整合子In1287的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的整合子In1287，其序列如SEQ ID NO.1所示。該整合子是在一種耐藥肺炎克雷伯菌KP1262的基因組中發(fā)現(xiàn)的。因此本發(fā)明的上述整合子的發(fā)現(xiàn)一方面對(duì)從基因水平上探討細(xì)菌耐藥性轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義；另一方面為臨床用藥提供了一定的指導(dǎo)作用，有利于臨床上減少某些抗菌藥物的使用，降低該類耐藥基因盒水平轉(zhuǎn)移的選擇壓力，防止耐藥細(xì)菌的爆發(fā)性流行。
【專利說明】
整合子I n1287
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)及耐藥細(xì)菌監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，設(shè)及一種新發(fā)現(xiàn)的與肺炎克雷 伯菌耐藥性密切相關(guān)的整合子Inl287。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎克雷伯菌是一種常見的革蘭陰性條件致病菌，為醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌， 易感患者群廣泛。在醫(yī)院感染中，可通過患者間或經(jīng)呼吸機(jī)、靜脈通路及醫(yī)護(hù)人員的途徑傳 播，克雷伯桿菌肺炎病情嚴(yán)重，死亡率極高。起病急，主要癥狀為寒戰(zhàn)、高熱，呼吸道癥狀為 咳嗽、咳疲、呼吸困難及胸痛。典型疲液為粘稠血性，黏液樣或磚紅色膠凍樣或果醬樣，無腥 臭，臨床描述為無核小葡萄干性膠凍樣疲，疲量多。發(fā)病早期即可出現(xiàn)毒血癥表現(xiàn)、休克，應(yīng) 警惕本病可能。
[0003] 細(xì)菌耐藥機(jī)制-整合子（integron)系統(tǒng)得到研究者們的廣泛注意，并取得了很大 的發(fā)展。整合子通過整合酶的作用，具有捕獲外源基因并使之成為功能性基因表達(dá)的單位， 起源于基因的突變，導(dǎo)致細(xì)菌具有耐藥及多重耐藥特性，造成細(xì)菌多重耐藥性的傳播。在整 合子介導(dǎo)細(xì)菌的耐藥機(jī)制中，一型整合子起著非常重要的作用。大部分的耐藥基因水平傳 播都是由I型整合子介導(dǎo)的。因此調(diào)查研究肺炎克雷伯菌、擴(kuò)增I型整合子基因和檢測(cè)I型整 合子分子流行病學(xué)情況對(duì)從基因水平上探討細(xì)菌耐藥性轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要的理論 和實(shí)踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種含有耐藥基因盒的整合子，將其命名為Inl287,其序列如SEQ ID NO. 1所示。該整合子含有catB3和aacA4基因盒。含有該整合子的菌株KP1262對(duì)多種抗生 素藥物具有抗性。運(yùn)些抗生素包括:氨基糖巧類抗生素、橫胺類抗生素。
[0005] 常見的氨基糖巧類抗生索包括:鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米 星、阿米卡星。
[0006] 常見的橫胺類抗生素包括：橫胺異惡挫（SIZ)、橫胺二甲喀晚（SM2)、橫胺喀晚 (SD)、橫胺甲惡挫（SMZ)、橫胺間甲氧喀晚（SMM)、柳氮橫化晚（SASP)、橫胺米隆（SML)、橫胺 喀晚銀、橫胺醋酷(SA)、W及復(fù)方新諾明（甲氧節(jié)晚+橫胺甲惡挫）。
[0007] 本發(fā)明的整合子是通過W下方法獲得的：
[000引（1)在臺(tái)州市立醫(yī)院神經(jīng)外科病人疲液培養(yǎng)陽性的標(biāo)本中分離出1株對(duì)妥布霉素 和阿米卡星耐藥的細(xì)菌；
[0009] (2)然后將分離的單克隆菌株按操作程序用VITEK 2和藥敏平板瓊脂擴(kuò)散方法(補(bǔ) 充藥敏紙片）進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，經(jīng)鑒定此菌株為肺炎克雷伯菌，將其命名為 KP1262;同時(shí)，試驗(yàn)證實(shí)此菌株對(duì)多種抗生素有顯著抗性;所述抗生素阿米卡星、妥布霉素、 下胺卡拉、慶大霉素和橫胺甲惡挫；
[0010] (3)將KP1262菌株培養(yǎng)擴(kuò)增，提取所述耐藥菌株的質(zhì)粒；
[0011] (4)將步驟(3)提取純化后的質(zhì)粒使用BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離得到一段 長度約3，160bp的DNA片段，將該DNA片段W常規(guī)方法與PMD19-T載體連接，然后熱激轉(zhuǎn)化法 轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E. coli T0P10中，W藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)挑選陽性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序；
[0012] (5)利用ContigE邱ress Program軟件進(jìn)行序列拼接，分析其結(jié)構(gòu)，鑒定出序列如 沈Q ID NO. 1所示的序列。
[0013] 進(jìn)一步，步驟(4)的具體操作步驟如下步驟(3)獲得的質(zhì)粒為模板，利用表1中 的引物進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增：
[0014] 表1引物序列
[0015]
[0016] 12345 將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收所有擴(kuò)增出的片段，然后將該DNA片段 按(4)操作測(cè)序。 2 分析SEQ ID NO.1所示的序列，發(fā)現(xiàn)該序列與傳統(tǒng)的整合子的結(jié)構(gòu)不同，SEQ ID NO. 1中含有的基因盒位于整合子3'-CS序列的下游，而傳統(tǒng)的基因盒位于整合子5'-CS和 3'-CS序列中間。為了證明SEQ ID NO. 1中的基因盒確實(shí)作為整合子的一部分隨著整合子的 轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)移，本發(fā)明利用細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)來證明SEQ ID NO. 1是一個(gè)完整的整合子。具體 操作如下:將KP1262菌株與E.coli J53AzK(對(duì)疊氮化鋼耐藥)菌株共培養(yǎng)，通過含疊氮化鋼 (300mg/L)和阿米卡星(0.06mg/L)平板篩選接合子，一方面提取接合子DNA，測(cè)序，驗(yàn)證SEQ ID NO. 1作為一個(gè)整體存在；另一方面將接合子做藥敏試驗(yàn)，證明受體菌擁有供體菌的抗 性。其中，所用阿米卡星可用下列藥物代替:鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米 星、復(fù)方新諾明、橫胺甲惡挫。 3 本發(fā)明的整合子序列可W商業(yè)合成。 4 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果： 5 (1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了序列為SEQ ID N0.1的整合子Inl287,該整合子的核巧酸序 列在現(xiàn)有技術(shù)中未見報(bào)道。
[0022] (2)本發(fā)明整合子序列的發(fā)現(xiàn)，一方面對(duì)從基因水平上探討細(xì)菌耐藥性轉(zhuǎn)移的分 子機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義；另一方面為臨床用藥提供了一定的指導(dǎo)作用，有利于 臨床上減少某些抗菌藥物的使用，降低該類耐藥基因盒水平轉(zhuǎn)移的選擇壓力，防止耐藥細(xì) 菌的爆發(fā)性流行。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明的整合子Inl287的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024] 具體的實(shí)施方式
[0025] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人， 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring 化rbor Laboratory Press, 1989)中所描 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0027] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[002引實(shí)施例1整合子Inl287的鑒定
[0029] UKP1262菌株的分離和鑒定
[0030] 1.1材料
[0031] 細(xì)菌藥敏卡：法國bioMerieux的AST-GN13eAST-GN13藥敏種類有：阿米卡星、氨節(jié) 西林、氨節(jié)西林/舒己坦、氨曲南、頭抱挫嘟、頭抱化朽、頭抱替坦、頭抱他定、頭抱曲松、環(huán)丙 沙星、厄他培南、慶大霉素、亞胺培南、左氧氣沙星、巧喃妥因、贓拉西林/他挫己坦、妥布霉 索、橫胺甲惡挫。
[0032] 補(bǔ)充藥敏紙片(藥敏平板瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)）：紙片來源于英國化oid公司，有復(fù)方新諾 明（30iig)、奈替米星(3化邑）。
[0033] 1.2 方法
[0034] 儀器鑒定:將臺(tái)州市立醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室病人脈液培養(yǎng)陽性的菌株轉(zhuǎn)種到血平板上 分離培養(yǎng)（在35°C含5%C02解育箱中培養(yǎng)16-18h)，然后將分離的純細(xì)菌按操作程序在 V口邸2上機(jī)作細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn)。
[0035] 補(bǔ)充藥敏試驗(yàn):將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木和磕ㄔ贛H平板上，按操作程序貼上復(fù)方新諾 明、奈替米星紙片，在35°C含5%C02解育箱中培養(yǎng)16-1化后，按化SI 2015標(biāo)準(zhǔn)鑒定藥敏結(jié) 果。
[0036] 1.3 結(jié)果
[0037] 1.3.1儀器鑒定結(jié)果
[003引經(jīng)VITEK 2微生物分析儀鑒定為肺炎克雷伯菌，鑒定概率為99%，將其命名為 KP12620
[0039] 1.3.2藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0040] 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KP1262菌株對(duì)于W下藥物產(chǎn)生抗性:阿米卡星、妥布霉素、卡 拉霉素、慶大霉素、奈替米星、復(fù)方新諾明、橫胺甲惡挫。
[0041] 2、整合子Inl287的獲取和鑒定
[0042] 2.1 方法
[0043] 2.1.化P1262菌株的質(zhì)粒提取
[0044] 采用化KaRa的質(zhì)粒少量提取試劑盒，按照說明書操作步驟提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA，作為 PCR模板，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0045] 2.1.2整合子序列擴(kuò)增
[0046] W上述提取的質(zhì)粒為模板，利用表1中的引物進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增。
[0047] 將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收所有擴(kuò)增出的片段，W常規(guī)方法將擴(kuò)增 片段分別與PMD19-T載體連接，然后熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E. col i T0P10中，W藍(lán)白斑 實(shí)驗(yàn)挑選陽性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序。
[004引 2.1.3序列拼接
[0049] 將上述擴(kuò)增出的DNA片段利用ContigExpress Program軟件進(jìn)行序列拼接，分析結(jié) 構(gòu)，鑒定出序列如SEQ ID NO. 1所示的整合子，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。
[0050] 實(shí)施例2質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究整合子Inl287的功能
[0051] 1、方法
[0052] (1)供體菌為KP1262菌株，受體菌為E.coli J53AzK(對(duì)疊氮化鋼耐藥）。將供體菌、 受體菌分別接種于LB平板上，35°C過夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落分別接種于4mL的LB肉湯中，37 °C 22化/min搖菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。各取0.5血供、受體菌于4血的LB肉湯中，37 °C靜止過夜 培養(yǎng)。接合子W膜大豆瓊脂（TSA)平皿篩選，平板中含疊氮化鋼（300mg/L)和阿米卡星 (0.06mg/L)。置35°C解育18-2地。提取耐藥菌株的質(zhì)粒(步驟同實(shí)施例1)為PCR擴(kuò)增模板，使 用表1中的引物檢測(cè)整合子基因序列是否存在。
[0053] (2)選取包含上述基因片段的陽性菌株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，步驟同實(shí)施例1。
[0054] 2、結(jié)果
[0055] 測(cè)序結(jié)果顯示，接合子中含有完整的整合子Inl287序列，序列信息如SEQ ID N0.1;藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，整合子Inl287序列表達(dá)陽性菌株的藥敏反應(yīng)同KP1262菌株相同。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明整合子Inl287序列接合轉(zhuǎn)移成功，且該整合子導(dǎo)致了接合細(xì)菌產(chǎn)生了對(duì) 下列藥物的抗性:阿米卡星、妥布霉素、卡拉霉素、慶大霉素、奈替米星、復(fù)方新諾明、橫胺甲 惡挫。
[0056] 上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種整合子，其特征在于，所述整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名為 Inl287〇2. -種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒中包含權(quán)利要求1所述的整合子。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒的制備過程中使用的載 體質(zhì)粒為PMD19-T載體。4. 一種接合細(xì)菌，其特征在于，所述接合細(xì)菌中含有權(quán)利要求1所述的整合子;所述接 合細(xì)菌是由KP1262菌株與E.coliJ53 AzR菌株制備。5. -種重組細(xì)菌，其特征在于，所述重組細(xì)菌中含有權(quán)利要求1所述的整合子;所述重 組細(xì)菌是將權(quán)利要求2或3所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli T0P10菌株中制備而成。6. 權(quán)利要求1所述的整合子的獲取方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 在臺(tái)州市立醫(yī)院神經(jīng)外科病人痰液培養(yǎng)陽性的標(biāo)本中分尚出1株對(duì)安布霉素和阿 米卡星耐藥的細(xì)菌； (2) 然后將分離的單克隆菌株按操作程序用VITEK 2和藥敏平板瓊脂擴(kuò)散方法進(jìn)行細(xì) 菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，經(jīng)鑒定此菌株為肺炎克雷伯菌，將其命名為KP1262;同時(shí)，試驗(yàn)證實(shí)此 菌株對(duì)多種抗生素有顯著抗性;所述抗生素阿米卡星、妥布霉素、卡拉霉素、慶大霉素、復(fù)方 新諾明和磺胺甲惡唑； (3) 將KP1262菌株培養(yǎng)擴(kuò)增，提取所述耐藥菌株的質(zhì)粒； (4) 將步驟(3)提取純化后的質(zhì)粒使用BamM酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離得到一段長度 約3，160bp的DNA片段，將該DNA片段以常規(guī)方法與pMD 19-T載體連接，然后熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入 感受態(tài)細(xì)胞E. coli T0P10中，以藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)挑選陽性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序； (5) 利用ContigExpress Program軟件進(jìn)行序列拼接，分析其結(jié)構(gòu)，鑒定出序列如SEQ ID NO. 1所示的序列。7. -種權(quán)利要求4所述的接合細(xì)菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法的具體操作 步驟如下：將KP1262菌株與E.coli J53 AzR菌株共培養(yǎng)，通過含有疊氮化鈉和KP1262菌株 耐受藥物的平板篩選接合子。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述KP1262菌株耐受藥物是阿米卡 星。9. 一種權(quán)利要求5所述的重組細(xì)菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法的具體操作 步驟如下：將整合子Inl287克隆入pMD19-T載體中，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入野生型E.coli T0P10中，通過含有阿米卡星的平板選陽性克隆。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK106047900SQ201610329150
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】王冬國, 楊林軍, 陳佳玉
【申請(qǐng)人】王冬國