一種酶法制備茶黃素雙沒食子酸酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種茶黃素雙沒食子酸酯(TF3)的酶法制備方法。該方法包括：以黃冠梨為原料，分離純化得到多酚氧化酶(PPO)；通過兩步法結(jié)合Triton X?100反相油包水微乳系統(tǒng)制備得到磁性Fe3O4?CS納米載體；以戊二醛為交聯(lián)劑將PPO固定在磁性Fe3O4?CS納米粒子的表面；以EGCG和ECG為反應(yīng)物，利用固定化PPO催化合成得到TF3。
【專利說明】
-種酶法制備茶黃素雙沒食子酸醋的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種W固定化多酪氧化酶催化合成茶黃素雙沒食子酸醋的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶黃素雙沒食子酸醋(TF3)是紅茶中茶黃素類的一種主要單體，也是紅茶茶湯的 色澤及風(fēng)味的主要指標(biāo)。近年來，TF3的醫(yī)藥保健功能受到了極大的關(guān)注，但是紅茶中TF3的 含量極低，而且其純化步驟繁瑣耗時(shí)。
[0003] 黃冠梨中多酪氧化酶(PP0)具有較強(qiáng)的催化合成TF3的能力。磁性納米顆粒具有高 的比表面積、超順磁性、生物相容性、低毒W(wǎng)及高的回收率等特性，因此在食品加工、檢測(cè)、 藥物給藥W及生物分離等多種領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，磁性納米顆粒在水溶液中 易發(fā)生凝聚沉降從而限制了其的實(shí)際應(yīng)用。殼聚糖(CS)改性磁性納米顆粒被廣泛應(yīng)用在生 物醫(yī)藥、酶的固定化、生物分離、食品檢驗(yàn)、廢水處理和環(huán)境監(jiān)測(cè)等鄰域。W戊二醒為交聯(lián) 劑，將PK)固定在磁性殼聚糖納米載體上具有重要的研究應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 目前關(guān)于應(yīng)用固定化的梨pro催化合成TF3的方法尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的旨在提供一種快速、高效的制備茶黃素雙沒食子酸醋的方法，實(shí)現(xiàn)本 發(fā)明的具體方案如下：
[0006] (1)選用黃冠梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv.Huangguan)為原料，進(jìn)行多酪 氧化酶(PP0)的分離純化。勻漿法提取粗酶液，經(jīng)不同飽和度硫酸錠溶液鹽析，透析后上 DEAE S邱harose Fast Flow層析柱，化C1溶液梯度洗脫，收集具有酶活的洗脫組分，脫鹽濃 縮，純化得到一種多酪氧化酶的同工酶。
[0007] (2)通過兩步法結(jié)合化iton X-100反相油包水微乳系統(tǒng)制備得到磁性化3〇4-CS納 米載體。
[000引（3似戊二醒為交聯(lián)劑將步驟(1)中的PK)固定在磁性化3化-CS納米粒子的表面。
[0009] (4)WEGCG和ECG為反應(yīng)物，利用步驟(3)中固定化酶催化合成得到TF3。催化反應(yīng) 的最佳時(shí)間約為化，TF3產(chǎn)率為39.31%。重復(fù)利用性實(shí)驗(yàn)表明，固定化酶循環(huán)使用8次依然 可W達(dá)到催化效率的90% W上。
[0010] (5)將步驟(4)制得的TF3粗液，經(jīng)半制備高效液相色譜進(jìn)行純化。色譜柱為￥1(：- Pack 0DS-A(250X20mm，5mm)，應(yīng)用乙臘-乙酸乙醋（26:74，v/v)溶液洗脫色譜柱，檢測(cè)波長 28化m。分離后的樣品自動(dòng)分部收集，合并TF3溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，得到TF3單體， 純度大于98 %。
【附圖說明】
[OCm]圖1多酪氧化酶NaCl梯度洗脫曲線
[001^ 圖2差示掃描量熱分析圖：（a)Fe304和（b)Fe304-CS
[0013] 圖3固定化pro催化合成茶黃素雙沒食子酸醋HPLC色譜圖
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[001引實(shí)施例1:
[0016] (1)稱取500g梨(黃冠梨)切成碎塊(冷凍-20°C)，放入組織搗碎機(jī)，加入適量PVPP， 再加入250血預(yù)冷的憐酸鹽緩沖液（10mM，pH 6.9)。搗碎5min(3min+2min分兩次進(jìn)行，中間 停5min)，四層紗布過濾，壓擠法擠出濾液，濾渣放入研鉢中，加入適量石英砂，250mL緩沖液 冰浴中研磨（勻漿5min)，四層紗布過濾，擠壓法擠出濾液，合并兩次濾液，4°C條件下 800化pm離屯、15min，取上清即為粗酶液。
[0017] (2化步驟（1)制得粗酶液中，緩慢加入硫酸錠粉至70%飽和度，操作在冰浴中進(jìn) 行。4°C冰箱過夜，10000巧m離屯、lOmin，收集鹽析蛋白。
[001引（3)將步驟(2)中得到的鹽析蛋白裝入孔徑為8000-14000kDa的透析袋中，扎緊袋 口浸沒于lOmM憐酸鹽緩沖液(pH 6.9)中透析脫鹽，每隔化換次水，置于4°C冰箱中過夜后， 聚乙二醇20000適當(dāng)濃縮得粗酶液，4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0019] (4)S氯化鐵與硫酸亞鐵W摩爾比為2:1溶解于純水中（純水預(yù)先通入氮?dú)?0min 排除其中溶解的化）。在25°C攬拌轉(zhuǎn)速為lOOOr/min條件下向反應(yīng)體系中逐滴加入濃氨水溶 液至反應(yīng)液pH值在8-10之間化學(xué)沉淀被進(jìn)行。沉淀在80°C水浴條件下加熱30min陳化后，純 水洗涂=次。最后將磁性納米顆粒濕法保存在-20°C條件下，避免磁性聚集體的生成和利于 后續(xù)工作的使用。
[0020] (5)將2.0g殼聚糖(CS)粉末溶解在200mL 2%的醋酸溶液中。環(huán)己燒、正己燒和CS 溶液按體積比為11:6:4進(jìn)行混合后加入步驟(4)制得的適量Fe3〇4懸濁液(F63化干重約為 2邑），逐漸加入化iton X-100并不斷攬拌至溶液呈亮色。在反應(yīng)體系中加入40mL 5M的化0H 溶液后，60°C水浴反應(yīng)化制備得到殼聚糖納米顆粒。將得到的磁性化3化-CS納米顆粒用強(qiáng)力 磁鐵分離，先后用乙醇和純水漂洗S次。最后將磁性Fe3〇4-CS納米顆粒濕法保存在4°C冰箱 待用。
[00別](6)將步驟(5)磁性化3〇4-CS納米顆粒(約1 OOmg)被分散在60血濃度為4 %的戊二醒 溶液中，常溫條件下于搖床中W12化/min的轉(zhuǎn)速震蕩交聯(lián)地。強(qiáng)力磁鐵收集納米顆粒，用純 水將未交聯(lián)上的戊二醒沖洗干凈。將步驟(3)50mL梨多酪氧化酶液(25mg)加入到經(jīng)戊二醒 交聯(lián)好的磁性殼聚糖納米顆粒中，常溫條件下于搖床中W12化/min的轉(zhuǎn)速固定化化。強(qiáng)力 磁鐵收集固定化酶。
[0022] (7)稱取茶多酪粉末100mg溶解于200mL巧樣酸-憐酸鹽緩沖液(50mM，pH5.8)中， 加入步驟(6)固定化酶，加入ImL過氧化氨溶液，常溫條件下于搖床中W12化/min的轉(zhuǎn)速震 蕩反應(yīng)化，得到富含TF3粗品。
[0023] (8)將步驟(7)富含TF3粗品，經(jīng)半制備高效液相色譜進(jìn)行純化。色譜柱為YMC-化ck 0DS-A( 250 X 20mm，5mm)，應(yīng)用乙臘-乙酸乙醋（26:74，v/v)溶液洗脫色譜柱，流速為1.5mL/ min，檢測(cè)波長28化m。分離后的樣品自動(dòng)分部收集，每管收集3mL，合并TF3溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃 縮，冷凍干燥，得到TF3單體，純度大于98 %。
[0024] 實(shí)施例2:
[0025] (1)稱取500g梨(黃冠梨)切成碎塊(冷凍-20°C)，放入組織搗碎機(jī)，加入適量PVPP， 再加入500血預(yù)冷的憐酸鹽緩沖液(50mM，pH 6.8)。搗碎5min(3min+2min分兩次進(jìn)行，中間 停5min)，四層紗布過濾，壓擠法擠出濾液，濾渣放入研鉢中，加入適量石英砂，250mL緩沖液 冰浴中研磨（勻漿5min)，四層紗布過濾，擠壓法擠出濾液，合并兩次濾液，4°C條件下 800化pm離屯、15min，取上清即為粗酶液。
[0026] (2)在步驟（1)制得粗酶液中，緩慢加入硫酸錠粉至70%飽和度，操作在冰浴中進(jìn) 行。4°C冰箱過夜，10000巧m離屯、lOmin，收集鹽析蛋白。
[0027] (3)將步驟(2)中得到的鹽析蛋白裝入孔徑為8000-14000kDa的透析袋中，扎緊袋 口浸沒于lOmM憐酸鹽緩沖液(pH 6.9)中透析脫鹽，每隔化換次水，置于4°C冰箱中過夜后， 聚乙二醇20000適當(dāng)濃縮得粗酶液，4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[00%] (4)將步驟（3)得到的粗酶液加樣于經(jīng)過lOmM憐酸鹽緩沖液(PH7.0平衡的DEAE S邱harose Fast Flow陰離子交換柱（4 20 XI. 5cm)，應(yīng)用AKTA蛋白質(zhì)純化儀用平衡緩沖 液沖洗200血，然后進(jìn)行加鹽梯度洗脫。分別用含0、0.05、0.1、0.3、0.5M化C1，pH值7.0的憐 酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為0.3mL/min，每個(gè)梯度洗脫3個(gè)柱體積，分部收集每管 3mL，紫外檢測(cè)波長為280nm。檢測(cè)有紫外吸收管中PP0活性，收集PP0活性峰。將所得酶活最 高的蛋白組分經(jīng)lOkDa超濾離屯、管濃縮脫鹽后備用。
[0029] (5)S氯化鐵與氯化亞鐵W摩爾比為2:1溶解于純水中（純水預(yù)先通入氮?dú)?0min 排除其中溶解的化）。在25°C攬拌轉(zhuǎn)速為lOOOr/min條件下向反應(yīng)體系中逐滴加入濃氨水溶 液至反應(yīng)液pH值在8-10之間化學(xué)沉淀被進(jìn)行。沉淀在80°C水浴條件下加熱30min陳化后，純 水洗涂=次。最后將磁性納米顆粒濕法保存在-20°C條件下，避免磁性聚集體的生成和利于 后續(xù)工作的使用。
[0030] (6)將l.Og殼聚糖(CS)粉末溶解在lOOmL 2%的醋酸溶液中。環(huán)己燒、正己燒和CS 溶液按體積比為11:6:4進(jìn)行混合后加入步驟（5)制得的適量Fe3〇4懸濁液(F63化干重約為 1邑），逐漸加入化iton X-100并不斷攬拌至溶液呈亮色。在反應(yīng)體系中加入20mL 5M的化0H 溶液后，60°C水浴反應(yīng)化制備得到殼聚糖納米顆粒。將得到的磁性化3化-CS納米顆粒用強(qiáng)力 磁鐵分離，先后用乙醇和純水漂洗S次。最后將磁性Fe3〇4-CS納米顆粒濕法保存在4°C冰箱 待用。
[00川 （7)將步驟(6)磁性Fe304-CS納米顆粒(約lOmg)被分散在6血濃度為4 %的戊二醒溶 液中，常溫條件下于搖床中W12化/min的轉(zhuǎn)速震蕩交聯(lián)地。強(qiáng)力磁鐵收集納米顆粒，用純水 將未交聯(lián)上的戊二醒沖洗干凈。將步驟(4)5mL梨多酪氧化酶(2mg)液加入到經(jīng)戊二醒交聯(lián) 好的磁性殼聚糖納米顆粒中，常溫條件下于搖床中W12化/min的轉(zhuǎn)速固定化化。強(qiáng)力磁鐵 收集固定化酶。
[0032] (8)分別稱取EGCG和ECG各15mg溶解于60mL憐酸鹽緩沖液(50mM，pH 6.0)中，加入 步驟(7)固定化酶，通入氧氣(通入最大氣流而不產(chǎn)生過量氣泡），攬拌，恒溫水浴30°C反應(yīng) 化，得到TF3粗品。
[0033] (9)將步驟（8)TF3粗品，經(jīng)半制備高效液相色譜進(jìn)行純化。色譜柱為YMC-化ck 0DS-A( 250 X 20mm，5mm)，應(yīng)用乙臘-乙酸乙醋（26:74，v/v)溶液洗脫色譜柱，流速為1.5mL/ min，檢測(cè)波長28化m。分離后的樣品自動(dòng)分部收集，每管收集3mL，合并TF3溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃 縮，冷凍干燥，得到TF3單體，純度大于98 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種磁性納米顆粒固定化多酚氧化酶的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟： (1) 選用黃冠梨(Pyrus bretschneideri Rehd cv.Huangguan)為原料，進(jìn)行多酸氧化 酶(PPO)的分離純化。 (2) 通過兩步法結(jié)合Triton X-100反相油包水微乳系統(tǒng)制備得到磁性Fe3〇4_CS納米載 體。 (3) 以戊二醛為交聯(lián)劑將取步驟（1)中的PP0固定在磁性Fe3〇4_CS納米粒子的表面制備 得到磁性納米顆粒固定化PP0。2. -種茶黃素雙沒食子酸酯的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟： (1) 以EGCG和ECG為反應(yīng)底物，利用磁性納米顆粒固定化PP0催化合成得到TF3。 (2) 將步驟（1)制得的TF3粗液，經(jīng)半制備高效液相色譜進(jìn)行純化，得到TF3單體，純度大 于 98 %。
【文檔編號(hào)】C12P17/16GK106047851SQ201610435650
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日
【發(fā)明人】曾曉雄, 雷時(shí)成
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)