一種具有高麥芽糖生成率的真菌α?淀粉酶變體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有高麥芽糖生成率的真菌α?淀粉酶變體及其制備方法，所述α?淀粉酶變體在對應于SEQ ID NO：2所示區(qū)域77?81區(qū)、135?140區(qū)、214?220區(qū)、331?335區(qū)的一個或多個區(qū)域和/或位置的取代，所述變體具有α?淀粉酶活性。本發(fā)明提供了一種具有高麥芽糖生成率的真菌α?淀粉酶變體，與親本真菌α?淀粉酶相比，本發(fā)明提供的一種真菌α?淀粉酶變體的淀粉水解物中麥芽糖含量提高了約5％，在高麥芽糖漿的工業(yè)化生產(chǎn)中具有應用優(yōu)勢。
【專利說明】
-種具有高麥芽糖生成率的真菌a-淀粉酶變體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設及一種具有高麥芽糖生成率的真菌a-淀粉酶 變體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 高麥芽糖漿是一種W麥芽糖為主(通常含量巧0%)的淀粉糖，在食品和飲料行業(yè) 具有廣泛的應用。在現(xiàn)代淀粉糖行業(yè)，高麥芽糖漿主要采用酶轉(zhuǎn)化淀粉工藝進行生產(chǎn)。隨著 糖化工藝的改進，真菌a-淀粉酶已逐漸替代e-淀粉酶做為糖化劑用于高麥芽糖漿的生產(chǎn)， 成為高麥芽糖漿生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵酶制劑。真菌a-淀粉酶之所W能夠替代相對昂貴的e-淀 粉酶，是因其具有特殊的產(chǎn)物生成能力一一高麥芽糖生成能力。高麥芽糖漿品質(zhì)的高低依 據(jù)糖漿中麥芽糖的含量而定，因此，在高麥芽糖漿的工業(yè)生產(chǎn)過程中，真菌a-淀粉酶催化水 解淀粉所生成的終產(chǎn)物中麥芽糖濃度的高低是評價其應用性能的一個重要特征指標。
[0003] 因此，提高真菌a-淀粉酶的高麥芽糖生成能力，對真菌a-淀粉酶在高麥芽糖漿的 工業(yè)生產(chǎn)過程中的應用是有利的。
[0004] 真菌a-淀粉酶化C 3.2.1.1)晶體結(jié)構(gòu)模型研究表明，該淀粉酶家族蛋白通常含有 4個保守區(qū)域(Region I-VI)和3個功能性結(jié)構(gòu)域(Functional Domains),分別為A、B和CoA 為酶的催化反應中屯、區(qū)域，其典型結(jié)構(gòu)為(a/e)8TIM-桶狀結(jié)構(gòu);B位于TIM-桶狀結(jié)構(gòu)的第3 個e-折疊和第3個a-螺旋之間，與a-淀粉酶的底物特異性有關(guān);C形成a-淀粉酶蛋白質(zhì)的簇 基端，并含有a-淀粉酶家族所特有的希臘鑰匙狀e-Sandwich結(jié)構(gòu)，一般認為其通過結(jié)構(gòu)域A 的疏水區(qū)域與溶劑相隔離W穩(wěn)定催化區(qū)域的TIM-桶狀結(jié)構(gòu)。通過X-射線晶體結(jié)構(gòu)、化學修 飾和定點突變等研究，發(fā)現(xiàn)Asp206，Glu230和Asp297等3個氨基酸可能是化ka-淀粉酶及a- 淀粉酶家族的核屯、催化位點。在水解替換反應中，認為Glu230是質(zhì)子供體，Asp206具有親質(zhì) 子作用，Asp297在催化過程中可能對酶和底物復合物的結(jié)合狀態(tài)起穩(wěn)定作用（fixer)。此 夕h Q-淀粉酶的活性位點還包含許多亞位點（Subsites )，亞位點由位于連接0-折疊和a-螺 旋環(huán)型結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基組成，且每個亞位點均可W與底物的糖基配基進行作用。由于 不同a-淀粉酶的結(jié)構(gòu)不同，e-折疊和a-螺旋的連接環(huán)的大小和形狀不同，所W亞位點在不 同淀粉酶中的存在形式和作用方式也不同，并因此賦予了不同淀粉酶W特有的功能和性質(zhì) (Nielsen JE,Borchert TV. Protein engineering of bacterial alpha- am}dases .Biochim Bio地ys Acta,2000,1543(2): 253-274)，由此推測真菌a-淀粉酶的高 麥芽糖生成能力極可能是由其亞位點結(jié)構(gòu)決定的。雖然有關(guān)a-淀粉酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研 究在酶催化效率、熱/酸/堿穩(wěn)定性及底物特異性等方面有很多報道，如江南大學楊海泉、陳 堅等（Yang H, Liu L , Shin H-d,et al. Integrating terminal truncation and oligopeptide fusion for a novel protein engineering strategy to improve specific activity and catalytic efficiency:alkaline alpha-amylase as a case s1:udy.A卵 1 Environ Microbiol ,2013,79(20) :6429-6438)運用生物信息學分析結(jié)合蛋白 質(zhì)S級結(jié)構(gòu)建模，對Alkalimonas曰11171〇171:;[。曰堿性0-淀粉酶催化活性中屯、的甲硫氨酸進 行組合突變并確定了與熱穩(wěn)定性、催化效率或堿穩(wěn)定性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸，中國農(nóng)業(yè)大學 韓鵬、江正強等化an P,Zhou P,Hu SQ,et al.A novel multifunctionala-am}dase from the thermophilic fungus M曰Ibr曰nche曰 cinn曰mome曰：Biochemic曰1 ch曰r曰cteriz曰tion and three-dimensional structure.Appl Biochem Biotechnol,2013,170:420-435.)對 Ma化ranchea cinnamomeaa-淀粉酶的催化功能及其S維結(jié)構(gòu)進行了大量研究，但是關(guān)于a- 淀粉酶結(jié)構(gòu)與其高麥芽糖生成能力之間關(guān)系的研究則鮮有報道。
[0005] 目前工業(yè)應用及專利公開的主要是曲霉屬，尤其是米曲霉a-淀粉酶。諾維信公司 的一篇專利"Fungamyl樣a-淀粉酶變體"（專利公開號:CN1654641A)公開了一種用于產(chǎn)生親 本化ngamyl樣a-淀粉酶的a-淀粉酶變體，該淀粉酶來源于米曲霉，該淀粉酶變體相對于親 本提高了熱穩(wěn)定性，但并未設及提高真菌a-淀粉酶麥芽糖生成率的方法。
[0006] 目前工業(yè)應用及專利公開的真菌a-淀粉酶主要來源于曲霉屬，尤其是米曲霉或黑 曲霉。米曲霉或黑曲霉a-淀粉酶作用淀粉的終產(chǎn)物中麥芽糖含量極限值約為60% (w/w)左 右，工業(yè)應用中麥芽糖生成率一般在40%~45%之間，具有麥芽糖生成率相對較低的特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 根據(jù)W上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提出一種具有高麥芽糖 生成率的真菌a-淀粉酶變體及其制備方法，結(jié)合生物信息學、基因工程和蛋白質(zhì)工程等技 術(shù)手段，獲得了真菌來源的親本a-淀粉酶的a-淀粉酶變體，目的是使淀粉水解物中的麥芽 糖含量提高。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種具有高麥芽糖生成率的真菌a-淀粉酶變體，所述a-淀粉酶變體在對應于SEQ ID NO:2所示區(qū)域77-81區(qū)、135-140區(qū)、214-220區(qū)、331-335區(qū)的一個或多個區(qū)域和/或位置 的取代，所述變體具有a-淀粉酶活性。
[0010] 所述真菌a-淀粉酶得自絲狀真菌，所述絲狀真菌為根霉屬的米根霉。
[0011] 所述真菌a-淀粉酶變體為選自一種親本真菌a-淀粉酶的變體，所述親本真菌a-淀 粉酶與SEQ ID NO: 1所示編碼a-淀粉酶的DNA序列和/或SEQ ID NO:2所示成熟蛋白質(zhì)所含 氨基酸序列至少有75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%的同一性或 相似性。
[0012] 所述具有高麥芽糖生成率的真菌a-淀粉酶變體的制備方法，所述制備方法包括如 下步驟：
[0013] a、W編碼SEQ ID N0:2所示親本真菌a-淀粉酶成熟蛋白質(zhì)的DNA序列模板，依據(jù)原 氨基酸和替換氨基酸對應的遺傳密碼的差別設計引物，通過PCR擴增方法對所述DNA序列引 入突變，達到對親本真菌a-淀粉酶的定點突變;將得到的PCR產(chǎn)物連接入克隆載體PMD18- 3；[1]1口16，并轉(zhuǎn)化6.(3〇1;[廁109，抽提質(zhì)粒并對插入的0魁片段進行序列測定，^獲得陽性重 組子；
[0014] b、將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒、重組表達質(zhì)粒載體導入受體菌感受 態(tài)細胞和抽提所述導入受體菌感受態(tài)細胞得到的重組質(zhì)粒并導入表達宿主感受態(tài)細胞，獲 得攜帶a-淀粉酶變體編碼基因的重組宿主細胞；
[0015] C、將重組宿主細胞經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和低溫誘導表達獲得發(fā)酵細胞液；
[0016] d、離屯、收集發(fā)酵細胞液中的細胞，并經(jīng)過超聲破碎、硫酸錠沉淀、透析及親和層析 得到。
[0017] 所述原氨基酸指SEQ ID N0:2所述親本真菌a-淀粉酶中待突變或被替換的氨基 酸。
[0018] 所述替換氨基酸指在a-淀粉酶突變體中取代原氨基酸的氨基酸。
[0019] 所述遺傳密碼指核巧酸序列中編碼蛋白質(zhì)中對應氨基酸的=聯(lián)密碼子，
[0020] 所述陽性重組子指包含按設計在既定位置發(fā)生堿基變化的DNA序列的E.coli重組 困。
[0021] 所述宿主細胞為革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陰性細菌優(yōu)選為大腸桿菌。
[0022] 真菌a-淀粉酶變體的制備:抽提上述陽性重組子中的質(zhì)粒DNA，使用限制性核酸內(nèi) 切酶EcoRI和Notl進行雙酶切并與同等雙酶切的表達型質(zhì)粒載體pET-28a( + )相連接，利用 化學轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物導入受體菌E. coli JM109感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒祀T-Roamy，抽 提該重組質(zhì)粒并導入表達宿主菌E.coli化21感受態(tài)細胞，獲得攜帶a-淀粉酶變體編碼基 因的重組大腸桿菌。上述重組大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和低溫誘導表達后獲得發(fā)酵細胞液。離 屯、收集上述細胞液中的細胞并采用超聲波破碎法進行破碎，細胞破碎液中a-淀粉酶經(jīng)過硫 酸錠沉淀、透析及親和層析等步驟得W純化，即得到含有a-淀粉酶變體的酶液，進一步測定 曰-淀粉酶活力及淀粉酶解產(chǎn)物。
[0023] 所述感受態(tài)細胞采用氯化巧法制得。
[0024] 所述發(fā)酵培養(yǎng)指搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，具體為重組大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2地，培養(yǎng) 溫度為28~37°C，在恒溫搖床中培養(yǎng)時轉(zhuǎn)速為20化pm。
[00巧]所述搖瓶發(fā)酵采用250mLS角瓶，裝液量為30%。
[0026] 所述LB培養(yǎng)基成分為每L含有酵母膏5g，蛋白腺lOg，氯化鋼lOg，氨節(jié)青霉素鋼 120mg，pH為7.0。
[0027] 所述誘導表達指重組大腸桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中的光密度值達到1.2~1.6時，向 發(fā)酵液中加入異丙基-e-D-硫代半乳糖巧（IPTG)至終濃度為0.5mmol/L，W起始質(zhì)粒pET- Roamy中強啟動子的功能，從而實現(xiàn)a -淀粉酶的表達。
[0028] 所述低溫誘導表達指加入IPTG后將培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)至28°C，減慢菌體的生長或代謝 速率，利于異源蛋白質(zhì)的可溶性表達。
[0029] 所述強啟動子指載體祀T-28a( + )存在的T7啟動子，該啟動子在無葡萄糖而有乳糖 或乳糖結(jié)構(gòu)類似物(IPTG)誘導的情況下處于開啟狀態(tài)，可W起始其下游基因的轉(zhuǎn)錄活動。
[0030] 所述超聲波破碎采用功率為400W，破碎時間為lOmin，使用冰水控制環(huán)境溫度為0 r。
[0031] 所述硫酸錠沉淀指硫酸錠分級沉淀，本發(fā)明采用終濃度為75%的硫酸錠進行沉 淀。
[0032] 所述透析指使用透析袋將硫酸錠的酶蛋白在4°C的去離子水中透析2地。
[0033] 所述親和層析指利用M親和柱對淀粉酶蛋白進行純化，純化條件為:結(jié)合緩沖液 (A液）為：20mmol/L lYis.pH 8.0,0.5mol/L 化Cl，l%(v/v)Triton X-100，10%(w/v)甘 油，lOmmo 1/U3-琉基乙醇；洗脫緩沖液(B液）為A液加200mmo 1/L咪挫。使用20 %~100 %B液 的線性梯度洗脫10個柱體積，流速為ImL/min。
[0034] 所述a-淀粉酶活力測定方法為：取ImL可溶性淀粉（1 %，w/v)與0.25mL巧樣酸- 化抽P〇4緩沖液（0.2mol/L，抑5.0)混合，50°C溫浴5min后加入0.1 mLa-淀粉酶液，繼續(xù)保溫 lOmin后立即加入0.1 mL肥1溶液(0.1mol/L)終止反應，加入3血DNS試劑沸水浴lOmin，冷卻 后加水稀釋至25mL，測定520nm處吸光值。一個a-淀粉酶酶活單位化)定義為:在上述反應條 件下，每分鐘生成Img麥芽糖所需的酶量。
[0035] 所述淀粉酶解產(chǎn)物的測定方法為:使用巧樣酸-化抽P化緩沖液(0.2mol/L，抑5.0) 緩沖液配制可溶性淀粉溶液（1 %，w/v)，在ImL淀粉溶液中加入0.2mL酶液（10U)，并在40°C 下反應，取不同保溫時間的樣品使用高壓液相色譜化PLC)方法進行產(chǎn)物分析。HPLC方法測 定條件:使用Agi lent氨基柱(Z0RBAX NH2，4.6 X 250mm，5皿)檢測，W65%乙臘為流動相，流 速為ImL/min，柱溫為40 °C。
[0036] 所述變體為R333H，所述引物如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0037] 所述變體為R333化Y8化，所述引物如沈Q ID NO.5和沈Q ID NO.6所示。
[0038] 本發(fā)明有益效果是:本發(fā)明提供了一種具有高麥芽糖生成率的真菌a-淀粉酶變 體，與親本真菌a-淀粉酶相比，本發(fā)明提供的一種真菌a-淀粉酶變體的淀粉水解物中麥芽 糖含量提高了約5 %，在高麥芽糖漿的工業(yè)化生產(chǎn)中具有應用優(yōu)勢。
【具體實施方式】
[0039] 下面通過對實施例的描述，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，W幫助本領(lǐng)域技術(shù)人 員對本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思、技術(shù)方案有更完整、準確和深入的理解。
[0040] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0041 ]改變真菌a-淀粉酶麥芽糖生成率需要突變的位點
[0042] W米曲霉a-淀粉酶TAA(Yoshiki M.A possible mechanism of catalysis involving three essential residues in the enzymes of曰-amylase family.Biologia.Bratislava,2002,57( 11): 21-27)為模板建立親本真菌a-淀粉酶的分子 結(jié)構(gòu)模型，利用分子動力學模擬和分子對接等生物信息學分析手段(Bin化ng，Yingying Zhang,Yaping Yang,Zhewei Song,Xianglin Li.Expression and functional analysis of a glycoside hydrolase family 45endog 1 ucanase from Rhizopus stolonifer.World J Microbiol Biotechnol,2014,30:2943-2952)分別對真菌a-淀粉酶 的親本a-淀粉酶和變體與底物的對接方式進行模擬，根據(jù)酶與底物對接過程中的空間堆積 效果和氨鍵作用方式的變化，發(fā)現(xiàn)適合突變的區(qū)域，獲得具體的提高真菌a-淀粉酶麥芽糖 生成率的突變區(qū)域為：
[0043] 77-81區(qū)
[0044] 135-140 區(qū)
[0045] 214-220區(qū)
[0046] 331-335區(qū)
[0047] 上述區(qū)域為SEQ ID N0:2所示的親本真菌a-淀粉酶成熟蛋白質(zhì)所含氨基酸殘基所 在區(qū)域，為真菌a-淀粉酶內(nèi)在空間結(jié)構(gòu)上靠近催化中屯、、與催化或底物結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵氨 基酸殘基所在區(qū)域，區(qū)域內(nèi)氨基酸殘基的變化可W引起酶分子與底物對接方式的改變。
[0048] 本發(fā)明設及上述區(qū)域和/或位置的一個或多個氨基酸殘基的變化。
[0049] 在一個實施方案中，選擇的突變區(qū)域為77-81區(qū)，具體為一或多個該區(qū)域內(nèi)氨基酸 的位置:77,78,79,80,81。
[0050] 具體的替換是：
[0化1] 77R，L
[0化2] 78X，優(yōu)選L，I，Y;
[0053] 79L，E，W;
[0化4] 80I，S，L，D，R，H，優(yōu)選 L，D，H;
[0化5] 81X，優(yōu)選H，E，V。
[0056] 在一個實施方案中，選擇的突變區(qū)域為135-140區(qū)，具體為一或多個該區(qū)域內(nèi)氨基 酸的位置:135,136，137,138,139,140。
[0057] 具體的替換是：
[0化引 135D，S，Q;
[0059] 136R，H，T;
[0060] 137X，優(yōu)選E，H，L
[0061] 138T，K，V;
[0062] 139T，Q，V，R;
[0063] 140X，優(yōu)選S，L，X，H。
[0064] 在一個實施方案中，選擇的突變區(qū)域為214-220區(qū)，具體為一或多個該區(qū)域內(nèi)氨基 酸的位置:214,215，216,217,218,219,220。
[0065] 具體的替換是：
[0066] 2141，1'，6,9,5,0，優(yōu)選1'，5,0;
[0067] 215S，T，R;
[006引 216X，優(yōu)選L，R，S;
[0069] 217T，S，L，N，D，優(yōu)選S，L，N;
[0070] 218N，H，R;
[0071] 219R，W，E;
[0072] 220L，H，D。
[0073] 在一個實施方案中，選擇的突變區(qū)域為331-335區(qū)，具體為一或多個該區(qū)域內(nèi)氨基 酸的位置：331,332，333,334,335。
[0074] 具體的替換是：
[0075] 331Q，D，R;
[0076] 332Q，D，H;
[0077] 333L，H，E，V，A，優(yōu)選 H，E，V;
[007 引 334X，優(yōu)選S，H，Q，L
[0079] 335I，S，D，R，H，W，l4iU&S，R，L。
[0080] 所述氨基酸殘基指a-淀粉酶分子中去除形成膚鍵部分的氨基酸結(jié)構(gòu)。
[0081] 對上述實施方案的進一步描述:所述位置指氨基酸在序列SEQ ID NO:2中所在位 置，例如77,指序列SEQ ID N0:2中77位點的酪氨酸(Tyr);例如77R，也可W表示為Y77R，L表 示77位點的酪氨酸被精氨酸或亮氨酸取代;例如78X，也可W表示為H78X，指78位點的氨基 酸可W是G，A，V，L，I，S，T，C，M，D，E，N，Q，K，R，H，P，F(xiàn)，Y，W中的任一個;實施方案中的其它氨 基酸位點描述與此處氨基酸位點舉例描述具有相同意義。
[0082] 所述底物包括麥芽糖、麥芽=糖或短鏈糊精(含有10-15個葡糖糖單元結(jié)構(gòu)），具體 為麥芽S糖，據(jù)文獻報道推測真菌a-淀粉酶對麥芽S糖表現(xiàn)的特殊催化形式和水解能力可 能是其具有高麥芽糖生成能力的主要原因 （Doyle EM，Kelly CT，F(xiàn)ogady歷.The high maltose-producing曰-amylase of PeniciIlium expansum.Appl Microbiol Biotechnol, 1989,30(5):492-496)0
[0083] 所述親本真菌a-淀粉酶與SEQ ID NO:1所示編碼a-淀粉酶的DM序列和/或SEQ ID N0:2所示成熟蛋白質(zhì)所含氨基酸序列至少有75%，優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選 至少95%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少99%的同一性或相似性。
[0084] 所述同一性或相似性指DNA序列和/或氨基酸序列在進行兩兩比對時所具有的接 近或相似程度，可W利用現(xiàn)有的計算機軟件，如DNAMAN(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller， W.,Myers,E.W.,and Lipman,D.J.Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol., 1990,215: 403)和/或BioEdit(Hall,T.A.BioEdit:a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucl Acids Symp Ser, 1999,41:95-98)進行分析。
[0085] 親本真菌a-淀粉酶的突變
[0086] W編碼SEQ ID N0:2所示親本真菌a-淀粉酶成熟蛋白質(zhì)的DNA序列模板，依據(jù)原氨 基酸和替換氨基酸對應的遺傳密碼的差別設計引物，通過PCR技術(shù)對上述DNA序列引入突 變，從而達到對親本真菌a-淀粉酶的定點突變。將得到的PCR產(chǎn)物連接入克隆載體pMD 18- 3；[1]1口16，并轉(zhuǎn)化6.(3〇1;[廁109，抽提質(zhì)粒并對插入的0魁片段進行序列測定，^獲得陽性重 組子。
[0087] 真菌a-淀粉酶變體的制備
[0088] 抽提上述陽性重組子中的質(zhì)粒DNA，使用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和Notl進行雙酶 切并與同等雙酶切的表達型質(zhì)粒載體祀T-28a( + )相連接，利用化學轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物導入 受體菌E. coli JM109感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒祀T-Roamy，抽提該重組質(zhì)粒并導入表達宿 主菌E. coli化21感受態(tài)細胞，獲得攜帶a-淀粉酶變體編碼基因的重組大腸桿菌。上述重組 大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和低溫誘導表達后獲得發(fā)酵細胞液。離屯、收集上述細胞液中的細胞并 采用超聲波破碎法進行破碎，細胞破碎液中a-淀粉酶經(jīng)過硫酸錠沉淀、透析及親和層析等 步驟得W純化，即得到含有a-淀粉酶變體的酶液，進一步測定a-淀粉酶活力及淀粉酶解產(chǎn) 物。
[0089] 具體實施例如下：
[0090] 實施例1
[0091 ]親本真菌a-淀粉酶基因克隆
[0092]采用常規(guī)DNA克隆技術(shù)(薩姆布魯克J，弗里奇E F.分子克隆實驗指南(第二版）.金 冬雁，黎孟楓，侯云德，等譯.北京:科學出版社，1998 )，提取根霉屬，具體為米根霉F0071總 RNA，利用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)克隆得到親本a-淀粉酶編碼基因的cDNA，將該cDNA序列連接入pMD 18- simple載體，于16°C下反應4h后通過氯化巧轉(zhuǎn)化法導入E.coli JM109感受態(tài)細胞，使用抗 性LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子并獲得重組質(zhì)粒。抽提重組質(zhì)粒并委托生工生物工程(上海)股份 有限公司完成目的基因的序列測定，測定得到親本米根霉a-淀粉酶編碼基因序列為SEQ ID NO.l。
[0093] 將親本米根霉a-淀粉酶編碼基因序列（SEQ ID NO. 1)導入生物信息學分析軟件 DNAMAN進行蛋白質(zhì)翻譯分析獲得其所編碼多膚鏈的氨基酸序列SEQ ID NO. 2。利用生物信 息分析軟件Si即alP 4. IServer(ht1:p: //www. cbs. d1:u.化/services/SignalP/)在線分析 多膚鏈序列SEQ ID NO.2,顯示該多膚的-20~0區(qū)為蛋白質(zhì)信號膚區(qū)，后1~442區(qū)為成熟膚 區(qū)。
[0094] 實施例2
[00巧]變體R333H的構(gòu)建
[0096] W序列SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所述親本米根霉a-淀粉酶信息為基礎(chǔ)，通過引 物設計將Y的密碼子替換為L密碼子，使用市售的定點突變試劑盒，按照生產(chǎn)廠商(上海碧云 天生物技術(shù)有限公司）提供的使用說明進行突變，W構(gòu)建如序列SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示米根霉a-淀粉酶的變體。
[0097] 親本米根霉a-淀粉酶編碼基因已在重組質(zhì)粒祀T-Roamy中，W重組質(zhì)粒祀T-Roamy 為模板，使用Pfu DM聚合酶及引物1(SEQ ID NO.3)和引物2(SEQ ID NO.4)進行PCR擴增。 [009引 引物1:5'-GTAACGATCCAAACAACCACGAGGTCTTATGGACC-3'
[0099] 引物2:5'-GGTCCATAAGACCTCGTGGTTGTTTGGATCGTTAC-3'
[0100] PCR產(chǎn)物使用甲基化酶化nl消化后倒入E.coli D冊a超級感受態(tài)細胞(按上海碧云 天生物技術(shù)有限公司提供的試劑和方法制備）。抽提陽性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒并測序，驗證 已導入突變。
[0101] 進一步將導入突變的重組質(zhì)粒導入E.coli BL2UDE3)進行誘導表達，測定a-淀粉 酶變體的淀粉酶活力及淀粉水解產(chǎn)物。
[0102] 實施例3
[0103] 變體R333化Y8化的構(gòu)建
[0104] 變體R333化Y8化表示在親本米根霉a-淀粉酶中同時含有R333H突變和Y8化突變。
[0105] W實施例2中獲得的含有變體R333H的重組質(zhì)粒為模板，使用引物3(SEQ ID N0.5) 和引物4(SEQ ID NO. 6)，參照變體R333H構(gòu)建過程，在變體R333H中進一步引入Y8化突變，獲 得變體R333化Y8化。
[0106] 引物3:5' -GGAGGTTACCATGGCTTGTGGGCTTCTGACTTTTC-3'
[0107] 引物4:5' -GAAAAGTCAGAAGCCCACAAGCCATGGTAACCTCC-3'
[0108] 變體R333H+Y80L經(jīng)測序正確后在E.coli BL2UDE3)得到異源表達，測定變體 R333化Y8化的淀粉酶活力及淀粉水解產(chǎn)物，如下表所示：
[0inol
[0110] 表中G1~G7分別表示葡萄糖、麥芽糖、麥芽S糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和 麥芽屯糖;ND表示在所使用的檢測條件下沒有檢測到相應物質(zhì)。
[0111] 如表所示，結(jié)果表明與親本a-淀粉酶(Roamy)相比，變體R333H和R333化Y8化的淀 粉水解產(chǎn)物中麥芽糖含量分別提高了 3%和5%，而其它副產(chǎn)物如葡萄糖、麥芽=糖和麥芽 四糖的濃度均有所下降，所得變體在高麥芽糖漿的工業(yè)化生產(chǎn)中應更具有應用優(yōu)勢。
[0112] 上面對本發(fā)明進行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式的限制， 只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進行的各種非實質(zhì)性的改進，或未經(jīng)改進將本發(fā) 明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護 范圍應該W權(quán)利要求書所限定的保護范圍為準。
【主權(quán)項】
1. 一種具有高麥芽糖生成率的真菌α-淀粉酶變體，其特征在于，所述α-淀粉酶變體在 對應于SEQ ID Ν0:2所示區(qū)域77-81區(qū)、135-140區(qū)、214-220區(qū)、331-335區(qū)的一個或多個區(qū) 域和/或位置的取代，所述變體具有淀粉酶活性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有高麥芽糖生成率的真菌α-淀粉酶變體，其特征在于，所述真 菌α_淀粉酶得自絲狀真菌，所述絲狀真菌為根霉屬的米根霉。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有高麥芽糖生成率的真菌α-淀粉酶變體，其特征在于，所述真 菌α_淀粉酶變體為選自一種親本真菌α-淀粉酶的變體，所述親本真菌α-淀粉酶與SEQ ID ΝΟ:1所示編碼α-淀粉酶的DNA序列和/或SEQ ID NO:2所示成熟蛋白質(zhì)所含氨基酸序列至少 有75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%的同一性或相似性。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有高麥芽糖生成率的真菌α_淀粉酶變體的制備方法，其特征 在于，所述制備方法包括如下步驟： a、 以編碼SEQ ID NO: 2所示親本真菌α-淀粉酶成熟蛋白質(zhì)的DNA序列模板，依據(jù)原氨基 酸和替換氨基酸對應的遺傳密碼的差別設計引物，通過PCR擴增方法對所述DNA序列引入突 變，達到對親本真菌α-淀粉酶的定點突變； b、 將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒、重組表達質(zhì)粒載體導入受體菌感受態(tài)細 胞和抽提所述導入受體菌感受態(tài)細胞得到的重組質(zhì)粒并導入表達宿主感受態(tài)細胞，獲得攜 帶α_淀粉酶變體編碼基因的重組宿主細胞； c、 將重組宿主細胞經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和低溫誘導表達獲得發(fā)酵細胞液； d、 離心收集發(fā)酵細胞液中的細胞，并經(jīng)過超聲破碎、硫酸銨沉淀、透析及親和層析得 到。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述具有高麥芽糖生成率的真菌α-淀粉酶變體的制備方法，其特征 在于，所述宿主細胞為革蘭氏陰性細菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述具有高麥芽糖生成率的真菌α-淀粉酶變體的制備方法，其特征 在于，所述感受態(tài)細胞采用氯化鈣法制得。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述具有高麥芽糖生成率的真菌α-淀粉酶變體的制備方法，其特征 在于，發(fā)酵培養(yǎng)指搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，所述重組大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28~37 °C，在恒溫搖床中培養(yǎng)時轉(zhuǎn)速為200rpm。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述具有高麥芽糖生成率的真菌α-淀粉酶變體的制備方法，其特征 在于，所述變體為R333H，所述引物如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述具有高麥芽糖生成率的真菌α-淀粉酶變體的制備方法，其特征 在于，所述變體為R333H+Y80L，所述引物如SEQIDN0.5和SEQIDN0.6所示。
【文檔編號】C12N15/70GK106047844SQ201610619242
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月1日
【發(fā)明人】李松, 湯斌, 楊倩, 田芳源, 陳阿娜, 湯文晶, 葛飛, 魏勝華, 陶玉貴
【申請人】安徽工程大學