一種植酸酶突變體及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種植酸酶突變體及其制備方法和應(yīng)用，植酸酶突變體的序列SEQ ID No：1，該突變體由編碼無(wú)花果曲霉植酸酶氨基酸序列發(fā)生改變而獲得；本發(fā)明使用煙曲霉植酸酶的部分氨基酸序列來(lái)替代無(wú)花果曲霉植酸酶氨基酸序列，使其成為耐熱性高的植酸酶；以無(wú)花果曲霉植酸酶基因序列作為模版，通過(guò)基因點(diǎn)突變技術(shù)使無(wú)花果植酸酶基因發(fā)生突變，獲得了新的植酸酶基因的突變體SEQ ID NO：2，該植酸酶基因的突變體與質(zhì)粒PPIC9K等相連構(gòu)建重復(fù)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主GS115等獲得基因工程菌株，通過(guò)基因工程菌株發(fā)酵，獲得新的植酸酶突變體；能有較寬的pH作用范圍和較理想耐熱特性，適合耐高溫制粒，較好地滿足飼料工業(yè)的要求。
【專利說(shuō)明】
-種植酸酶突變體及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種植酸酶突變體及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植酸廣泛存在于玉米、米慷、各種餅巧等飼料原料中，一方面它具有很強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng) 作用，與飼料中金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合，影響運(yùn)些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收;另一方面植酸分 子含有大量有機(jī)憐，動(dòng)物胃腸道由于缺少相應(yīng)的酶，因而不能利用，運(yùn)些有機(jī)憐隨糞便排放 到環(huán)境中，造成環(huán)境污染。植酸酶可使植酸發(fā)生水解反應(yīng)，生成肌醇衍生物和正憐酸，作為 單胃動(dòng)物的飼料添加劑，可W促進(jìn)動(dòng)物對(duì)憐元素的利用，有助于畜禽生長(zhǎng)，提高畜牧業(yè)效 益，同時(shí)它還能降低植酸憐對(duì)環(huán)境的污染，并且可W提高飼料中能量與蛋白質(zhì)的消化率?，F(xiàn) 在已成為飼料行業(yè)公認(rèn)的有效飼料添加劑。植酸酶作為飼料添加劑在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中需要 耐受飼料高溫制粒過(guò)程，因此飼用植酸酶必須耐熱，而目前大多數(shù)植酸酶耐熱性能較差。
[0003] 無(wú)花果植酸酶（黑曲霉植酸酶)雖然酶比活相對(duì)高，也具有一定的耐熱作用，但在 實(shí)際應(yīng)用上還不理想，如果能夠?qū)⑵淠蜔嵝栽龈?，無(wú)花果植酸酶將具有更大的應(yīng)用價(jià)值。相 比之下，煙曲霉植酸酶有著更好的耐熱性，但比活相對(duì)較低。因此，本發(fā)明根據(jù)煙曲霉植酸 酶的序列中與其耐熱性相關(guān)的氨基酸序列來(lái)改造無(wú)花果曲霉植酸酶，使其成為耐熱性高的 植酸酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種植酸酶突變體及其應(yīng)用，旨在解決無(wú)花果植酸酶的耐 熱性較差，在實(shí)際應(yīng)用上不理想的問(wèn)題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種植酸酶突變體，所述植酸酶突變 體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0006] 進(jìn)一步的，所述植酸酶突變體由編碼無(wú)花果曲霉植酸酶氨基酸序列SEQ ID N0:3 中第43位鄉(xiāng)氨酸變成絲氨酸、第46位脯氨酸變?yōu)榻z氨酸、第169位谷氨酷胺變?yōu)樘K氨酸、第 170位脯氨酸變?yōu)樘於岚贰⒌?71位甘氨酸變?yōu)榫彼?、?52位蘇氨酸變?yōu)榫彼?、?55 位鄉(xiāng)氨酸變?yōu)樘於彼?、?56位天冬氨酸變?yōu)楸彼?、?58位賴氨酸變?yōu)楣劝笨岚范@ 得。
[0007] 本發(fā)明的第二目的是提供一種植酸酶突變體的編碼基因，其核巧酸序列如SEQ ID No: 2所示。
[000引本發(fā)明還提供一種替代權(quán)利要求1中植酸酶的無(wú)花果曲霉植酸酶序列，其特征在 于，所述無(wú)花果曲霉植酸酶序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0009] 本發(fā)明的第=目的是提供一種植酸酶突變體的制備方法，步驟包括：
[0010] (1)、無(wú)花果植酸酶基因連接到PMD19-T載體上的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 突變PCR擴(kuò)增;產(chǎn)物電泳檢測(cè)，條帶正確后加化1 DMT酶于PCR產(chǎn)物中，混勻，37°C解育化;進(jìn) 而進(jìn)行突變片段組裝，配制lOyl組裝體系與50°C反應(yīng)15min;
[0011] (2)、加入lOiil突變組裝后的產(chǎn)物于50iil DMT感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min;42 °(：準(zhǔn)確熱激45s，立即置于冰上lOmin;加500山LB培養(yǎng)基，200轉(zhuǎn)、37 °C培養(yǎng)化;7000rpm離屯、 3min，棄上清，保留100-15化1，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，培養(yǎng)過(guò)夜；
[0012] (3)、每個(gè)位點(diǎn)的陽(yáng)性克隆送出測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原序列比對(duì)，找出突變正確的重 組質(zhì)粒，再W突變一次質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行第二位點(diǎn)突變至止突變位點(diǎn)全部突變掉；
[0013] (4)設(shè)計(jì)連接引物，將突變后的植酸酶序列連接到酵母菌表達(dá)載體ppic9k上，突變 后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115或X33、SMD1168、PICHIAPINK中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)酵測(cè)酶活，研究酶 學(xué)及應(yīng)用特性。
[0014] 進(jìn)一步的，步驟（1)中，所述突變PCR條件為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s、66°C 退火30s、72°C延伸2.5min，共28個(gè)循環(huán);94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸2.5min，共7 個(gè)循環(huán);72°C擴(kuò)增后延伸1 Omin;其中從66°C到52°C每個(gè)循環(huán)溫度下降0.5°C。
[0015] 進(jìn)一步的，步驟(4)中，所述轉(zhuǎn)換載體PCR反應(yīng)參數(shù)為:94°C預(yù)變性5min; 94°C變性 30s，55°C退火30s，72°C延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán);72°C擴(kuò)增后延伸lOmin;
[0016] 本發(fā)明的第四目的是提供一種植酸酶突變體在飼料添加劑中的應(yīng)用，特別適用水 產(chǎn)飼料。
[0017] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明提供的植酸酶突變體及其應(yīng)用，通過(guò)分析具有 更好的耐熱性煙曲霉植酸酶分子結(jié)構(gòu)特征，使用煙曲霉植酸酶的部分序列來(lái)替代無(wú)花果曲 霉植酸酶氨基酸序列，無(wú)花果曲霉(黑曲霉)植酸酶氨基酸序列SEQ ID NO: 3中的氨基酸發(fā) 生如下改變 乂435，？465,91691'，？17(^，61711?，12521?，￥2550,02564，1(2589。具體方案為^無(wú) 花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)作為模版，使無(wú)花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因發(fā)生突變，獲 得了新的植酸酶基因的突變體SEQ ID N0:2,該突變后的基因除與PPIC9K構(gòu)建重組質(zhì)粒外， 還可W與??1〔9、？?1〔234\8\(：、？?1〔24\8\(：、？64?234\8\(：等表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化相 應(yīng)宿主菌(畢赤酵母GS115或村33、5101168、？1邸14?1服），通過(guò)在平板上加入植酸巧或在平 板中加入G418、Zeocin等抗生素，篩選獲得植酸酶突變體基因工程菌，然后通過(guò)發(fā)酵獲得新 的植酸酶突變體。使其成為耐熱性高的植酸酶，該植酸酶突變體在高溫下，植酸酶的溫度耐 受情況如圖5-7所示，無(wú)論在任何溫度和時(shí)間下，突變后的相對(duì)酶活都高于突變前的，在70 °(：耐受化突變植酸酶相對(duì)酶活大約還有65%，而突變之前無(wú)花果植酸酶僅僅剩余35%，突 變植酸酶耐受化才降到半衰期W下。在80°C時(shí)突變后植酸酶相對(duì)酶活剩余一半時(shí)的時(shí)間大 約為60min，而突變前耐受15min就達(dá)到半衰期了。高溫90°C時(shí)耐受30min突變后植酸酶相對(duì) 酶活還剩余接近55%，突變前僅僅剩余25%，總之突變后與突變前相比溫度耐受相對(duì)提高 了30%;同時(shí)植酸酶突變體較原無(wú)花果曲霉植酸酶具有更寬的作用抑，相對(duì)突變前無(wú)花果 植酸酶，突變后的酶的最適抑提高了 0.5個(gè)單位，并且在中性環(huán)境下抑= 7.0相對(duì)酶活剩余 接近50%，與突變之前有改進(jìn)。該突變體能在中性環(huán)境中很好發(fā)生作用，并且具有較理想耐 熱特性，適合耐高溫制粒，因此特別適合于作為水產(chǎn)飼料添加劑。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可 W根據(jù)運(yùn)些附圖獲得其他的附圖。
[0019] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的植酸酶突變體的制備方法流程圖；
[0020] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例3提供的最適抑的測(cè)定曲線圖；
[0021 ]圖3是本發(fā)明實(shí)施例3提供的最適溫度曲線圖；
[0022] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例3提供的pH耐受曲線圖；
[0023] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例3提供的70°C耐受曲線圖；
[0024] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例3提供的80°C耐受曲線圖；
[0025] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例3提供的90°C耐受曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0027] 1、試驗(yàn)材料和試劑
[00巧]菌株及載體:大腸桿菌Escherichia coli DMT感受態(tài)購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有 限公司，T 載體 PMD19-T,表達(dá)載體 PPIC9K 或 PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C、 PPINK Hc\Lc等及畢赤酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)(來(lái)源于INV口R0GEN公司）。 [00巧]2、酶類及其他生化試劑
[0030] DNA聚合酶，核酸酶內(nèi)切酶和dNTP購(gòu)自化KaRa公司；植酸鋼購(gòu)自Sigma公司；Fast MultiSite Mutagenesis System試劑盒購(gòu)自TRANSGEN BIOTECH公司，其它都為國(guó)產(chǎn)試劑 (均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到）。
[0031] 3、培養(yǎng)基：
[0032] LB培養(yǎng)基：PeptonelOg，化ast ex1:rac1:5g，化C1 lOg，加蒸饋水至 1000ml，pH=7。固 體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0 % (w/v)瓊脂。
[0033] YEPD培養(yǎng)基：Peptone20g，化ast extractlOg，glucose20g(單滅），加蒸饋水至 1000ml，pH=7。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0 % (w/v)瓊脂。
[0034] 酵母發(fā)酵培養(yǎng)基FA和FB購(gòu)自INV口R0GEN公司。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 本發(fā)明通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助手段比對(duì)替換了耐熱性高的煙曲霉植酸酶序列的無(wú)花果 曲霉植酸酶SEQ ID N0:4和無(wú)花果曲霉植酸酶氨基酸序列SEQ ID N0:3在分子動(dòng)力學(xué)模擬 過(guò)程中的氨鍵強(qiáng)弱作用，選取氨鍵作用加強(qiáng)的替換位點(diǎn)作為最終突變位點(diǎn)，即植酸酶突變 體SEQ ID N0:1。具體實(shí)施方案為利用分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件GR0MACS，在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓強(qiáng)下、 lOOmM化C1溶液體系分別模擬含SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4的蛋白結(jié)構(gòu)在50°C和70°C下 的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)50ns。利用gjiond模塊計(jì)算替換位點(diǎn)與互作氨基酸的氨鍵作用，最后選取氨鍵 作用相比于SEQ ID N0:3序列加強(qiáng)的替換位點(diǎn)作為最終突變位點(diǎn)。無(wú)花果曲霉(黑曲霉)植 酸酶氨基酸序列SEQ ID No:3中的氨基酸發(fā)生如下改變:第43位鄉(xiāng)氨酸變成絲氨酸、第46位 脯氨酸變?yōu)榻z氨酸、第169位谷氨酷胺變?yōu)樘K氨酸、第170位脯氨酸變?yōu)樘於岚?、?71位 甘氨酸變?yōu)榫彼?、?52位蘇氨酸變?yōu)榫彼帷⒌?55位鄉(xiāng)氨酸變?yōu)樘於彼?、?56位天 冬氨酸變?yōu)楸彼帷⒌?58位賴氨酸變?yōu)楣劝笨岚?V43S，P46S，Q169T，P170N，G171R，T252R, V25 抓，D256A，K258Q)。
[0037] 具體實(shí)施方案為W無(wú)花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因?yàn)槟０?，通過(guò)基因的點(diǎn)突變 方法，使無(wú)花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因發(fā)生突變，獲得了新的植酸酶基因的突變體SEQ ID 齡：2，將該突變基因與口口1〔91(或口口1〔9、口口1〔2日4\8\(：、口口1〔24\8\(：、口64口2日4\8\(：、口口1服 Hc\Lc相連構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115或^33、5101168、？1邸14?1服）中進(jìn)行表達(dá)， 發(fā)酵可W獲得該植酸酶突變體。該突變體能在中性環(huán)境中很好發(fā)生作用，并且具有較理想 耐熱特性，適合耐高溫制粒，因此特別適合于水產(chǎn)飼料添加劑。
[0038] 本發(fā)明植酸酶突變體的氨基酸序列SEQ ID No: 1;突變后無(wú)花果曲霉植酸酶核巧 酸序列SEQ ID No:2。
[0039] 實(shí)施例2，如圖1所示，一種植酸酶突變體的制備方法包括W下步驟：
[0040] S101:設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物F:-CTGGCAGTCCCTGCCTCGAGAA，R:- TAAGCAAAACACTCAGCCCAATC，無(wú)花果植酸酶連接到PMD19-T載體上的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行 突變PCR擴(kuò)增，PCR體系按照試劑盒說(shuō)明書配制50化；
[0041 ] PCR反應(yīng)參數(shù)為:94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30S，66 °C退火30s，72°C延伸3.5min， 共28個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸3.5min，共7個(gè)循環(huán)；72°C擴(kuò)增后延伸 1 Omin;其中從66°C到52°C每個(gè)循環(huán)溫度下降0.5°C。
[0042] S102:取lOiil PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶正確后加化1 DMT酶于PCR 產(chǎn)物中，混勻，37°C解育化;進(jìn)而進(jìn)行突變片段組裝，配制lOiil組裝體系與50°C反應(yīng)15min。
[0043] S103:轉(zhuǎn)化
[0044] ①加入lOiil突變組裝后的產(chǎn)物于50iil DMT感受態(tài)細(xì)胞中（在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍 時(shí)加入產(chǎn)物），輕彈混勻，冰浴30min;
[0045] ②42 °C準(zhǔn)確熱激45s，立即置于冰上1 Omin;
[0046] ③加500iilLB培養(yǎng)基，200轉(zhuǎn)，37 °C培養(yǎng)化；
[0047] ④7000巧m離屯、3min，棄掉部分上清，保留100-15化1，輕彈懸浮菌體，取全部菌液 涂板，培養(yǎng)過(guò)夜。
[004引S104:驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子，每個(gè)位點(diǎn)的陽(yáng)性克隆送出測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原序列比對(duì)， 找出突變正確的重組質(zhì)粒，再W突變一次質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行第二位點(diǎn)突變至止突變位點(diǎn) 全部突變掉。
[0049] 突變1位點(diǎn)引物為：
[0050] 1-F1：AATCGTCCATCTCCTCTGAGGTGCCAGCCGGATG
[0051 ] 1-R1：AGAGGAGATGGACGATTCGTTTGCCAGAGAGAAG
[0052] 突變2位點(diǎn)引物為：
[0053] 2-F1：TGAAGGATCCTCGTGCCACGCCCGGCCAATCGTCGCCAA
[0054] 2-R1：CCGTTCTGGGCACGAGGATCCTTCAGCTTGGTGCT
[0055] 2-F2：AAGGATCCTCGTGCCCAGAACGGCCAATCGTCGCCA
[0056] 2-R2：ATTGTCTGGGCTGGGCACGAGGATCCTTCAGCTTGGTG
[0057] 2-F3：ATCCTCGTGCCCAGCCCAGACAATCGTCGCCAAAGATCG
[0 化引 2-R3 ： GGGCGTGGCACGAGGATCCTTCAGCTTGGTGCTCTG
[0059] 突變3位點(diǎn)引物為：
[0060] 3-F1：CCTTCGACACCATCTCCAGAAGCACCGTCGACACCAAGC
[0061 ] 3-R1：GGTGGCGTCGGTGCTGGTGGAGATGGTGTCGAAGGAGC
[0062] 3-F2：ATCTCCACCAGCACCGACGCCACCAAGCTGTCCCCTTTC
[0063] 3-R2：GCTGGGTGTCGACGGTGCTGGTGGAGATGGTGTCGAA
[0064] 3-F3：CAGCACCGTCGACACCCAGCTGTCCCCTTTCTGTGAC [00化]3-R3:GCTTCTGGAGATGGTGTCGAAGGAGCACATGTCCATGAG
[0066] 設(shè)計(jì)連接引物（F: -GCTGAAGCTTACGTAGAATTCCTGGCAGTCCCTGCCTCGAGAA，R:- AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTAAGCAAAACACTCAGCCCAATC)，將突變后的植酸酶序列連接到酵 母菌表達(dá)載體ppic9k上，突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115來(lái)源于INV 口 R0GEN公司表達(dá)，發(fā) 酵測(cè)酶活。
[0067] 轉(zhuǎn)換載體PCR反應(yīng)參數(shù)為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性3〇3,55°(：退火305,72°(：延伸 1.5min，共30個(gè)循環(huán);72°C擴(kuò)增后延伸lOmin;
[0068] 其它畢赤酵母表達(dá)載體構(gòu)建及畢赤酵母轉(zhuǎn)化、篩選與發(fā)酵按相應(yīng)的畢赤酵母載體 與宿主菌株說(shuō)明書(來(lái)源于INV 口ROGEN公司)進(jìn)行。
[0069] 實(shí)施例3植酸酶活力測(cè)定
[0070] 3.1、儀器與設(shè)備
[0071] 恒溫水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、恒溫培養(yǎng)振蕩器、pH儀比色皿等。
[0072] 3.2、實(shí)驗(yàn)材料
[0073] 3.2.1、酶液
[0074] 突變植酸酶菌株發(fā)酵酶液(突變)、原模板植酸酶菌株發(fā)酵酶液(無(wú)花果）
[0075] 3.2.2、溶液配制
[0076] 3.2.2.1、緩沖液:具體參見(jiàn)2002年黃培德譯分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第=版
[0077] 0.25mol/L 甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH= 1.5-3.0)
[007引 0.25mol/L乙酸-乙酸鋼緩沖液(pH=3.5-6.5)
[0079] 0.25111〇1/1化13-化1緩沖液(抑=7.0-9.0)
[0080] 3.2.2.2、底物溶液:5mmol/L植酸鋼溶液
[0081 ] 稱取0.495g肌醇六憐酸鋼（C油6〇24P6Nai2)于100ml容量瓶中，用緩沖液定容至 100ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。配好后不要使底物溶液受熱，否則將影響測(cè)試結(jié)果。
[0082] 3.2.2.3、100g/L 鋼酸錠溶液
[0083] 取lOg鋼酸錠[(NH4)6Mo7024 ? 4此0]于100ml容量瓶中，加入1ml氨水(25%)，用雙 蒸水定容至100ml。
[0084] 3.2.2.4、硝酸溶液
[0085] 將濃硝酸與雙蒸水:2的比率配制
[0086] 3.2.2.5、2.35g/L 偏饑酸錠溶液
[0087] 取0.235g偏饑酸錠(NH4V03)于100ml棟色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(3. . 2.2.4)， 用雙蒸水定容至100ml。避光下可W保存一周。
[0088] 3.2.2.6、顏色終止液配制
[0089] 將鋼酸錠溶液(3.2.2.3)、偏饑酸錠溶液(3.2.2.5)與硝酸溶液(3.2.2.4) W1:1:2 的比率配制到相應(yīng)的用量，要緩慢加入硝酸溶液，終止液中不要有白色沉淀。注意終止液現(xiàn) 用現(xiàn)配。
[0090] 酶活定義：
[0091] 酶活定義為:樣品在溫度為37°C、pH=5.5條件下，每分鐘從濃度為5. Ommol/L植酸 鋼溶液中釋放1皿〇1無(wú)機(jī)憐，即為一個(gè)酶活性單位，WU表示(GB/T 18634-2009)。
[0092] 酶活測(cè)定方法:取lOmL試管，加入1.8mL緩沖液(3.2.2.1)，加入0.2ml待測(cè)酶液，混 合后預(yù)熱5min，依次加入底物(3.2.2.2)，加入底物時(shí)間間隔一致，混合后反應(yīng)30min，之后 依次加入終止液(3.2.2.6)，加入時(shí)間間隔和加入底物的時(shí)間間隔一致，混合后，冷卻1 Omin 在415nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。如果有沉淀應(yīng)先離屯、再測(cè)吸光值。對(duì)照組為先加入終止液后冷 卻至室溫再加入底物溶液。實(shí)驗(yàn)為一個(gè)對(duì)照組，=個(gè)平行試驗(yàn)。
[0093] (1)植酸酶抑適性和溫度適性的測(cè)定
[0094] ①植酸酶抑最適性測(cè)定
[00巧]將緩沖液(3.2.2.1)調(diào)成不同pH:2、3、4、5、6、7、8,9甘氨酸-鹽酸a.5-3.0)乙酸- 乙酸鋼(3.5-6.5)Tris-化l(7.0-9.0)不同抑的緩沖液溶解底物成不同抑，將酶液稀釋到合 適的倍數(shù)，依照上述的試驗(yàn)方法在37°C測(cè)出最適抑，之后在最大值兩側(cè)補(bǔ)半點(diǎn)繼續(xù)檢測(cè)最 適抑值(例如最適抑=5，則再取抑=4、4.5、5、5.5和6按照上述的方法檢測(cè)）。
[0096] ②植酸酶溫度最適性的測(cè)定
[0097] 依照上述的方法測(cè)定，在上述pH的條件下，將反應(yīng)物放在不同溫度下反應(yīng)：10°C、 20°C、30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C，測(cè)出最適溫度后，在最大值兩側(cè)補(bǔ)半點(diǎn)（例如最適 溫度是40°C，則補(bǔ)充30°C、35°C、40°C、45°C、50°C按照上述方法檢測(cè)）。
[009引③植酸酶抑耐受測(cè)定
[0099] 將緩沖液(3.2.2.1)調(diào)節(jié)到不同pH: 2、3、4、5、6、7、8，用運(yùn)些不同pH的緩沖液稀釋 酶液，從放入酶液之時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，稀釋好的酶液放入37°C水浴鍋中耐受1小時(shí)放在冰上，之 后立馬按照上述的方法在最適pH和最適溫度下進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)照組的酶液是未耐受過(guò)的酶 液。
[0100] ④植酸酶溫度耐受測(cè)定
[0101] 將酶液稀釋到相應(yīng)倍數(shù)，然后放入不同溫度：70°c、80°C、90°C耐受Imin、3min、 5min、lOmin、15min、20min、30min、60min、90min、120min、150min。之后按照上述方法在最適 pH和最適溫度下反應(yīng)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)組酶液是未溫度耐受過(guò)的酶液。
[0102] (2)結(jié)果與分析
[0103] ①無(wú)花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因突變，按上實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行突變后送華大基因 公司測(cè)序，結(jié)果如SEQ ID N0:2,對(duì)應(yīng)植酸酶氨基酸序列如SEQ ID NO: 1，轉(zhuǎn)化的酵母菌株具 有植酸酶活性，選取一株發(fā)酵酶活性單位高的菌株進(jìn)行發(fā)酵獲得酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定。
[0104] ②植酸酶最適抑測(cè)定
[0105] 植酸酶酶促反應(yīng)最適pH值結(jié)果如圖2所示。突變體與無(wú)花果植酸酶最適抑分別為 6.0、5.5;并且在2.5都有一個(gè)峰值，相對(duì)突變前無(wú)花果植酸酶，突變后的酶的最適抑提高了 0.5個(gè)單位，并且在中性環(huán)境下抑=7.0剩余接近50 %左右相對(duì)酶活，與突變之前有改進(jìn)。
[0106] ③植酸酶最適溫度測(cè)定
[0107] 植酸酶酶促反應(yīng)最適溫度值如圖3所示，突變和無(wú)花果植酸酶最適溫度為50°C ;突 變前后二者差異不明顯。
[0108] ④植酸酶酶促反應(yīng)中pH耐受
[0109] 由圖4可知，兩種植酸酶的pH耐受曲線趨勢(shì)是相同的，在pH = 2-9之間37°C耐受化 相對(duì)酶活并沒(méi)有太大變化，基本維持在60 % W上。
[0110] ⑤植酸酶溫度耐受
[0111] 高溫下植酸酶的溫度耐受情況如圖5-7所示，隨著溫度的升高，相對(duì)酶活不斷降 低，隨著時(shí)間的增加，相對(duì)酶活也逐漸降低。無(wú)論在任何溫度和時(shí)間下，突變后的相對(duì)酶活 都高于突變前的，在70°C耐受化突變植酸酶相對(duì)酶活大約還有65%，而突變之前無(wú)花果植 酸酶僅僅剩余35%，突變植酸酶耐受化才降到半衰期W下。在80°C時(shí)突變后植酸酶相對(duì)酶 活剩余一半時(shí)的時(shí)間大約為60min，而突變前耐受15min就達(dá)到半衰期了。高溫90°C時(shí)耐受 30min突變后植酸酶相對(duì)酶活還剩余接近55%，突變前僅僅剩余25%，總之突變后與突變前 相比溫度耐受相對(duì)提高了30%。
[0112] 本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可W理解，除非另外定義，運(yùn)里使用的所有術(shù)語(yǔ)(包括技術(shù)術(shù) 語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ))具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該 理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語(yǔ)應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意 義一致的意義，并且除非像運(yùn)里一樣定義，不會(huì)用理想化或過(guò)于正式的含義來(lái)解釋。
[0113] 最后所應(yīng)說(shuō)明的是：W上實(shí)施例僅用W說(shuō)明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參 照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解:依然可W對(duì)本 發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均 應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種植酸酶突變體，其特征在于，所述植酸酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID N〇:l所 不。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述植酸酶突變體，其特征在于，所述植酸酶突變體由編碼無(wú)花果曲 霉植酸酶氨基酸序列SEQ ID No:3中第43位纈氨酸變成絲氨酸、第46位脯氨酸變?yōu)榻z氨酸、 第169位谷氨酰胺變?yōu)樘K氨酸、第170位脯氨酸變?yōu)樘於０贰⒌?71位甘氨酸變?yōu)榫彼帷?第252位蘇氨酸變?yōu)榫彼?、?55位纈氨酸變?yōu)樘於彼?、?56位天冬氨酸變?yōu)楸彼帷?第258位賴氨酸變?yōu)楣劝滨０范@得。3. 編碼權(quán)利要求1所述植酸酶突變體的編碼基因，其特征在于，所基因的核苷酸序列如 SEQIDNo:2**。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述植酸酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟包括： (1) 、無(wú)花果植酸酶基因連接到PMD19-T載體上的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行突變 PCR擴(kuò)增;產(chǎn)物電泳檢測(cè)，條帶正確后加 lylDMT酶于PCR產(chǎn)物中，混勻，37°C孵育lh;進(jìn)而進(jìn)行 突變片段組裝，配制1〇μ1組裝體系與50°C反應(yīng)15min; (2) 、加入10μ1突變組裝后的產(chǎn)物于50μ1 DMT感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min;42°C準(zhǔn) 確熱激45s，立即置于冰上lOmin;加500ylLB培養(yǎng)基，200轉(zhuǎn)、37°C培養(yǎng)lh;7000rpm離心3min， 棄上清，保留100-150μ1，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，培養(yǎng)過(guò)夜； (3) 、每個(gè)位點(diǎn)的陽(yáng)性克隆送出測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原序列比對(duì)，找出突變正確的重組質(zhì) 粒，再以突變一次質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行第二位點(diǎn)突變至止突變位點(diǎn)全部突變掉； (4) 設(shè)計(jì)連接引物，將突變后的植酸酶序列連接到酵母菌表達(dá)載體ppic9k上，突變后的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115或X33、SMD1168、PICHIAPINK中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)酵測(cè)酶活，研究酶學(xué)及 應(yīng)用特性。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述植酸酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述突變 PCR條件為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性3〇8、66°(：退火3〇8、72°(：延伸2.51^11，共28個(gè)循環(huán)；94 。(:變性30s，52°C退火30s，72°C延伸2.5min，共7個(gè)循環(huán);72°C擴(kuò)增后延伸lOmin;其中從66°C 到52°C每個(gè)循環(huán)溫度下降0.5°C。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述植酸酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述轉(zhuǎn)換載 體PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 °C預(yù)變性5min; 94 °C變性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸1.5min，共30個(gè) 循環(huán);72°C擴(kuò)增后延伸lOmin。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述植酸酶突變體在飼料添加劑中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述植酸酶突變體在水產(chǎn)飼料添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK106047836SQ201610421861
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日
【發(fā)明人】黃遵錫, 韓楠玉, 苗華彪
【申請(qǐng)人】昆明愛(ài)科特生物科技有限公司