川芎α?淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑基因及表達(dá)產(chǎn)物的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種川芎α?淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑基因SEQ ID NO.1及其編碼的蛋白SEQ ID NO.2，以及表達(dá)產(chǎn)物的純化方法。與水稻(Oryza sativa(L.)Genbank:P29421)α?淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑的相似性為31.60％。LASI重組蛋白不僅能夠有效抑制小菜蛾的α?淀粉酶的活性，抑制率33％，還能夠抑制枯草桿菌蛋白酶的活性，抑制率為56.28％。本發(fā)明揭示了川芎根莖中一段新的α?淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑基因序列，這為抗蟲/抗菌植物基因工程提供了有效的候選基因。
【專利說明】
川芎α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑基因及表達(dá)產(chǎn)物的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一條新的川芎α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑基因序列。
【背景技術(shù)】
[0002]α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶(α-amylase/subtilisin inhibitor，ASI)是一種來源于植物的天然生物活性肽，能夠抑制攝食鱗翅目昆蟲腸道內(nèi)α-淀粉酶的活性，阻礙鱗翅目昆蟲對食物中淀粉及其他糖類化合物的消化吸收，影響鱗翅目昆蟲的生長發(fā)育，從而起到抗蟲作用。由于ASI的分子量較小，且活性明確，因此其是植物抗蟲基因工程的候選基因。另外，ASI還能夠抑制微生物來源的枯草桿菌蛋白酶的活性，被認(rèn)為是植物抵抗有害微生物的重要功能基因。因此，獲得新的ASI基因資源顯得意義重大。
[0003]川考為傘形科藁本屬植物川考(Ligusticum chuanx1ng Hort.)的根莖，是四川省的著名道地藥材，收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是降糖、降血脂中藥復(fù)方及中成藥的重要組分。本項(xiàng)目組首次從川芎根莖中克隆獲得川芎α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶(Ligusticumchuanx1nga-amylase/subti lisin inhibitor，LASI)基因的cDNA序列，構(gòu)建含有該基因的大腸桿菌基因工程菌，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、N1-NTA His Bind層析柱純化，已成功獲得純度為95 %的LASI重組蛋白。該LASI重組蛋白能夠有效抑制小菜蛾的α-淀粉酶活性，抑制率可達(dá)33 %。并且LASI重組蛋白還能夠抑制枯草桿菌蛋白酶的活性，抑制率為56.28 %。本項(xiàng)目的創(chuàng)新性研究成果已形成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的LASI基因，這為利用抗蟲/抗菌植物基因工程提供了有效的候選基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于現(xiàn)有研究技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一條新的來源于川芎根莖的具有抗蟲活性的α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑(LASI)基因序列，其具體的成果體現(xiàn)為:
[0005]—段川芎α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑LASI基因序列，其特征如序列表SEQID N0.1所示。
[0006]所述基因序列的LASI重組蛋白，其氨基酸如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供含有LASI基因的大腸桿菌表達(dá)載體、LASI基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化方法。采用以下的手段:利用SEQ ID N0.1構(gòu)建原核重組載體獲得LASI重組蛋白的方法，轉(zhuǎn)化大腸桿菌形成基因工程菌，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、N1-NTA His Bind層析柱純化，獲得純度為95%的LASI重組蛋白，所述LASI重組蛋白能夠有效抑制小菜蛾的α-淀粉酶、及枯草桿菌蛋白酶的活性，包括以下步驟:
[0008]a)傘形科植物川芎根莖α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑LASI基因的獲得；
[0009]b)LASI原核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)純化。
[0010]所述a)步驟包含如下具體工藝:[0011 ] I)提取川芎根莖總RNA，檢測j 11芎總RNA質(zhì)量；
[0012]2)cDNA 的合成；
[0013]3)用分別帶有BamHI和EcoRI雙酶切位點(diǎn)的引物從川芎cDNA中通過PCR擴(kuò)增出川芎LASI基因序列。
[0014]所述b)步驟包含如下具體工藝:
[0015]I)將擴(kuò)增出來的LASI基因序列和pET28-a載體分別用BamHI和EcoRI雙酶切消化，獲得兩端帶有粘性末端的片段，用T4DNA連接酶連接兩個片段，獲得連接好的重組質(zhì)粒；
[0016]2)取ΙΟμΙ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞；將轉(zhuǎn)化成功的重組E.coliRosetta基因工程菌涂布于含有(10mg/L)卡那霉素和氯霉素(25mg/L)的平板中篩選陽性克隆；
[0017]3)將初步篩選出來的重組菌株用菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定后，經(jīng)測序以確定閱讀框的正確，得到預(yù)期的重組菌株；
[0018]4)發(fā)酵擴(kuò)大重組菌株
[0019]⑴.LB發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L;溶解后，高溫高壓滅菌；
[0020]⑵.發(fā)酵條件:37 °C，200rpm將重組菌株培養(yǎng)至0D600?0.6 ；加入IPTG，使其終濃度為 ImM，37 °C 培養(yǎng) 8-1 Oh。
[0021]與目前技術(shù)相比，本發(fā)明主要具有以下有益效果:本發(fā)明提供的LASI基因是從傘形科植物川芎根莖中提取的一條新序列。通過基因工程所獲得的LASI重組蛋白不僅對小菜蛾的α-淀粉酶活性有抑制作用，并且對枯草桿菌蛋白酶也具有抑制活性，為抗蟲/抗菌植物基因工程提供了候選基因。
【附圖說明】
[0022]圖1為實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程圖。
[0023]圖2為重組質(zhì)粒pET28a_LASI的質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1:傘形科植物川芎根莖α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑(LASI)基因的獲得
[0025]利用OMEGA公司提供的植物RNA提取試劑盒提取川芎根莖總RNA，對提取的j11芎總RNA進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其提取量和濃度。
[0026]cDNA的合成:以得到的川芎RNA為模板，01 igodT(18)為引物，按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。
[0027]設(shè)計(jì)兩條引物，分別加入保護(hù)堿基和相應(yīng)的限制酶切位點(diǎn)，引物序列B1:CGCGGATCCGATGCATCGCCTGATGCT(BamHI)；B2:CCGGAATTCTCAAACCTTCAAGAACATAACCA(EcoRI) ο
[0028]以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，BI和B2為兩條引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下:Prime Star Mix 25yl，cDNA 2μ1，Β1 1μ1，Β2 lyl，ddH20 21μ1 WCR反應(yīng)參數(shù)為:94°C反應(yīng)5111；[11，預(yù)變性;94°(^1111；[11，66°(^1111；[11，72°02111；[11進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)35 次;72 °C 1min 復(fù)性;4 °C 反應(yīng)停止。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收600bp左右的擴(kuò)增帶并在其末端加PoIyA尾，將加PoIyA完成的片段連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，將陽性克隆菌送公司測序以確定擴(kuò)增序列的正確性。用Omega Plasmid Mini Kit I提取LAS1-PMD19-T重組質(zhì)粒。
[0029]實(shí)施例2:LASI原核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)純化
[0030]將提取得到的LAS1-pMD19-T重組質(zhì)粒用限制酶BamHl和EcoRI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)時間4小時，反應(yīng)溫度37 °C，反應(yīng)體系為BamHI 0.5yl，EcoRI 0.5μ1，10*Κ Buffer 2μ1，LAS1-pMD19-T載體9yl，ddH20 8μ1。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離酶切片段，用Gel Extract1n Kit回收600bp左右的清晰DNA條帶，獲得兩端具有酶切粘性末端的LASI基因片段。
[0031]用OmegaPlasmid Mini Kit I提取保存在E.coli DH5a菌株中的pET28a質(zhì)粒，通過限制酶BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)獲得兩端為粘性末端的線性質(zhì)粒，雙酶切體系與前段中的一致。雙酶切反應(yīng)之后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將酶切片段分開，用Gel Extract1n Kit回收長度正確的線性載體片段。
[0032]用T4DNA連接酶將上述帶有BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)的LASI基因片段和線性pET28a質(zhì)粒完成拼接，重新形成環(huán)狀質(zhì)粒，如圖2所示。將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli Rosetta感受態(tài)菌株。在含有卡那霉素(10mg/L)和氯霉素(25mg/L)的LB固體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)上篩選獲得陽性重組大腸桿菌，挑取單菌落送至擎科生物技術(shù)有限公司測序確定重組質(zhì)粒拼接的正確性。
[0033]將陽性克隆重組菌在加入在含有卡那霉素(10mg/L)和氯霉素(25mg/L)的LB固體培養(yǎng)基中劃線，37°C培養(yǎng)至有單菌落出現(xiàn)。挑取單菌落接種于50ml加入在含有卡那霉素(10mg/L)和氯霉素(25mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，200rmp搖床培養(yǎng)8-10h。將上述菌液按照1:20的比例擴(kuò)大培養(yǎng)至OD6qq?0.6時，加1?了6(111^)，200印111，37°(:過夜培養(yǎng)(8-1011)，誘導(dǎo)大腸桿菌高效表達(dá)LASI重組蛋白。
[0034]取200ml表達(dá)的菌液于5000 Xg離心20分鐘收集菌體，加入1ml PBS緩沖液(PH7.5)反復(fù)吹打沉淀使之重懸。超聲波破碎菌體釋放LASI蛋白(冰浴超聲30min破碎細(xì)胞釋放蛋白，超聲程序?yàn)?5%功率，超聲6s，間歇3s。超聲完成后裂解液用液氮凍融一次)。裂解液于13000 Xg離心1min將細(xì)胞碎片等雜質(zhì)去除，保留上清液，4°C備用。取2ml N1-NTAHis Bind親和樹脂裝柱，用1ml去離子水洗柱，后用結(jié)合液(20mM咪唑、1mM Tris-HClpH7.9、500mM NaCl)洗柱3_5次，每次Iml。取4ml上清液經(jīng)0.45μπι孔徑濾膜過濾后加入到N1-NTA His Bind層析柱上，使其靠重力自然留出。用結(jié)合液將層析柱中的雜蛋白洗下來，每次2ml，洗4次。之后用2ml咪唑濃度為200mM的洗脫液洗脫LASI重組蛋白。對含有LASI重組蛋白的洗脫液進(jìn)行透析，透析液組成為0.05mM Tris-HCl (pH7.4)、10 %甘油，透析袋分子量為8000-14000。每12h換一次液，透析2天后，收集透析袋中的蛋白液，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0035]實(shí)施例3:LASI重組蛋白抑制小菜蛾的α-淀粉酶，及枯草桿菌蛋白酶的活性。
[0036]I )LASI對小菜蛾α-淀粉酶的抑制活性
[0037]⑴小菜蛾α-淀粉酶粗提液的制備
[0038]小菜蛾均購自河南白云生物農(nóng)藥公司。將小菜蛾幼蟲(4-5齡)加入液氮研磨，加入
0.15Μ NaCl進(jìn)行勻漿，后用lOOOOrpm，10分鐘離心得上清即為小菜蛾α-淀粉酶粗提液。
[0039](2)LASI對小菜蛾α-淀粉酶活性的抑制作用
[0040]①25μ1小菜蛾α-淀粉酶粗提液(蛋白濃度以10mg/ml計(jì)算)與50μ1LASI重組蛋白(蛋白濃度以0.783mg/ml計(jì)算)混合均勾后，37°C處理1min;
[0041 ]②將①的混合液加入到1ml 0.15%可溶性淀粉溶液(內(nèi)含0.15% (v/w)可溶性淀粉，50mM的醋酸鈉緩沖液(pH5.0)，ImM CaCl2)中，37°C處理1min ；
[0042]③取200μ1反應(yīng)液，加入750μ1反應(yīng)終止液(內(nèi)含0.05M HCl，180mg KI/ml，18mg12/ml)，終止反應(yīng);混合均勻后測定640nm波長下的吸光度；
[0043]④以不加入LASI的反應(yīng)管對照。
[0044]2)LASI對枯草桿菌蛋白酶的抑制活性
[0045]⑴ΙΟμΙ枯草桿菌蛋白酶(lmg/ml，CAS編號9014-01-1)和ΙΟμΙ LASI重組蛋白(蛋白濃度為0.783mg/ml計(jì)算)在37°C混合、保溫1min。將混合液加入到Iml牛血清白蛋白(Img/ml)溶液中，37 °C反應(yīng)I Omin，使用BCA試劑盒測定剩余蛋白含量。
[0046]⑵以不加入LASI的反應(yīng)管對照。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一段川芎α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑LASI基因序列，其特征如序列表SEQ IDN0.1所示。2.權(quán)利要求1所述基因序列的LASI重組蛋白，其氨基酸如序列表SEQID N0.2所示。3.利用SEQID N0.1構(gòu)建原核重組載體獲得LASI重組蛋白的方法，轉(zhuǎn)化大腸桿菌形成基因工程菌，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、N1-NTA His Bind層析柱純化，獲得純度為95%的LASI重組蛋白，所述LASI重組蛋白能夠有效抑制小菜蛾的α-淀粉酶、及枯草桿菌蛋白酶的活性，包括以下步驟: a)傘形科植物j11芎根莖α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑LASI基因的獲得； b)LASI原核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)純化。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，a)步驟包含如下具體工藝: 1)提取川芎根莖總RNA，檢測j11芎總RNA質(zhì)量； 2)cDNA的合成； 3)用分別帶有BamHI和EcoRI雙酶切位點(diǎn)的引物從川芎cDNA中通過PCR擴(kuò)增出川芎LASI基因序列。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，b)步驟包含如下具體工藝: 1)將擴(kuò)增出來的LASI基因序列和pET28-a載體分別用BamHI和EcoRI雙酶切消化，獲得兩端帶有粘性末端的片段，用T4DNA連接酶連接兩個片段，獲得連接好的重組質(zhì)粒； 2)取ΙΟμΙ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliRosetta感受態(tài)細(xì)胞；將轉(zhuǎn)化成功的重組E.co IiRosetta基因工程菌涂布于含有(10mg/L)卡那霉素和氯霉素(25mg/L)的平板中篩選陽性克??； 3)將初步篩選出來的重組菌株用菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定后，經(jīng)測序以確定閱讀框的正確，得到預(yù)期的重組菌株； 4)發(fā)酵擴(kuò)大重組菌株: ⑴.LB發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L;溶解后，高溫高壓滅菌； ⑵.發(fā)酵條件:37 °C，200rpm將重組菌株培養(yǎng)至0D600?0.6;加入IPTG，使其終濃度為ImM，37 °C 培養(yǎng) 8-1 Oh。
【文檔編號】C12N15/29GK106047892SQ201610552488
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月14日
【發(fā)明人】廖海, 周嘉裕, 俞繼華, 李洋洋, 向緬, 朱建全
【申請人】西南交通大學(xué)