí)施例中，經(jīng)修飾的 NKT細(xì)胞包含CD3+CD56乂D8+NKT細(xì)胞表型，其中所述CD3+CD56乂D8+NKT細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含GITR (例如GITRl。在另一例示性實(shí)施例中，經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含PI-16細(xì)胞表面標(biāo)記物 (例如PI-161。在另一例示性實(shí)施例中，經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含T細(xì)胞生長(zhǎng)受體，如 比-15Ra(例如比-15RCT)。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)含量或表面密度通過(guò)W下方式定量:使 經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞暴露于在表2中列出的一種或多種巧光染料標(biāo)記的特異性抗人類(lèi)單克隆 抗體，接著使用流式細(xì)胞儀（例如Gall ios，可購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司（Beckman Coulter, Inc.，USA))分選經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞。用于定量細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)含量的其它方法 為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知或?qū)@而易見(jiàn)的。
[0053] 經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞可來(lái)自單一個(gè)體(即，自體)或匯集自多個(gè)個(gè)體(非自體的同種異 體)。
[0054] 醫(yī)藥組合物
[0055] 本發(fā)明提供醫(yī)藥組合物，其包含本文所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞和醫(yī)藥學(xué)上可接受 的載劑或賦形劑。
[0056] 投與本發(fā)明醫(yī)藥組合物或經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的途徑包括(但不限于)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、 關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、經(jīng)口、局部、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)皮、真皮下、腸胃外、直腸、脊髓或表皮投與。在一個(gè) 實(shí)施例中，經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞或醫(yī)藥組合物通過(guò)靜脈內(nèi)注射或輸注來(lái)投與。
[0057] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可制備為呈液體溶液或懸浮液或在注射之前呈適合于液體 媒劑中的溶液或懸浮液的固體形式的可注射劑。醫(yī)藥組合物還可制備為呈固體形式、乳化 或其它微粒載劑用于持續(xù)傳遞。舉例來(lái)說(shuō)，醫(yī)藥組合物可呈W下形式:油狀乳液、油包水乳 液、水包油包水乳液、位點(diǎn)特異性乳液、長(zhǎng)期滯留乳液、乳化膠、微乳液、納米乳液、脂質(zhì)體、 微粒、微球體、納米球、納米粒子和各種天然或合成聚合物，如非再吸收的不可滲透的聚合 物（如乙締乙酸乙締醋共聚物和Hytrel⑩共聚物）、可溶脹聚合物(如水凝膠）、或再吸收的 聚合物(如膠原蛋白）和某些聚酸或聚醋(如用于制造再吸收的縫合線(xiàn)的那些），其允許醫(yī)藥 組合物的持續(xù)釋放。
[005引本發(fā)明經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞調(diào)配到醫(yī)藥組合物中W便傳遞到哺乳動(dòng)物個(gè)體。醫(yī)藥組 合物單獨(dú)和/或與醫(yī)藥學(xué)上可接受的媒劑、賦形劑或載劑混合投與。合適的媒劑例如為鹽 水、右旋糖、甘油等和其組合。另外，媒劑可含有少量的助劑物質(zhì)，如潤(rùn)濕或乳化劑、pH緩沖 劑或佐劑。醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑可含有用于例如穩(wěn)定或提高或降低本發(fā)明的醫(yī)藥組合物 的吸收或清除速率的生理學(xué)上可接受的化合物。生理學(xué)上可接受的化合物可包括例如碳水 化合物(如葡萄糖、薦糖或葡聚糖）、抗氧化劑(如抗壞血酸或谷脫甘膚）、馨合劑、低分子量 蛋白質(zhì)、清潔劑、脂質(zhì)體載體或賦形劑或其它穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。其它生理學(xué)上可接受的 化合物包括濕潤(rùn)劑、乳化劑、分散劑或防腐劑。參見(jiàn)例如第21版雷明頓醫(yī)藥科學(xué) (Remington's Pharmaceutical Science),馬克出片反公司（Mack Publishing Company),賓 夕法尼亞州伊斯頓化as ton，PA.)("雷明頓(Remington ' s r )。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物還可包 括輔助物質(zhì)，如藥理藥劑、細(xì)胞因子或其它生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。
[0059] 制備所述劑型的實(shí)際方法為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知或?qū)@而易見(jiàn)的。參見(jiàn)例如 雷明頓醫(yī)藥科學(xué)，馬克出版公司，賓夕法尼亞州伊斯頓，第21版。
[0060] 經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞或本發(fā)明醫(yī)藥組合物可W單劑量治療形式或W多劑量治療形式 投與，按照一定時(shí)程和經(jīng)一定時(shí)間段，其適于個(gè)體的年齡、體重和健康狀況、所用具體組合 物和投與途徑、經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞或本發(fā)明醫(yī)藥組合物是用于預(yù)防性還是治愈性目的等。舉 例來(lái)說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞或醫(yī)藥組合物每月一次、每月兩 次、每月S次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每周兩次(biw)、每周S次(tiw)、每周四次、 每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天(qd)、一天兩次(qid)或一天S次(tid)投與。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞或醫(yī)藥組合物的投與持續(xù)時(shí)間（例如投與經(jīng)修飾 的NKT細(xì)胞或醫(yī)藥組合物所經(jīng)過(guò)的時(shí)間段)可不同，視多種因素中的任一種(例如個(gè)體反應(yīng) 等)而定。舉例來(lái)說(shuō)，經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞或醫(yī)藥組合物可經(jīng)在W下范圍內(nèi)的一段時(shí)間投與:約 一秒或多秒到一分鐘或多分鐘，一小時(shí)或多小時(shí)到一天到約一周，約兩周到約四周，約一個(gè) 月到約兩個(gè)月，約兩個(gè)月到約四個(gè)月，約四個(gè)月到約六個(gè)月，約六個(gè)月到約八個(gè)月，約八個(gè) 月到約1年，約1年到約2年，或約2年到約4年，或更長(zhǎng)時(shí)間。
[0062] 有利的是將腸胃外醫(yī)藥組合物或經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞調(diào)配成單位劑型W實(shí)現(xiàn)投與簡(jiǎn) 易性和劑量均一性。如本文中所用的單位劑型是指適合作為單一劑量用于待治療個(gè)體的物 理分散單位;每個(gè)單位含有與所需藥物載劑結(jié)合的經(jīng)計(jì)算W產(chǎn)生所需治療作用的預(yù)定量的 經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞。
[0063] 從細(xì)胞培養(yǎng)分析和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可W用于調(diào)配適用于人類(lèi)的多種劑量。在 一個(gè)實(shí)施例中，所述NKT細(xì)胞的劑量在包括抓50在內(nèi)的循環(huán)濃度范圍內(nèi)，并且具有極低毒性 或無(wú)毒性。劑量可W視所用劑型和所用投藥途徑而在此范圍內(nèi)變化。在另一實(shí)施例中，治療 有效劑量最初可W從細(xì)胞培養(yǎng)分析估計(jì)?？蒞在動(dòng)物模型中調(diào)配劑量W獲得如在細(xì)胞培養(yǎng) 中所測(cè)定的包括IC5〇(即，經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞實(shí)現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的濃度)的循環(huán)血漿濃 度范圍。桑德斯特普（Sonderstrup),施普林格免疫病理學(xué)研討會(huì)（Springer, Sem. Immunopathol.)25:35-45,2003.尼庫(kù)拉(化kula)等人，吸入毒理學(xué)（Inhal .Toxicol.) 4(12):123-53,2000。
[0064] 將醫(yī)藥組合物調(diào)配成含有有效量的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其中所述量視待治療的個(gè) 體和待治療的病況而定。任何具體個(gè)體的特定劑量水準(zhǔn)視多種因素而定，包括特定經(jīng)修飾 的NKT細(xì)胞的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投藥時(shí)間、投藥途徑、W及排泄速 率、藥物組合W及經(jīng)歷療法的具體疾病的嚴(yán)重度。本發(fā)明的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的治療或預(yù)防 有效量的例示性非限制性范圍為至少約10個(gè)細(xì)胞/劑到約1 X l〇iMV每劑。其它劑量也為可 能的，包括(但不限于）1X102、1X103、1X104、1X105、1X106、1X107、1X108或1X109。
[0065] 用于治療自體免疫疾病的方法
[0066] 本發(fā)明的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞具有與Treg細(xì)胞的免疫抑制性質(zhì)相似的免疫抑制性 質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于通過(guò)W有效治療自體免疫疾病的量向有需要的個(gè)體 投與本文所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞或醫(yī)藥組合物來(lái)治療自體免疫疾病的方法。不受任何具 體理論束縛，據(jù)相信，經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞通過(guò)增加 T輔助細(xì)胞1反應(yīng)(IFN- 丫分泌)或發(fā)揮免疫 抑制性質(zhì)來(lái)對(duì)自體免疫疾病發(fā)揮治療作用。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫抑制性質(zhì)為自體反應(yīng)和 激活的T淋己細(xì)胞(其為自體免疫疾病中的關(guān)鍵參與者)的抑制。
[0067] 如本文所用，"自體免疫疾病"為由個(gè)體自身組織產(chǎn)生且針對(duì)個(gè)體自身組織的疾病 或病癥。自體免疫疾病包括（但不限于）1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、橋本氏甲狀腺炎 化ashimoto ' S Thyroiditis)、格雷氏?。℅rave ' S disease)、牛皮癖、全身性紅斑狼瘡 (SLE)、舍格倫綜合癥（Sjoren ' S Syndrome)、乳糜瀉、扁平苔癖和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡過(guò) 敏性皮炎、硬皮病、異位性濕疹、鼻竇炎、哮喘、發(fā)炎性腸道疾病(如潰瘍性結(jié)腸炎）。
[0068] 經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞可單獨(dú)、或在一種或多種免疫抑制劑之前、之后或與一種或多種 免疫抑制劑同時(shí)投與。免疫抑制劑的非限制性實(shí)例包括類(lèi)固醇、非類(lèi)固醇消炎藥物(NSAID) (如嗎I噪美辛（indomethacin))、疾病改性抗風(fēng)濕病藥物(DMARD)或前述中的兩種或更多種 的組合。DMA畑包括小分子藥劑，如甲氨蝶嶺(methotrexate)、來(lái)氣米特（leflunomide)、柳 氮橫胺化晚（sulfasalazine)、環(huán)憐酷胺（cyclo地OS地amide)、硫挫嚷嶺（azathioprine)、 環(huán)抱菌素Aレyclospo;rinA)、d-青霉胺（d-penicillamine)、抗追疾藥物（例如?化氯哇 化y化oxychloroquine))。0魁畑還包括生物物質(zhì)，如腫瘤壞死因子a(TNF-a)括抗劑(例如依 那西普化tanercept)，商標(biāo)名恩利化nbrel)，可購(gòu)自美國(guó)科利奇維爾的惠氏醫(yī)藥公司 (Wyeth Pharmaceuticals,Inc. ,Collegeville,USA);阿達(dá)木單抗(Adalimumab)，商標(biāo)名修 美樂(lè)化UMIRA)，可購(gòu)自美國(guó)伊利諾伊州雅培公園的雅培實(shí)驗(yàn)室（AlDbott Laboratories, AW3〇tt Park, Illinois，USA))、白介素-1受體括抗劑、白介素-6受體括抗劑、抗CD20單克隆 抗體、CTLA-4-Ig、RGD 膚等。
[0069] 富集NKT細(xì)胞的方法和其用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的用途
[0070] 如圖1A中所示，樣品（例如外周血液、廝血、骨髓、來(lái)自胸腺或脾的組織樣品）獲自 個(gè)體，且樣品中的單核細(xì)胞通過(guò)離屯、(例如Ficoll-Paque?PREMIUM，美國(guó)通用電氣醫(yī)療集團(tuán) (GE Healthcare USA))分離。分離（isolating)或分離（separating)單核細(xì)胞的其它方法 為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知或?qū)@而易見(jiàn)的。經(jīng)分離的單核細(xì)胞可進(jìn)一步富集W獲得僅T 細(xì)胞。
[0071] 在一個(gè)實(shí)施例中，具有至少W下表面標(biāo)記物的單核細(xì)胞自經(jīng)分離的單核細(xì)胞部分 耗盡或移除:〔04^014、〔016、〔019或〔025。視樣品來(lái)源而定，單核細(xì)胞可來(lái)源于人類(lèi)外周單 核細(xì)胞、單核細(xì)胞或骨髓母細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，富集的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞部分中的單 核細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含選自CD14、CD19或CD25的細(xì)胞表面標(biāo)記物。在另一實(shí)施例中，富集的CD4- CD14-CD16-CD19-CD25-細(xì)胞部分中的單核細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含選自〔04、〔014、〔016、〔019或〔025 的細(xì)胞表面標(biāo)記物。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施例中，如圖1A和圖1B中所示，用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的體外方法包 含W下階段：（i)耗乏或移除具有W下細(xì)胞標(biāo)記物中的至少一種的單核細(xì)胞:CD14XD19或 CD25(即，產(chǎn)生富集的CD14-CD19-CD25-單核細(xì)胞部分）；（ii)使來(lái)自步驟（i)的CD14-CD19- CD25-細(xì)胞部分與包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子e(TGF-e)和細(xì)胞培養(yǎng)基的組合物接觸；W及（iii)使來(lái) 自步驟（ii)的富集的CD14-CD19-CD25-NKT細(xì)胞部分與T細(xì)胞生長(zhǎng)因子接觸。在另一實(shí)施例 中，用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的體外方法包含W下階段：（i)耗乏或移除具有W下細(xì)胞標(biāo) 記物中的至少一種的單核細(xì)胞：〔04、〔014、〔016、〔019或〔025(即，產(chǎn)生富集的〔04^014- CD16-CD19-CD25-單核細(xì)胞部分）；（ii)使來(lái)自步驟（i)的富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-細(xì) 胞部分與包含TGF-0和細(xì)胞培養(yǎng)基的組合物接觸；（iii)使來(lái)自步驟(ii)的單核細(xì)胞部分與 T細(xì)胞生長(zhǎng)因子接觸。
[0073] 在一個(gè)實(shí)施例中，使富集的NKT細(xì)胞與TGF-e、T細(xì)胞生長(zhǎng)因子和細(xì)胞培養(yǎng)基接觸增 強(qiáng)經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞上的lYeg細(xì)胞表面標(biāo)記物（如CD25、Fo邱3和CTLA-4)的表達(dá)。在另一實(shí) 施例中，培養(yǎng)方法增強(qiáng)T輔助細(xì)胞表面標(biāo)記物(如PD-1)的表達(dá)。經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的增殖速 率由FACS測(cè)定的經(jīng)修飾CD3+CD56 乂 D8+NKT細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度測(cè)定。細(xì)胞增殖的其它分析為此 項(xiàng)技術(shù)中熟知的，例如，克隆源性分析、代謝分析和直接增殖分析。
[0074] 如本文所用的細(xì)胞培養(yǎng)基包括支持細(xì)胞生長(zhǎng)和/或維持的任何培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng) 基的非限制性實(shí)例包括造血細(xì)胞培養(yǎng)基，如X-Vivo 15，或包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng) 基補(bǔ)充劑的混合物，如R-10培養(yǎng)基。
[0075] 術(shù)語(yǔ)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基包括支持哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)和/或維持的任何細(xì)胞培養(yǎng) 基，如RPMI培養(yǎng)基1640(可購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific, USA))。在一個(gè)實(shí)施例中，RPMI培養(yǎng)基1640包含lOOU/mL青霉素；lOOiig/mL鏈霉親和素；2mM k谷氨酷胺；W及20mM皿PES。培養(yǎng)基補(bǔ)充劑為哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物提供如脂質(zhì)、氨基酸、 生長(zhǎng)因子、葡萄糖或微量元素的營(yíng)養(yǎng)物W增加產(chǎn)量。培養(yǎng)基補(bǔ)充劑的非限制性實(shí)例為血清， 如約5 %到約10%胎牛血清(FBS)。在一個(gè)實(shí)施例中，R-10培養(yǎng)基包含RPMI培養(yǎng)基1640和 10%FBS〇
[0076] T細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括刺激T細(xì)胞的產(chǎn)生和發(fā)育的任何分子。T細(xì)胞生長(zhǎng)因子的非限 制性實(shí)例包括化-15。在一個(gè)實(shí)施例中，化-15的濃度為約20ng/ml到約16化g/ml。在另一實(shí) 施例中，化-15的濃度等于或小于約 160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、 30或20或其間增量為Ing/ml的任何值或值范圍（例如約155ng/ml、約37ng/ml)。
[0077] 盡管化-2可用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，但由比-2產(chǎn)生的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的數(shù)目 與IL-15的數(shù)目相比較少（參見(jiàn)表6)。化-2和化-15為具有重疊但不同生物學(xué)作用的細(xì)胞因 子，其受體共有兩個(gè)為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的亞基。不受任何具體理論束縛，據(jù)相信，比-15對(duì)其 專(zhuān)用受體a具有較高親和力，且因此需要較低濃度的IL-15來(lái)產(chǎn)生經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞。在一個(gè) 實(shí)施例中，T細(xì)胞生長(zhǎng)因子實(shí)質(zhì)上不含IL-2。在另一實(shí)施例中，化-2W < 2重量％、< 1.5重 量％、。重量％和< 0.5重量％的量存在于T細(xì)胞生長(zhǎng)因子中。富集的NKT細(xì)胞與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng) 因子e(TGF-e)細(xì)胞培養(yǎng)基或T細(xì)胞生長(zhǎng)因子的接觸時(shí)間的例示性非限制性范圍為約1分鐘 到約1小時(shí)、約1小時(shí)到約24小時(shí)、約1天到約3天、約1天到約6天、約1天到約9天、約3天到約6 天、或至少1天。在一個(gè)實(shí)施例中，接觸時(shí)間為約3天。在另一實(shí)施例中，接觸時(shí)間為約6天。
[0078] 執(zhí)行本發(fā)明的特定方面的W下實(shí)例僅出于說(shuō)明性目的提供，且并不意欲W任何方 式限制本發(fā)明的范圍。
[0079]
[0080] :富集的單核細(xì)胞部分
[0081] 如圖1A中所示，40ml外周血液收集自健康志愿者且肝素化。血液樣品與等體積的 預(yù)溫?zé)岬膽z酸鹽緩沖鹽水（PBS)混合（W色列生物工業(yè)公司（Biological Industries， Israel))。將40ml稀釋的外周血液等分試樣置放到50ml離屯、管中且下載10ml預(yù)溫?zé)岬?Ficoll-Paque?PREMIUM。離屯、管在2000rpm下在室溫中離屯、30分鐘。單核細(xì)胞自其它類(lèi)型的 血細(xì)胞分離，接著收集且在PBS中洗涂一次。細(xì)胞集結(jié)粒再懸浮到密度為106個(gè)/lOOiil MACS 緩沖液。
[0082] 為了耗乏或移除具有W下細(xì)胞標(biāo)記物中的至少一種的單核細(xì)胞:CD4、CD14、CD16、 CD19或CD25，來(lái)自前述段落的經(jīng)分離的單核細(xì)胞使用"如a化oMACS分離器"（德國(guó)貝吉施-格 拉德己赫的美天旋生物技術(shù)公司（Miltenyi Biotec Be;rgisch,Gla化ach,Germany))根據(jù) 制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫磁性珠粒分離。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，單核細(xì)胞用生物素-抗CD14抗體、生物 素-抗CD19抗體、生物素-抗CD25抗體、生物素-抗CD4抗體和/或生物素-抗CD16抗體(其均可 購(gòu)自博萊德(BioLegend))和20山鏈霉親和素微珠(德國(guó)美天旋生物技術(shù)公司）染色，且用磁 性分離器分離。CD14-CD19-CD25-單核細(xì)胞部分或CD4-CD14-CD1擴(kuò)CD19-CD25-單核細(xì)胞部分通 過(guò)洗涂而自未結(jié)合的細(xì)胞富集。富集的CD14-CD19-CD25-單核細(xì)胞部分實(shí)質(zhì)上不含具有至少 一種選自CD14、CD19或CD25的細(xì)胞表面標(biāo)記物的細(xì)胞，而富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25- 單核細(xì)胞部分實(shí)質(zhì)上不含具有至少一種選自〔04八014^016八019或〔025的細(xì)胞表面標(biāo)記 物的細(xì)胞。
[0083] 如圖2中所示，富集的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞部分（圖2D)和富集的CD4-CD14-CD16- CD19-CD25-細(xì)胞部分（圖2F)的〔04、〔014、〔016、〔019和〔025的信號(hào)水準(zhǔn)比非富集的細(xì)胞部分 (圖2B)的信號(hào)水準(zhǔn)低得多。
[0084] 實(shí)例2:經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的第一實(shí)施例的體外培養(yǎng)
[0085] 如圖1B中所示，來(lái)自實(shí)例1的富集的CD 14XD19-CD25-細(xì)胞部分如下培養(yǎng)：
[00化](a)在第0天，富集的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞部分與包含3ml R-10培養(yǎng)基和40ng/ml TGF-0的組合物一起培養(yǎng)在預(yù)先涂布有化g抗人類(lèi)CD3抗體(美國(guó)博萊德(Biolegend，USA)) 的6孔板中。
[0087] (b)在第1天，將40ng/ml比-15(博萊德)添加到步驟(a)中的培養(yǎng)物中。
[008引（C)在第3天，收集步驟（b)中的一半經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞且下旋，接著用R-10培養(yǎng)基和 40ng/ml TGF-0在6孔板中再懸浮細(xì)胞集結(jié)粒。
[0089] (d)在第4天，將40ng/ml比-15(博萊德)添加到步驟(C)中的培養(yǎng)物中。
[0090] (e)在第6天，收集來(lái)自步驟(d)的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞。
[0091] 步驟（e)中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞使用Ga 11 i0S流式細(xì)胞儀（貝克曼庫(kù)爾特公司 (Beckman Coulter，Inc.))、Kazula軟件1.2版（貝克曼庫(kù)爾特公司）和表2中列出的抗體分 析其表型。
[
[0092] 表2.用于經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞表型的抗體 「m〇q1
[00M]在此實(shí)施例中，使用FACS/流式細(xì)胞儀分析的細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)含量定義在 表3中。表3中的表達(dá)含量的解釋為定義細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)含量的一個(gè)實(shí)例。應(yīng)注意，流 式細(xì)胞儀信號(hào)水準(zhǔn)強(qiáng)度隨著W下因素變化:流式細(xì)胞儀、軟件和所用的不同批次抗體。
[0096] 表 3
[0097]
[009引結(jié)果：如圖3A-3M中所示，富集的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞部分的單核細(xì)胞具有表型 CD 14TD19-CD3乂D56+CD8+CD4-CD25下oxp3TD-rCTLA-4-G口R-PI-1 擴(kuò)CD 1 d四聚體-LAPTCR V口 24_Jal8-IL-15Ra-。
[0099] 圖5A-5M說(shuō)明實(shí)例2中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的表型為CD14-CD19-CD3+CD56+CD8+CD4- CD25+Foxp3+PD-rCTLA-4+G口R-pi-1 擴(kuò)CDld四聚體-LAP+TCR Va24_Jal8-比-15Ra+表型。
[0100] 表4展示富集的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞部分的單核細(xì)胞和由其培養(yǎng)的經(jīng)修飾的NKT 細(xì)胞的凈MFI。
[0101] 表4.
[0102]
[0104] W下概述富集的CD14-CD19-CD25-單核細(xì)胞表型和經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞表型之間的差 異。
[0105] 參富集的 CD14-CD19-CD25-單核細(xì)胞具有表型化 xp3-CD 化-pD-rCTLA-4-LAp-IL-15R 曰-，而經(jīng)修飾的 NKT 細(xì)胞具有表型Foxp3乂 D25+PD-rCTLA-4+LAP+Ikl5Ra+。
[0106] ?與富集的CDI4-CDI9-CD25-細(xì)胞的相比，F(xiàn)o邱3的表達(dá)在經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞中上調(diào) 至少62倍。
[0107] 參與富集的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞的相比，CD25的表達(dá)在經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞中上調(diào) 至少130倍。
[010引參與富集的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞的相比，PD-1的表達(dá)在經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞中上調(diào) 至少8.5倍。
[0109] 參與富集的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞的相比，CTLA-4的表達(dá)在經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞中上 調(diào)至少73倍。
[0110] 參與富集的CD14-CD19-CD25-細(xì)胞的相比，比-15Ra的表達(dá)在經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞中上 調(diào)至少250倍。
[0111] 實(shí)例3:經(jīng)修飾的MT細(xì)胞的第二實(shí)施例的體外培養(yǎng)
[OW] 如圖1C中所示，來(lái)自實(shí)例1的富集的CD4-CD14-CD1擴(kuò)CD19-CD25-細(xì)胞部分如下培養(yǎng)：
[0113] (a)在第0天，富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-細(xì)胞部分與包含3ml X-Vivo 15和 40ng/ml TGF-0的組合物一起培養(yǎng)在預(yù)先涂布有化g抗人類(lèi)CD3抗體(博萊德）的6孔板中。
[0114] (b)在第1天，將80ng/ml比-15(博萊德)添加到步驟(a)中的培養(yǎng)物中。
[0115] (C)在第3天，收集步驟(b)中的一半經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞且下旋，接著用3ml X-Vivo 15和 40ng/ml TGF-0在6孔板中再懸浮細(xì)胞集結(jié)粒。
[0116] (d)在第4天，將80ng/ml比-15(博萊德)添加到步驟(C)中的培養(yǎng)物中。
[0117] (e)在第6天，收集來(lái)自步驟(d)的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞。
[0118] 步驟(e)中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞根據(jù)實(shí)例2中的方案分析其表型。
[0119] 結(jié)果:如圖4A-化中所示，富集的CDCCDirCDl擴(kuò)CD19-CD25-細(xì)胞部分的單核細(xì)胞具 有表型 CD14-CD19-CD3+CD16-CD56+CD8+CD4-CD25J〇w3TD-rCTLA-4-GITR-pi-l 擴(kuò) CDld 四聚 體-LAPTCR Va24_Jal8-IL-15Ra-。
[0120] 圖6A-6L說(shuō)明實(shí)例3中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的表型為CD14-CD19-CD3+CD16-CD56+CD8+ CD4-CD化卞0邱3+PD-rCTLA-4+G口 R-pi-1 擴(kuò)CDld四聚體-LAP+TCR Va24_Jal8-比-15RCT表型。 [01別]表5展示富集的CDCCDirCDl擴(kuò)CD19-CD25-單核細(xì)胞和由其培養(yǎng)的經(jīng)修飾的NKT細(xì) 胞的凈MFI。
[0122] 表5.
[0123]
[0124]
[012引 W下概述富集的CD4-CD14-CD1擴(kuò)CD19-CD25-單核細(xì)胞表型和經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞表型 之間的差異。
[0126] 參富集的 CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-單核細(xì)胞具有表型化 xp3-CD25-pD-rCTLA-4- LAP-，而經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞具有表型化邱3+CD25+PD-rCTLA-4+LAP+。
[0127] 參與富集的CD4-CD14TD1擴(kuò)CD 19-CD2 5-細(xì)胞的相比，F(xiàn)oxp 3的表達(dá)在經(jīng)修飾的NKT細(xì) 胞中上調(diào)至少53倍。
[012引參與富集的CDrCDirCDl擴(kuò)CD19-CD25-細(xì)胞的相比，CD25的表達(dá)在經(jīng)修飾的NKT細(xì) 胞中上調(diào)至少85倍。
[0129] 參與富集的CDrCDirCDl擴(kuò)CD19-CD25-細(xì)胞的相比，PD-1的表達(dá)在經(jīng)修飾的NKT細(xì) 胞中上調(diào)至少15倍。
[0130] 參與富集的CD4-CD14TD16-CD19-CD25-細(xì)胞的相比，CTLA-4的表達(dá)在經(jīng)修飾的NKT 細(xì)胞中上調(diào)至少90倍。
[0131] 實(shí)例4: IL-15濃度對(duì)經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞培養(yǎng)物的作用
[0132] 比-15的濃度對(duì)經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞培養(yǎng)物的體外評(píng)估使用FACS/流式細(xì)胞儀執(zhí)行。
[0133] W下化-15濃度用于產(chǎn)生實(shí)例2的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞：5ng/ml IL-12、10ng/ml、 20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml和160ng/ml。
[0134] 璧呈當(dāng)比-15濃度在約 20ng/ml 到約 160ng/ml 之間時(shí)，F(xiàn)oxp3、CD25、CTLA-4和 PD-1 的表達(dá)含量較高。
[0135] 實(shí)例5:經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞對(duì)激活的CFSE標(biāo)記的T淋己細(xì)胞的增殖的抑制能力的功 能性評(píng)估
[0136] "T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞"分析：簇基巧光素二乙酸醋下二酷亞胺醋（CFSE)標(biāo)記的 CD25-外周血單核細(xì)胞(CD25-PBMC)用化g/ml抗CD3和化g/ml抗CD28抗體刺激W激活CFSE標(biāo) 記的T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞。將實(shí)例巧日實(shí)例3中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞添加到CFSE標(biāo)記的T淋己 細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞中W評(píng)估免疫抑制性質(zhì)。在共培養(yǎng)4天之后，測(cè)量CFSE巧光稀釋度。
[0137] 實(shí)例2中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的結(jié)果：圖7A示出了在無(wú)任何抗體刺激下CFSE標(biāo)記的 T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞的CFSE稀釋度分析(2.78% )?？笴D3抗體和抗CD28抗體的添加誘導(dǎo)CFSE 標(biāo)記的T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞的增殖(35.02%)，如圖7B中所示。圖7C展示將實(shí)例帥的經(jīng)修飾 的NKT細(xì)胞添加到CFSE標(biāo)記的T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞中使CFSE標(biāo)記的T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞的增 殖減少35.02 %到13.24% (62 %減少）。
[0138] 實(shí)例3中的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的結(jié)果：圖8A示出了在無(wú)任何抗體刺激下CFSE標(biāo)記的 T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞的CFSE稀釋度分析（1.18% )?？笴D3抗體和抗CD28抗體的添加誘導(dǎo)CFSE 標(biāo)記的T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞的增殖（15.21 % )，如圖8B中所示。圖8C展示將實(shí)例3中的經(jīng)修飾 的NKT細(xì)胞添加到CFSE標(biāo)記的T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞中使CFSE標(biāo)記的T淋己細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞的增 殖減少15.21 % 到3.7 % (75.5 % 減小）。
[0139] 運(yùn)些結(jié)果展示出本發(fā)明的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞有效抑制激活的CFSE標(biāo)記的T淋己細(xì) 胞(其為自體免疫疾病中的關(guān)鍵參與者)的增殖。
[0140] 實(shí)例6: IL-2對(duì)經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的產(chǎn)生的作用
[0141] IL-2對(duì)經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞培養(yǎng)物的作用的體外評(píng)估使用FACS/流式細(xì)胞儀執(zhí)行。實(shí) 例1的富集的CD14-CD19-CD25-單核細(xì)胞與（a)抗CD3抗體巧GF-0+比-2或(b)抗CD3抗體巧GF- 折比-15-起根據(jù)實(shí)例2中的步驟培養(yǎng)。
[0142] 表6.用不同培養(yǎng)基或生長(zhǎng)因子產(chǎn)生的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的％
[0143]
[0144] 如表6中所示，用TGF-0和化-2產(chǎn)生的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的一個(gè)例示性實(shí)施例的％ 為1.26。另一方面，用TGF-0和比-15產(chǎn)生的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的％為15.47，此代表與用TGF- 0和IL-2產(chǎn)生的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的％相比增加11倍。
[0145] 雖然已經(jīng)描述并說(shuō)明了本發(fā)明的特定方面，但是所述方面應(yīng)僅視為本發(fā)明的說(shuō)明 性實(shí)施例并且不應(yīng)視為限制如根據(jù)所附權(quán)利要求書(shū)所理解的本發(fā)明。本說(shuō)明書(shū)中所引用的 所有公開(kāi)案和專(zhuān)利申請(qǐng)案W全文引用的方式并入本文中用于所有目的，其引用的程度如同 每篇個(gè)別公開(kāi)案或?qū)＠暾?qǐng)案經(jīng)具體地并且個(gè)別地指明W引用的方式并入一般，W用于所 有目的。盡管已出于清楚理解的目的通過(guò)說(shuō)明和實(shí)例相當(dāng)詳細(xì)地描述前述發(fā)明，但根據(jù)本 發(fā)明的教示，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地顯而易見(jiàn)，可在不脫離所附權(quán)利要求書(shū)的精神 或范圍的情況下對(duì)其作出某些改變和修改。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種經(jīng)修飾的自然殺傷T (NKT)細(xì)胞，其包含： NKT細(xì)胞表型，其特征為⑶3+⑶56+⑶8+; 至少一種T調(diào)節(jié)性(Treg)細(xì)胞表面標(biāo)記物，其選自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP;以及 T輔助細(xì)胞表面標(biāo)記物，其選自PD-1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其中所述NKT細(xì)胞表型實(shí)質(zhì)上不含至少一 種選自⑶Id-四聚體或TCR Va24_Jal8的恒定型自然殺傷T(iNKT)細(xì)胞表面標(biāo)記物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其中所述NKT細(xì)胞表型實(shí)質(zhì)上不含GITR、 PI-16或其組合。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其進(jìn)一步包含IL-15Ra。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其中所述NKT細(xì)胞表型實(shí)質(zhì)上不含IL-15R a〇6. -種醫(yī)藥組合物，其包含： (a) 經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞，其包含： NKT細(xì)胞表型，其特征為⑶3+⑶56+⑶8+; 至少一種T調(diào)節(jié)性(Treg)細(xì)胞表面標(biāo)記物，其選自CD25、Foxp3、CTLA-4和LAP;以及 T輔助細(xì)胞表面標(biāo)記物，其選自PD-1;以及 (b) 醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的醫(yī)藥組合物，其中所述NKT細(xì)胞表型實(shí)質(zhì)上不含一種或多種選 自⑶Id-四聚體或TCR Va24_Jal8的iNKT細(xì)胞表面標(biāo)記物。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的醫(yī)藥組合物，其中所述NKT細(xì)胞表型實(shí)質(zhì)上不含GITR、PI-16或 其組合。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的醫(yī)藥組合物，其中所述經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞進(jìn)一步包含IL-15Ra。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的醫(yī)藥組合物，其中所述NKT細(xì)胞表型實(shí)質(zhì)上不含IL_15Ra。11. 權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞在制備治療自體免疫疾病的藥物中的用途。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含一種或多種選 自⑶Id-四聚體或TCR Va24_Jal8的iNKT細(xì)胞表面標(biāo)記物。13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含GITR、PI-16或 其組合。14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞進(jìn)一步包含IL-15Ra。15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞實(shí)質(zhì)上不含IL-15Ra。16. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述治療自體免疫疾病的藥物中，進(jìn)一步包含免 疫抑制劑。17. -種產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞的方法，其包含以下步驟： (a) 將富集的⑶14TD19TD25^單核細(xì)胞部分與包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子iKTGF-β)和細(xì)胞培養(yǎng) 基的組合物一起培養(yǎng)；以及 (b) 使來(lái)自步驟(a)的所述經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞部分與T細(xì)胞生長(zhǎng)因子接觸。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基和培 養(yǎng)基補(bǔ)充劑。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI培養(yǎng)基1640且 所述培養(yǎng)基補(bǔ)充劑為胎牛血清。20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基為造血細(xì)胞培養(yǎng)基。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述造血細(xì)胞培養(yǎng)基為X-Viv〇15。22. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述T細(xì)胞生長(zhǎng)因子為IL-15。23. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述富集的CD14TD19TD25^單核細(xì)胞進(jìn)一步耗 盡具有以下細(xì)胞標(biāo)記物中的至少一種的細(xì)胞:⑶4或⑶16。24. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述富集的細(xì)胞碎片與所述組合物或所述T細(xì)胞 生長(zhǎng)因子的所述接觸時(shí)間為約1天到約3天。25. -種經(jīng)修飾的自然殺傷T(NKT)細(xì)胞，其包含表型CD3+CD56+CD8+CDld-四聚體-TCR Va 24_Ja 18-GITR-ΡI -16-CD25+Foxp3+CTLA-4+LAP+PD- ΓIL-15Rcf 〇
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK106047808SQ201610212808
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年4月7日 公開(kāi)號(hào)201610212808.5, CN 106047808 A, CN 106047808A, CN 201610212808, CN-A-106047808, CN106047808 A, CN106047808A, CN201610212808, CN201610212808.5
【發(fā)明人】李建謀, 方志豪, 鄭雅方, 魏大程, 周凱元
【申請(qǐng)人】富禾生醫(yī)股份有限公司