一種顯著增加水稻生殖期耐旱基因QDTY 2.9^IR66897B及其分子標記方法
【專利摘要】一種顯著增加水稻生殖期耐旱基因QDTY 2.9IR66897B及其分子標記方法，屬于水稻高產(chǎn)抗逆育種和分子遺傳學領域。利用吉粳88與3個供體衍生的育種選擇群體，采用適用于育種選擇群體的新型偏分離定位方法定位與耐旱相關的QTL；進而通過隨機選擇群體驗證抗旱QTL的真實性以及與其緊密連鎖標記的可靠性。將本發(fā)明應用于水稻耐旱的輔助選擇育種和聚合育種，能夠有效的彌補以往自然變異基因的不足，不但可以顯著降低利用初定位結果開展輔助育種帶來的負面影響，而且可以在苗期對低世代的育種群體進行基因型選擇，獲得耐旱個體，便于及時的雜交轉育，省去成株期耐旱抗性鑒定的過程，提高育種效率，加快育種進程。
【專利說明】
-種顯著増加水稻生殖期耐旱基因 QDTY 2.9iM6897B及其分子 標巧方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及一種顯著增加水稻生殖期耐旱基因孤TY 2.9iK66897B及其分子標記方 法，該基因顯著降低水稻在干旱脅迫下的產(chǎn)量損失，屬于水稻高產(chǎn)抗逆育種和分子遺傳學 領域，適用于在水稻高產(chǎn)抗逆育種中引入在生殖期耐旱基因 QDTY 2.9?6897b，并利用分子標 記對該基因進行輔助選擇育種。
【背景技術】
[0002] 干旱是造成水稻產(chǎn)量損失，限制水稻種植分布的最重要非生物脅迫因素之一。當 前，干旱頻繁發(fā)生，每年對世界稻米產(chǎn)量造成巨大損失。然而世界范圍人口卻在快速增長， 糧食需求缺口巨大，因此通過挖掘現(xiàn)有種質資源中的有利抗旱等位基因，通過分子輔助選 擇手段培育耐旱新品種是非常迫切的重大科學問題。分子遺傳學研究表明，水稻對干旱的 抗性是受多基因控制的數(shù)量性狀。迄今已有大量干旱耐性相關的9化被定位，一些與干旱相 關的基因也被成功克隆。
[0003] 客觀上，抗性相關基因的挖掘有助于我們了解水稻對干旱抗性的遺傳基礎，然而 絕大多數(shù)基因真正在育種實踐中成功應用的事例仍十分有限。一個重要的限制因素是基礎 科學研究和育種實踐研究存在空隙，銜接不緊密。為了克服運一問題，我們發(fā)展了一套新的 定位策略，即采用選擇育種群體進行耐旱數(shù)量基因挖掘。與傳統(tǒng)遺傳群體相比，選擇育種群 體具有兩個顯著的優(yōu)勢；（1)群體中個體數(shù)量相對較小，表型和基因型鑒定可W節(jié)省大量成 本和資源；（2)經(jīng)過人工選擇，部分株系主要農(nóng)藝表現(xiàn)已經(jīng)與輪回親本相似，但在產(chǎn)量上更 具優(yōu)勢，因此運些攜帶大量有利等位基因的株系可W直接被用作聚合育種的親本，甚至可 直接選育成新品系。
[0004] 選擇育種群體由3個家系構成，每個家系共用一個輪回親本吉梗88。3個家系(P1到 P4)的父本分別是IR66897B，MR77和MR167。運3個父本是來自東南亞的地方品種，均具有一 定的耐旱性。利用適合于選擇育種群體的偏分離定位方法，我們成功實現(xiàn)了耐旱WL的定位 研究。結果表明，位于第2染色體末端192.2cm的位置存在一個與耐旱相關的一個基因位點 QDTY2.9。該9化在P1和P3群體中均被定位到。進一步，我們采用傳統(tǒng)的隨機群體開展了上述 Q化的驗證工作。該驗證群體是從3個家系中每個隨機選擇60個株系，共計180個株系組成。 驗證結果表明，QDTY 2.9?6897b是真實存在的抗旱基因，其與分子標記RM266緊密連鎖，且耐 旱有利等位基因來自耐旱親本IR66897B和MR167。通過與已報道的抗旱WL和基因物理位置 相比較，發(fā)現(xiàn)QDTY 2.9iK66897B與已克隆的耐旱相關基因〇sPIPl-3(RWC3)相鄰，推測QDTY 2. giKssswB可能是OsPiPi-3或其等位基因。但OsPIPl-3是利用反向遺傳學手段克隆的，尚沒 有開發(fā)出可直接用于耐旱分子輔助選擇育種的分子標記。本發(fā)明中孤TY 2.giKssswB的抗性 等位基因來自東南亞品種IR66897B和MR167,可為耐旱育種提供了新的可利用種質，有利于 擴大我國品種或種質的遺傳多樣性。

【發(fā)明內容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一個水稻生殖期耐旱基因孤TY 2.glKSSSWB及其分子標記方法。本發(fā)明利用適合于選擇育種群體的偏分離定位方法，在水稻 第2染色體末端192.2cm的位置定位到一個與耐旱相關的一個基因位點孤TY2.9。其耐旱有 利等位基因來自耐旱親本IR66897B，與分子標記RM266緊密連鎖。基于PCR的實用經(jīng)濟型標 記RM266,利用其可有效地開展水稻生殖期耐旱分子輔助選擇育種研究。
[0006] 本發(fā)明的技術方案如下：水稻生殖期耐旱基因孤TY 2.giKssswB，在水稻基因組第2 染色體末端192.2cm的位置存在一個與耐旱相關的一個基因位點QDTY2.9,來自東南亞的兩 個耐旱種質IR66897B和MR167在該位點上的等位基因能夠顯著增加水稻在生殖期的耐旱 性。
[0007] QDTY 2. giKssswB的分子標記方法，其特征在于：用一對特異的PCR引物對RM266，其 中正向引物序列為：TAGTTTAACCAAGACTCTC，反向引物序列為:GGTTGAACCCAAATCTGCA，共同 擴增帶有品種IR66897B血緣的育種材料基因組DNA，如果引物RM266能夠通過PCR擴增出與 IR66897B類似的117bp左右大小的片段，那么推測該育種材料很可能含有孤TY 2. giKssswB的 耐旱等位基因。
[000引通過本發(fā)明鑒定到第2染色體上的生殖期耐旱基因 （QDTY 2.9?6897b)W及可對其 進行利用的分子方法。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有W下優(yōu)點及效果：
[0009] 1.基于反向遺傳學手段，位于孤TY 2.9?6897b上游鄰近位置有一個耐旱相關基因 OsPIPl-3被克隆，推測QDTY S.giKssswB可能是OsPIPl-3或其等位基因。利用正向遺傳學手 段，本發(fā)明獲得了與孤TY 2. giKssswB緊密連鎖的常規(guī)分子標記RM266，通過緊密連鎖分子標 記的篩選，能夠便于獲得生殖期耐旱性增強的育種材料。
[0010] 2.QDTY 2.9?6897b的耐旱有利等位基因來自國際水稻所的優(yōu)質耐旱種質IR66897B 和馬來西亞地方品種MR167,與OsPIPl-3的供體品種不同，為耐旱育種提供了新的可利用種 質，有利于擴大我國品種或種質的遺傳多樣性。
[0011] 3.本發(fā)明的分子標記可用于苗期育種群體的基因型選擇，有效地鑒別帶有該基因 的耐旱型個體，便于及時的雜交轉育，加快育種進程。
【附圖說明】
[0012] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可W 根據(jù)運些附圖獲得其他的附圖。
[OOK]圖1是P1群體親本和隨機單株在RM266位點的電泳圖。（M、Pi和P2分另懐示marker， 吉梗88,和IR66897B; 1-10表示從P1群體隨機選擇的10個單株）。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發(fā)明進行進一步說明。
[001引實施例1
[0016]( - )耐旱〇化的定位
[0017] 1.供試材料
[0018] 首先W篩選自種質資源庫的3個東南亞地方品種IR66897B(P1群體父本），MR77(P2 群體父本)和MR167(P3群體父本)分別與中國高產(chǎn)優(yōu)質不耐旱梗稻吉梗88構建3個高代回交 導入系群體。經(jīng)過兩輪生殖期干旱脅迫選擇后，篩選出3個家系中的72個耐旱株系構成選擇 育種群體(表1)。
[0019] 表1.3個選擇育種群體構成信息 [00201
[0021] 化是未經(jīng)干旱脅迫的原始BC2F2群體大小;化是經(jīng)過第一輪干旱脅迫處理后選擇出 的耐旱株系數(shù);化是經(jīng)過2輪干旱脅迫處理后篩選出的耐旱株系數(shù)；.
[0022] 2.基因型鑒定
[0023] 參考Temny化等(2000年）的DNA提取方法，對各單株分別提取基因組DNA。^供體親 本和輪回親本吉梗88間有多態(tài)的SSR引物分別對不同家系衍生的后代的基因型進行鑒定。3 個家系的多態(tài)性引物數(shù)分別為181、201和197個。
[0024] 3.耐旱評估
[0025] 耐旱鑒定試驗在中國農(nóng)業(yè)科學院北京昌平實驗基地和寧夏農(nóng)林科學院實驗基地 完成。每個試驗地點均包括對照組和處理組兩個部分。對照組在整個生育期均采取正常灌 水管理，處理組則在幼穗萌發(fā)階段則開始采取干旱處理直到種子完全成熟。對照和處理均 采用3重復的完全隨機區(qū)組試驗。W單株產(chǎn)量作為評估指標。
[0026] 4.偏分離分析(Q化定位）
[0027] 由于72個株系由不同3個不同家系組成，不同家系間多態(tài)性標記存在差異，因此我 們首先按照化i等(2015)的方法發(fā)展了一個一致性的遺傳連鎖圖譜。進而采用Cui等(2015) 提供的偏分離定位方法開展耐旱WL的定位。WWald值為16.97作為判斷WL存在與否的標 準。
[0028] 生殖期耐旱WL鑒定。3個家系共計定位到7個耐旱性QTL。其中位于第2染色體2染 色體末端192.2cM的位置上的QDTY2.9被P1和P2兩個群體均定位到，來自東南亞的兩個耐旱 種質IR66897B和MR167在該位點上的等位基因能夠顯著增加水稻在生殖期的耐旱性。
[0029] 表2耐旱9化901￥2.9的定位
[0030]
[0031] 當Wald值= 20.35時P值= 0.01;當Wald值= 16.97時P值= 0.05;
[0032] (二）9〇1￥2.9的驗證
[0033] 1.供試材料
[0034] 從原始未經(jīng)過脅迫處理和人工選擇的3個高代回交群體(每個群體800個株系）中 分別隨機選擇60個單株組3個隨機驗證群體。
[0035] 2.基因型鑒定
[0036] 使用常規(guī)的CTAB法提取水稻單株的基因組DNA。^供體親本和輪回親本吉梗88間 有多態(tài)的SSR引物分別對不同家系衍生的后代的基因型進行鑒定。采用20山體系的常規(guī)PCR 操作流程擴增不同單株的模板DNA，W聚丙締凝膠電泳進行PCR產(chǎn)物的分離。
[0037] 3.耐旱表型評估
[0038] 耐旱鑒定試驗在中國農(nóng)業(yè)科學院北京昌平試驗基地和寧夏農(nóng)科院實驗基地進行。 每個試驗地點試驗均包括對照組和處理組兩部分。對照組整個生育期均采取正常田間管 理，而處理組在幼穗萌發(fā)階段即開始干旱處理直到種子完全成熟。對照和處理均采用3重復 的完全隨機區(qū)組試驗。W單株產(chǎn)量作為評價指標。
[0039] 3.單標記分析
[0040] 根據(jù)不同株系的RM266標記擴增條帶所表示的基因型，將每個家系的60個株系分 成兩組，一組是帶有吉梗88純合基因型的個體;另一組是帶有供體純合基因型的個體。單標 記分析結果表明，QDTY 2.9在P1和P3群體中再次被定位到，干旱脅迫下兩地點的平均單株 增產(chǎn)量達到23.5%，是一個主效的抗旱QTL，且抗性有利等位基因均來自供體親本。運表明 QDTY 2. giKssswB是一個真實存在的耐旱QTL，同時也表明RM226確實和QDTY 2.9緊密連鎖，可 直接應用于抗旱分子輔助選擇育種。
[0041 ] 表3. QDTY 2. giKssswB及其連鎖標記RM266的驗證
[0042]
[0043] 皿Y，純合供體基因型植株的平均單株產(chǎn)量;HRY，純合受體基因型植株的平均單株 產(chǎn)量;RPY，輪回親本吉梗88的平均單株產(chǎn)量;A，加性效應。
[0044] 對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠W其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論 從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的。本發(fā)明的范圍由所附權 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有 變化囊括在本發(fā)明內。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所設及的權利要求。
【主權項】
1. 一種顯著增加水稻生殖期耐旱基因 QDTY2.9IR66897B，其特征在于:在水稻基因組第2染 色體末端192.2cM的位置存在一個與耐旱相關的一個基因位點QDTY2.9,來自東南亞的兩個 耐旱種質IR66897B和MR77在該位點上的等位基因能夠顯著增加水稻在生殖期的耐旱性。2. 如權利要求1所述的耐旱基因 QDTY2.9__的分子標記方法，其特征在于：用一對特 異的PCR引物對RM266，其中正向引物序列為：TAGTTTAACCAAGACTCTC，反向引物序列為： GGTTGAACCCAAATCTGCA，共同擴增帶有品種IR66897B和MR167血緣的育種材料基因組DNA，如 果引物RM266能夠通過PCR擴增出與IR66897B和MR167類似的117bp左右大小的片段，那么推 測該育種材料很可能含有QDTY2.9 IR66897B的耐旱等位基因。3. 根據(jù)權利要求1、2所述的耐旱基因在水稻育種中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK106047891SQ201610482535
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】徐建龍, 黎志康, 朱亞軍, 陳凱, 孟麗君, 崔彥茹
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所, 中國農(nóng)業(yè)科學院深圳生物育種創(chuàng)新研究院