一種乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶的方法：將乙二胺四乙酸二酸酐和草酸脫羧酶溶入磷酸鹽緩沖液中，攪拌反應1h?24h；反應結(jié)束后，將反應產(chǎn)物進行透析，然后進行濃縮，獲得乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶。本發(fā)明直接采用乙二胺四乙酸二酸酐對草酸脫羧酶進行化學修飾，條件溫和、操作簡單、成本較低；修飾后的草酸脫羧酶的熱穩(wěn)定性、耐熱性、pH適應性、對胰蛋白酶的耐受性都有所增強；特別是提高了草酸脫羧酶在草酸鈣晶體上的吸附能力；解決了草酸脫羧酶在應用中存在受胃酸、胃蛋白酶影響，而容易失去活性的問題；還解決了在實際應用中酶制劑中酶蛋白面臨易被稀釋流失的現(xiàn)實問題。
【專利說明】
-種乙二胺四乙酸二酸野修飾草酸脫錢酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，特別是提供了一種乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇 酶的方法及所獲得的修飾草酸脫簇酶和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 草酸脫簇酶(Oxalate decarbo巧lase,0xdc,EC 4.1.1.2)催化裂解草酸的C-C鍵， 可W在沒有輔因子的條件下催化草酸轉(zhuǎn)化為甲酸和C02,是植物、微生物中草酸代謝降解的 主要催化酶?；趯Φ孜锏母叨忍禺愋訵及酶促反應的高效性等特點，該酶已廣泛的應用 于農(nóng)業(yè)、食品、工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療等領(lǐng)域中草酸鹽的降解。針對草酸巧結(jié)石癥方面，目前已有一 些使用草酸脫簇酶進行預防治療的研究報道。Grujic等使用基因敲除小鼠為模型，通過口 服交聯(lián)草酸脫簇酶晶體（OxDc-化EC)，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)尿草酸及糞草酸分別降低了 44%和 72%Jeong等模擬高草酸尿癥模型，通過給小鼠口服來源于枯草芽抱桿菌(B.subtilis)的 重組草酸脫簇酶，有效的減少了尿液中草酸的水平。CowleyW大鼠及狗為實驗動物，口服酶 制劑化azyme(0C4)連續(xù)飼喂14天，評價了運類用于降解動物消化道中草酸的酶制劑的可能 毒性，試驗表明對鼠使用劑量為720.8mg/kg/d，對狗使用劑量為187.2mg/kg/d均無可見有 害作用水平。
[0003] 研究表明，采用草酸脫簇酶酶制劑降解消化道內(nèi)的草酸鹽W預防治療草酸巧結(jié)石 癥的方法是可行的。但是酶作為一種蛋白質(zhì)，應用于消化道內(nèi)時，存在受胃酸、蛋白酶等環(huán) 境因素作用，容易被消化而失去其活性。此外，草酸脫簇酶制劑在實際應用中，由于尿液處 于不斷流動的狀態(tài)，通過合理給藥到達泌尿系統(tǒng)中的酶制劑面臨酶蛋白易被稀釋流失的現(xiàn) 實問題。運用無載體固定化方法制備交聯(lián)草酸脫簇酶聚集體，對其酶學性質(zhì)研究表明交聯(lián) 聚集體的耐酸性、耐熱性、耐膜蛋白酶降解能力較游離酶均有提高(梁躍等.交聯(lián)草酸脫簇 酶聚集體的制備及其性質(zhì).食品科學，2013,34(01): 215-219.)。
[0004] 酶化學修飾是改進酶性能的有效方法。韋成畳等采用右旋糖酢、單甲氧基聚乙二 醇修飾草酸脫簇酶，結(jié)果表明，修飾后草酸脫簇酶的熱穩(wěn)定性、耐熱性、pH適應性、抗膜蛋白 水解性都有所增強，提高了酶的應用性能。但是運些研究并未解決草酸脫簇酶制劑應用于 預防治療草酸巧結(jié)石癥時，存在酶蛋白易被稀釋流失的現(xiàn)實問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法及所獲得的改性 草酸脫簇酶和應用。草酸脫簇酶經(jīng)修飾后，其熱穩(wěn)定性、耐熱性、pH適應性、對膜蛋白酶的耐 受性及在草酸巧晶體上的吸附能力都有所增強?？捎糜谥苽漕A防治療草酸巧結(jié)石病的酶制 劑。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0007] -種乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，將乙二胺四乙酸二酸酢 (ethyl enedi aminetetraaceti C di anhydride，EDTAD)和草酸脫簇酶（Oxalate deca;rboxylase，Oxdc，EC 4.1.1.2)溶入憐酸鹽緩沖液中，攬拌反應lh-24h;反應結(jié)束后，將 反應產(chǎn)物進行透析，然后進行濃縮，獲得乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶化DTAD- Oxdc)。
[000引 W上所述的草酸脫簇酶采用"林日輝，許麗莉，農(nóng)勉，等.重組草酸脫簇酶的表達及 酶學性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(2):57-61"公開的方法制備而得。
[0009] 進一步的，W上所述的乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，所述的乙二 胺四乙酸二酸酢和草酸脫簇酶按摩爾比0.5:1-100:1。
[0010] 進一步的，W上所述的乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，所述的憐酸 鹽緩沖液的濃度為20-500mmol/L，pH 3.0-9.0。
[0011] 進一步的，W上所述的乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，所述的透析 選用截留分子量8000-14000的透析袋。
[0012] 進一步的，W上所述的乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，所述的濃縮 選用超濾管，在2000-5000巧m、2-10 °C、10-50min條件下進行離屯、濃縮。
[0013] 進一步的，W上所述的乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，所述的濃縮 選用透析袋進行濃縮，其條件為在2-l(TC條件下，將透析袋放置體積濃度為20-50%的聚乙 二醇20000溶液中進行濃縮2-4h。
[0014] W上方法所制備得到的乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶，草酸脫簇酶和乙二 胺四乙酸二酸酢已共價結(jié)合，乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的位點位于草酸脫簇酶 側(cè)鏈的自由氨基上或者膚鏈的N末端的a-氨基上。
[0015] W上所述乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的應用，所述的乙二胺四乙酸二酸 酢修飾草酸脫簇酶在草酸巧晶體吸附上的應用。乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶在草 酸巧晶體吸附上的應用是利用和發(fā)揮乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶催化草酸鹽降 解活性。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0017] 1.本發(fā)明直接采用乙二胺四乙酸二酸酢對草酸脫簇酶進行化學修飾，條件溫和、 操作簡單、成本較低。
[0018] 2.經(jīng)乙二胺四乙酸二酸酢修飾后，草酸脫簇酶的熱穩(wěn)定性、耐熱性、pH適應性、對 膜蛋白酶的耐受性都有所增強;特別是提高了草酸脫簇酶在草酸巧晶體上的吸附能力。
[0019] 3.本發(fā)明解決了草酸脫簇酶在應用中存在受胃酸、胃蛋白酶影響，而容易失去活 性的問題。
[0020] 4.本發(fā)明還解決了在實際應用中酶制劑中酶蛋白面臨易被稀釋流失的現(xiàn)實問題。
【附圖說明】
[0021] 圖1為草酸脫簇酶(Oxdc)與乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶化DTAD-Oxdc)在 不同pH值條件下的酶活力對比圖，即pH適應性對比圖。
[0022] 圖2為草酸脫簇酶(Oxdc)與乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶化DTAD-Oxdc)在 不同溫度條件下分別熱處理30min的酶活力對比圖，即耐熱性對比圖。
[0023] 圖3為草酸脫簇酶(Oxdc)與乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶化DTAD-Oxdc)的 熱穩(wěn)定性對比圖。
[0024] 圖4為草酸脫簇酶(Oxdc)與乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶化DTAD-Oxdc)對 膜蛋白酶的耐受性對比圖。
【具體實施方式】
[0025] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明做進一步的描述。應理解，運 些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講 授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員對本發(fā)明做各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本 申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0026] 草酸脫簇酶的制備:采用"林日輝，許麗莉，農(nóng)勉，等.重組草酸脫簇酶的表達及酶 學性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(2):57-61"公開的方法制備而得。具體為:培養(yǎng) 發(fā)酵產(chǎn)草酸脫簇酶基因工程菌E. coli化21 (DE3)/祀T32a/YvrK，添加異丙基-0-D-硫代化 喃半乳糖巧（IPTG)至終濃度0.4mmol/L，MnCl2至6mmol/L，誘導表達草酸脫簇酶，離屯、收集 菌體，W50mmol/L pH 8.0的憐酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲破碎，離屯、收集上清即為粗酶液， 用AKTAprim帥lus快速低壓液相色譜系統(tǒng)對粗酶液進行純化，所得純化酶液轉(zhuǎn)入預先處理 好的透析袋(截留分子量8000-14000)中，于50mmol/L pH 8.0的憐酸鹽緩沖液中4°C下透析 過夜，然后用超濾濃縮管濃縮至一定濃度，所得酶液為草酸脫簇酶液。
[0027] 修飾率的測定:采用2,4,6-立硝基苯橫酸(TNBS)法測定，根據(jù)TNBS與蛋白質(zhì)分子 上的游離氨基發(fā)生顯色反應，生成S硝基苯衍生物，在420皿處有特征光吸收。取ImL待測蛋 白溶液（0-lmg/mL)，加入ImL 4%化HC〇3(pH 8.5)，lmL 10%SDS,靜置20min后添加 ImL 0.1 %TNBS并將混合溶液置于40°C水浴化。反應完成后加0.5ml Imol/L的HCl終止反應，在 420nm波長下測定其吸收值。修飾前原酶在420nm的光吸收值記為Ao,修飾酶的光吸收值記 為Ai，按下式計算修飾率:MR=[l-(AlXCo)/(AoXCl)]X100%。其中Co、Cl分別為修飾前原 酶的濃度及修飾后經(jīng)透析濃縮所得酶的濃度。
[002引草酸脫簇酶的酶活力檢測:反應液含67mmol/L草酸鐘，50mmol/L pH 4.0巧樣酸鹽 緩沖液，37 °C水浴2min，加入草酸脫簇酶液開始反應，lOmin后加入等體積的0.2mol/L憐酸 氨二鐘使體系pH上升至中性終止反應。終止反應液體系加入輔酶甲酸脫氨酶W及NAD+，紫 外分光光度法測定340nm的吸收值，分析甲酸的生成量。酶活力單位定義為:每分鐘催化轉(zhuǎn) 化草酸產(chǎn)生Iwnol甲酸的酶量。修飾草酸脫簇酶的酶活力檢測同上。蛋白濃度采用考馬斯亮 藍法測定。
[0029] 一、乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的制備
[0030] 實例 1
[0031] 一種乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，將乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脫簇酶按摩爾比0.5:1溶入抑3.0、濃度為20mmol/L的憐酸鹽緩沖液中，攬拌反應化;反應 結(jié)束后，將反應產(chǎn)物選用截留分子量8000的透析袋進行透析，然后選用超濾管在2000rpm、2 °C、10min條件下進行離屯、濃縮，獲得乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶。
[0032] 上述的濃縮步驟也可采取使用透析袋進行濃縮，在2°C條件下，將透析袋放置20% (w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中進行濃縮化。
[0033] 實施例2
[0034] 一種乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，將乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脫簇酶按摩爾比20:1溶入抑4.0、濃度為lOOmmo 1/L的憐酸鹽緩沖液中，攬拌反應化;反應 結(jié)束后，將反應產(chǎn)物選用截留分子量9000的透析袋進行透析，然后選用超濾管在3000rpm、4 °C、20min條件下進行離屯、濃縮，獲得乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶。
[0035] 上述的濃縮步驟也可采取使用透析袋進行濃縮，在4°C條件下，將透析袋放置25% (w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中進行濃縮2.化。
[0036] 實施例3
[0037] 一種乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，將乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脫簇酶按摩爾比40:1溶入抑6.0、濃度為200mmol/L的憐酸鹽緩沖液中，攬拌反應化;反應結(jié) 束后，將反應產(chǎn)物選用截留分子量10000的透析袋進行透析，然后選用超濾管在4000rpm、6 °C、30min條件下進行離屯、濃縮，獲得乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶。
[0038] 上述的濃縮步驟也可采取使用透析袋進行濃縮，在fTC條件下，將透析袋放置30% (w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中進行濃縮化。
[0039] 實施例4
[0040] 一種乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，將乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脫簇酶按摩爾比60:1溶入抑8.0、濃度為300mmol/L的憐酸鹽緩沖液中，攬拌反應13h;反應 結(jié)束后，將反應產(chǎn)物選用截留分子量11000的透析袋進行透析，然后選用超濾管在5000rpm、 8°C、40min條件下進行離屯、濃縮，獲得乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶。
[0041] 上述的濃縮步驟也可采取使用透析袋進行濃縮，在6°C條件下，將透析袋放置35% (w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中進行濃縮3.化。
[0042] 實施例5
[0043] 一種乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，將乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脫簇酶按摩爾比80:1溶入抑9.0、濃度為400mmol/L的憐酸鹽緩沖液中，攬拌反應17h;反應 結(jié)束后，將反應產(chǎn)物選用截留分子量12000的透析袋進行透析，然后選用超濾管在3500rpm、 10°C、50min條件下進行離屯、濃縮，獲得乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶。
[0044] 上述的濃縮步驟也可采取使用透析袋進行濃縮，在rC條件下，將透析袋放置40% (w/v)的聚乙二醇(PEG) 20000溶液中進行濃縮4h。
[0045] 實施例6
[0046] 一種乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，將乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脫簇酶按摩爾比80:1溶入抑5.0、濃度為500mmol/L的憐酸鹽緩沖液中，攬拌反應2化;反應 結(jié)束后，將反應產(chǎn)物選用截留分子量13000的透析袋進行透析，然后選用超濾管在2500rpm、 5°C、15min條件下進行離屯、濃縮，獲得乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶。
[0047] 上述的濃縮步驟也可采取使用透析袋進行濃縮，在9°C條件下，將透析袋放置45% (w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中進行濃縮化。
[004引實施例7
[0049] 一種乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方法，將乙二胺四乙酸二酸酢和草酸 脫簇酶按摩爾比50:1溶入抑7.0、濃度為80mmol/L的憐酸鹽緩沖液中，攬拌反應24h;反應 結(jié)束后，將反應產(chǎn)物選用截留分子量14000的透析袋進行透析，然后選用超濾管在3500rpm、 7°C、25min條件下進行離屯、濃縮，獲得乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶。
[0050] 上述的濃縮步驟也可采取使用透析袋進行濃縮，在l〇°C條件下，將透析袋放置 50%(w/v)的聚乙二醇(PEG)20000溶液中進行濃縮化。
[0051] 二、乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶結(jié)構(gòu)的分析
[0052] 通過對實施例1-7所制備得到的乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶，采用超高 效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，結(jié)果表明：草酸脫簇酶和乙二胺四乙酸二酸酢已共價結(jié) 合，乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的位點位于草酸脫簇酶側(cè)鏈的自由氨基上或者膚 鏈的N末端的a-氨基上。
[0053] 具體分析實驗為:實施例8
[0054] 實施例8
[0055] 超高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的方 法:在50mmol/L pH 8.5的化is-HCl緩沖液中，按50: l(w/w)的比例添加乙二胺四乙酸二酸 酢修飾草酸脫簇酶液與膜蛋白酶液(經(jīng)甲苯橫酷苯丙氨酷氯甲酬處理的），混勻后，37°C水 浴保溫酶解12h，取出，100°C水浴加熱15min終止反應，在4°C，12000巧m下離屯、5min，收集上 清液，然后用0.45WI1的針頭過濾器去除上清液中的不溶物，采用超高效液相色譜一四極桿 飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀對其進行分析，得到的總離子流圖經(jīng)waters公司的BiopharmaLynx軟 件分析對比，得出被乙二胺四乙酸二酸酢修飾的草酸脫簇酶膚段如下表。
[0056] 表1 UPLC-MS分析結(jié)果 [0化7]
[005引上述實驗結(jié)果表明：草酸脫簇酶和乙二胺四乙酸二酸酢已共價結(jié)合，乙二胺四乙 酸二酸酢修飾草酸脫簇酶的位點位于草酸脫簇酶側(cè)鏈的自由氨基上或者膚鏈的N末端的a- 氨基上。
[0059] =、修飾前后草酸脫簇酶的酶學性質(zhì)比較
[0060] 1、酶最適反應抑值的測定:在50mmol/L pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 的不同巧樣酸鹽緩沖體系中分別測定相同蛋白濃度的原酶和修飾酶的酶活力。結(jié)果如圖1。 原酶的最適pH值為3.5,而修飾的最適抑值為5.0;說明經(jīng)乙二胺四乙酸二酸酢修飾的草酸 脫簇酶的pH適應范圍有所增加。
[0061] 2、溫度對酶活力的影響：在各自最適反應pH值下，分別測定相同蛋白濃度的原酶 和修飾酶在45、50、55、60、65、70、75 °C條件下熱處理30min的殘余酶活力；分別將相同蛋白 濃度的原酶和修飾酶在65°C條件下水浴處理，不同時間測定殘余酶活力。原酶和修飾酶的 耐熱性結(jié)果如圖2。原酶和修飾酶都在45 °C時酶活力達到最高;但在45-75 °C范圍內(nèi)修飾酶 的酶活均高于原酶的，表現(xiàn)出較好的耐高溫能力。原酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖3。65 °(：水浴處理3.化時，原酶的相對酶活為24.80%，而修飾酶的相對酶活較原酶高約9.36% ; 說明經(jīng)乙二胺四乙酸二酸酢修飾的草酸脫簇酶的熱穩(wěn)定性增加。
[0062] 3、對膜蛋白酶的耐受性
[0063] 分別取2.25mL相同蛋白濃度的原酶和修飾酶，加入2.5mg/mL的膜蛋白酶溶液 0.25mL，37°C水浴，不同時間分別在各自最適反應抑值下測定殘余酶活力。結(jié)果如圖4。經(jīng)膜 蛋白酶處理24h后，修飾酶較原酶保留了高約5 %的相對酶活;說明修飾酶具有較好的耐膜 蛋白酶水解的能力。
[0064] W上結(jié)果說明：經(jīng)乙二胺四乙酸二酸酢修飾的草酸脫簇酶的pH適應性、耐熱性、熱 穩(wěn)定性、對膜蛋白耐受性都有所增強。
[0065] 四、乙二胺四乙酸二酸酢修飾草酸脫簇酶在草酸巧晶體吸附上的應用
[0066] 實施9修飾前后草酸脫簇酶在草酸巧晶體上的吸附比較
[0067] 準確稱取l.Og-水草酸巧晶體于50mL的具塞磨口錐形瓶中，分別加入一定體積的 pH 7.0的一水草酸巧飽和溶液，再分別加入已滅活的原酶液和修飾酶液至終濃度均為2mg/ mL，使吸附體系總體積為20mL后在37.0±0.5°C下恒溫振蕩進行吸附反應，于不同時間取 出，離屯、分離，測定上清液中的蛋白濃度，計算吸附量。結(jié)果如下表所示。
[0068] 表2化dc和邸TAD-Oxdc在COM晶體上的吸附
[0069]
[0070] 可知，原酶和修飾酶在一水草酸巧晶體上的吸附量隨時間變化的趨勢相同，但修 飾酶的吸附量明顯高于原酶的。吸附進行地，原酶在一水草酸巧晶體上的吸附量為7.26mg/ m2,而經(jīng)乙二胺四乙酸二酸酢修飾后的草酸脫簇酶比未修飾的吸附量增加了約42.42%。提 高了草酸脫簇酶制劑在實際應用中針對酶蛋白易被稀釋流失問題的應用性能，可用于制備 預防治療草酸巧結(jié)石病的酶制劑。
【主權(quán)項】
1. 一種乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶的方法，其特征在于：將乙二胺四乙酸二 酸酐和草酸脫羧酶溶入磷酸鹽緩沖液中，攪拌反應lh-24h;反應結(jié)束后，將反應產(chǎn)物進行透 析，然后進行濃縮，獲得乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶的方法，其特征在于:所 述的乙二胺四乙酸二酸酐和草酸脫羧酶按摩爾比0.5:1-100:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶的方法，其特征在 于:所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為20-500mmol/L，pH 3.0-9.0。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶的方法，其特征在 于:所述的透析選用截留分子量8000-14000的透析袋。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶的方法，其特征在于:所 述的濃縮選用超濾管，在2000-5000rpm、2-10°C、10-50min條件下進行離心濃縮。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶的方法，其特征在于:所 述的濃縮選用透析袋進行濃縮，其條件為在2-10°C條件下，將透析袋放置體積濃度為20-50 %的聚乙二醇20000溶液中進行濃縮2-4h。7. -種如權(quán)利要求1-6所制備得到的乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶，其特征在 于:草酸脫羧酶和乙二胺四乙酸二酸酐已共價結(jié)合，乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶 的位點位于草酸脫羧酶側(cè)鏈的自由氨基上或者肽鏈的N末端的α-氨基上。8. -種如權(quán)利要求7所述乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶的應用，其特征在于:所 述的乙二胺四乙酸二酸酐修飾草酸脫羧酶在草酸鈣晶體吸附上的應用。
【文檔編號】C12N9/88GK106047847SQ201610377427
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】林日輝, 賀俊斌, 黃文勤
【申請人】南寧奕德環(huán)境科技有限公司