AtPrx64基因在鋁脅迫下提高植物硝態(tài)氮吸收中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了AtPrx64基因在鋁脅迫下提高植物硝態(tài)氮吸收中的應(yīng)用；將AtPrx64基因重組到植物表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化野生型煙草，通過篩選獲得轉(zhuǎn)AtPrx64基因煙草；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AtPrx64基因轉(zhuǎn)入煙草能夠提高質(zhì)膜H+?ATPase磷酸化水平及增強(qiáng)與14?3?3蛋白的互作，從而提高質(zhì)膜H+?ATPase活性及氫泵活性來提高對(duì)硝態(tài)氮的吸收量，轉(zhuǎn)AtPrx64煙草能顯著提高鋁脅迫下煙草對(duì)硝態(tài)氮的吸收量。
【專利說明】
/I tPrx64基因在鋁脅迫下提高植物硝態(tài)氮吸收中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及基因在鋁脅迫下提高植物硝態(tài)氮吸收中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]氮素是植物吸收的主要元素之一，是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素，對(duì)氮素的吸收直接影響作物的產(chǎn)量及品質(zhì)。植物吸收NO3-是由硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT)負(fù)責(zé)的主動(dòng)運(yùn)輸過程，這個(gè)過程需要質(zhì)膜H+-ATPase提供質(zhì)子和能量。質(zhì)膜H+-ATPase調(diào)控氮素營(yíng)養(yǎng)吸收機(jī)理的研究結(jié)果表明在質(zhì)膜H+-ATPase的作用下，ATP供能將H+栗出胞外(H+分泌和釋放)，在H+形成的電勢(shì)梯度下，伴隨H+的同向運(yùn)輸NO3-通過通道蛋白逆濃度梯度進(jìn)入胞內(nèi)，使質(zhì)外體空間堿化。在磷酸激酶的作用下質(zhì)膜H+-ATPase磷酸化形成磷酸化質(zhì)H+-ATPase,然后再與14-3-3蛋白互作形成14-3-3和磷酸化質(zhì)膜H+-ATPase蛋白復(fù)合體，激活H+-ATPase活性，利用ATP水解產(chǎn)生的能量將細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的H+栗出到質(zhì)膜外側(cè)，由此能夠產(chǎn)生跨膜pH梯度和跨膜電勢(shì)梯度，此電化學(xué)梯度為NO3-跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供驅(qū)動(dòng)力，促進(jìn)NO3-的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)鋁會(huì)影響植物對(duì)氮素的吸收，但是硝態(tài)氮(N03—)是高等植物重要的信號(hào)分子，能夠誘導(dǎo)植物抗氧化酶基因及植物抗性基因等的表達(dá)。研究表明，硝態(tài)氮的吸收與質(zhì)膜H+-ATPase有關(guān)，物質(zhì)的逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)耗能的過程，質(zhì)膜H+-ATPase產(chǎn)生的跨膜的電動(dòng)勢(shì)為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的逆濃度梯度提供能量。高親和性和低親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)N03—的吸收都依賴于質(zhì)膜H+-ATPase提供的能量與質(zhì)子。這兩種吸收形式都是NO3-在H+的陪伴下主動(dòng)運(yùn)輸，被植物根系吸收的硝態(tài)氮只有很少一部分在根系中被還原，大部分需要通過導(dǎo)管運(yùn)輸?shù)降厣喜糠趾筮€原為錢，而多余的硝酸鹽存儲(chǔ)在液泡中。
[0004]通過抑制雜交減差法(SSH)在硝態(tài)氮誘導(dǎo)條件下的小麥根系中分離出55個(gè)基因，包括植物抗性基因、過氧化物酶基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因及蛋白合成基因等，并且在外源硝態(tài)氮的供應(yīng)下這些基因的表達(dá)量相對(duì)提高，這表明硝態(tài)氮的吸收對(duì)提高植物抗逆境作用具有重要的意義。本發(fā)明在對(duì)過氧化物酶基因的研究中發(fā)現(xiàn):在鋁脅迫條件下，轉(zhuǎn)
(POD)基因植株通過提高抗氧化酶活性和一定程度的清除活性氧而減少對(duì)膜H+-ATPase造成影響，從而提高植物對(duì)硝態(tài)氮的吸收。因此利用基因工程手段獲得過表達(dá)直株對(duì)鋁脅迫下提高植物硝態(tài)氮的吸收有很大作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基因的新用途，基因在鋁脅迫下提高植物硝態(tài)氮吸收中的應(yīng)用財(cái)基因?yàn)閿M南芥第三類過氧化物酶基因，GenBank登錄號(hào)為:145358744;獲得的鋁脅迫下增加對(duì)硝態(tài)氮的吸收的轉(zhuǎn)基因植物可以用于對(duì)該基因的進(jìn)一步研究，也可以種植于強(qiáng)酸性土壤鋁毒害土壤。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
(I)選擇模式植物煙草和擬南芥第三類過氧化物酶基因作為材料，進(jìn)行了以下試驗(yàn):
(2)采用Gateway技術(shù)構(gòu)建基因的植物表達(dá)載體pK_35S_AtPrx64:用TRIzolReagent試劑按照說明書提取擬南芥總RNA ；并反轉(zhuǎn)錄獲得A ?Ρη份的cDNA，使用d tPrx64基因引物[上游引物5 '-GGATCCATGAATGCACACATGCTCAATCTCC(含BamHI 酶切位點(diǎn))，下游為:T-CTCGAGCTAGCGAACCCTTCTGCAGTTAAGT (含XhoI酶切位點(diǎn))]進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得獲得^ 編碼區(qū)全長(zhǎng)DNA片段;通過酶切連接到pMD 18-T載體上，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，通過抗性篩選及測(cè)序獲得含正確序列的TA克隆;再進(jìn)行酶切連接將片段連接到pENTR-2B載體上，通過抗性篩選及測(cè)序獲得入門載體pENTR- A tPrx64；根據(jù)LR反應(yīng)試劑盒LR Clonase?plus Enzyme Mix(購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司)說明書，通過LR反應(yīng)將JtPrx份重組到目的載體PK2GW7上，獲得植物表達(dá)載體pK-35S- A tPrx64-,用電轉(zhuǎn)化法將pK_35S_ A 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，用篩選檢測(cè)正確的農(nóng)桿菌通過葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型煙草，獲得再生植株并進(jìn)行以下篩選及檢測(cè)；
(3)通過抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株，再進(jìn)行基因組、mRNA水平、蛋白表達(dá)水平及POD活性的檢測(cè)，獲得多株轉(zhuǎn)基因煙草(AtPrx64-l至AtPrx64-6)，選取POD活性最高的AtPrx64-6(P0D6)并擴(kuò)繁；
(4)將野生型煙草和P0D6煙草在霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯植株，用含0.5 mM 0&(:12的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液(？財(cái).3)預(yù)處理過夜，然后添加0、50、100、200、400 μM AlCl3處理，收集根尖，液氮速凍，-80°C凍存?zhèn)溆茫詫?duì)各項(xiàng)鋁抗性指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)組做6個(gè)重復(fù)，以未加A1C13(0 μΜ)處理的作為對(duì)照組。
[0007]本發(fā)明選擇將基因轉(zhuǎn)入煙草中，提高了煙草在鋁脅迫下對(duì)硝態(tài)氮的吸收，將為我們對(duì)該基因的功能做進(jìn)一步研究提供材料，還可將該轉(zhuǎn)基因煙草種植于鋁毒害的酸性土壤上，也為研究其他相關(guān)基因提供了思路。
[0008]本發(fā)明的有益效果:
將擬南芥/???基因重組到植物表達(dá)載體pK2GW7中，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型煙草(WT)，通過抗生素篩選和mRNA水平、蛋白表達(dá)水平及POD活性檢測(cè)成功獲得轉(zhuǎn)基因煙草;不同濃度鋁處理結(jié)合15mmol NO3—處理下該轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的硝態(tài)氮吸收量、質(zhì)膜H+-ATPase活性、氫栗活性、14-3-3表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因煙草d??Μ-6中A有顯著表達(dá)，總POD活性明顯上升;在鋁脅迫條件下，硝態(tài)氮的吸收量隨著鋁濃度的增加而逐漸降低，但在相同鋁濃度條件下轉(zhuǎn)POD煙草植株對(duì)硝態(tài)氮的吸收量明顯高于WT;在沒有鋁處理?xiàng)l件下，POD植株H+-ATPase磷酸化水平明顯高于WT，與之互作的14-3-3蛋白也高于WT;鋁處理后，POD轉(zhuǎn)基因植株氫栗活性、質(zhì)膜H+-ATPase活性及質(zhì)膜H+-ATPase與14-3-3蛋白互作水平與對(duì)照比較均降低，但這三項(xiàng)指標(biāo)均高于WT。這說明POD基因轉(zhuǎn)入煙草能夠提高質(zhì)膜H+-ATPase磷酸化水平及增強(qiáng)與14-3-3蛋白的互作，從而提高質(zhì)膜H+-ATPase活性及氫栗活性來提高對(duì)硝態(tài)氮的吸收量。以上結(jié)果說明，轉(zhuǎn)草能顯著提高鋁脅迫下煙草對(duì)硝態(tài)氮的吸收量。
[0009]本發(fā)明所述轉(zhuǎn)d基因煙草P0D6，容易通過無性繁殖的方式保存種質(zhì)資源，可以通過栽培獲得種子進(jìn)行保存，容易推廣種植。此外還可以通過對(duì)P0D6煙草和野生型煙草的結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)的比較對(duì)基因的功能及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。
【附圖說明】
[0010]圖1是本發(fā)明中對(duì)轉(zhuǎn)d ?Ρη份基因煙草基因組中J ?Ρη份基因的檢測(cè)；
圖2是本發(fā)明中對(duì)轉(zhuǎn)d基因煙草dtPrx64 mRNA水平的檢測(cè)；
圖3是本發(fā)明中對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草基因的蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)；
圖4是本發(fā)明中對(duì)轉(zhuǎn)d 基因煙草中總POD活性的檢測(cè)；
圖5是本發(fā)明中不同濃度鋁脅迫下禱專基因煙草過表達(dá)和野生型煙草(WT)硝態(tài)氮吸收量的比較，其中A圖為處理Id的結(jié)果，B圖為處理4d的結(jié)果；
圖6是本發(fā)明中對(duì)禱?；驘煵莺鸵吧蜔煵?WT)根質(zhì)膜H+-ATPase活性的比較；
圖7是本發(fā)明中對(duì)AtPrx64轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草(WT)根氫栗活性的比較，A圖是O μmo I Al處理，B圖是200 ymol Al處理;
圖8是本發(fā)明中對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草(WT)根14-3-3蛋白互作的比較；
圖9是本發(fā)明中對(duì)野生型煙草在鋁脅迫和硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)條件下的葉片中14-3-3基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)；
圖10是本發(fā)明中對(duì)野生型煙草在鋁脅迫和硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)條件下的葉片中PMA基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面通過實(shí)例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。實(shí)施例中方法如無特殊說明，按常規(guī)操作進(jìn)行，如無特殊說明使用試劑均為常規(guī)購(gòu)試劑或按常規(guī)方法配制的試劑，如無特殊說明方法中百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0012]實(shí)施例1 JiPri癌因cDNA片段的獲得
用TRIzol Reagent試劑按照說明書提取擬南芥總RNA。具體操作步驟如下:取植物嫩葉約0.1g放入加有液氮的研缽中，充分研磨成粉末;加入I mL TRIzoL試劑在研缽中繼續(xù)研磨成溶液狀，室溫靜置5 min后移入2 mL離心管;然后加入200 pL氯仿，振蕩15 s混勻，4°C、12000 rpm離心15min;將上清液轉(zhuǎn)移至新2 mL EP管，加入500 pL異丙醇，混勾，-20。<3放置 10 min；4 °C ^ 12000 rpm離心 10 min;棄上清，沉淀用75% 乙醇0.8-1 mL 清洗；4°C、12000 rpm離心I min，棄75%乙醇；重復(fù)洗I次以徹底出去鹽雜質(zhì)；真空干燥沉淀或自然晾干，用20 UL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0013]取2 uL上述DEPC水溶解的RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，檢測(cè)到RNA提取完好后，再取2 yL總RNA進(jìn)行M-MLV反轉(zhuǎn)錄，方法參照Fermentas試劑公司說明書。反轉(zhuǎn)錄過程如下:2 pL RNA、9pL DEPC處理水、4 pL 01igo(dT)，72 °C金屬浴10 min后立即冰浴5 min，再添加2 pL dNTP和I yL的RNA酶抑制劑，1.5 pL的反轉(zhuǎn)錄酶、5 pL反轉(zhuǎn)錄buffer，42 °C保溫60 min后迅速置于70 °C中使反轉(zhuǎn)錄酶變性，5 min后取出，即獲得擬南芥cDNA。
[0014]根據(jù)GenBank(登錄號(hào)為:145358744)上發(fā)表的擬南芥基因序列全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)PO/堪因上游引物為5-GGATCCATGAATGCACACATGCTCAATCTCC(含BamHI酶切位點(diǎn))，下游為3-CTCGAGCTAGCGAACCCTTCTGCAGTTAAGT (含XhoI酶切位點(diǎn))。以提取的擬南芥cDNA為模板，以設(shè)計(jì)的份引物用Ex Taq酶mix進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，膠回收獲得AjpTjt份基因編碼區(qū)全長(zhǎng)，即目的片段。
[0015]實(shí)施例2:^^/^^4基因植物表達(dá)載體?1(-353- AtPrx64的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草
將d 基因的cDNA片段連接到pMD-18T載體上，熱激轉(zhuǎn)化DH5a，通過氨芐青霉素篩選得到有抗性的單菌落，PCR和雙酶切檢測(cè)正確后測(cè)序，測(cè)序工作委托華大基因完成。測(cè)序正確的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后連接到入門克隆載體PENTR-2B上，熱激轉(zhuǎn)化DH5a，卡那霉素(Km)篩選得到有抗性的單菌落，雙酶切檢測(cè)、測(cè)序后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒獲得入門克隆載體PENTR-2B- AtPrx64。在LR Mix Enzyme作用下，目的載體pK2GW7和入門克隆載體PENTR-2B- AtPrx64和進(jìn)行LR重組反應(yīng)后轉(zhuǎn)化DH5a，經(jīng)壯觀霉素(Spe)篩選檢測(cè)后獲得植物表達(dá)載體PK-35S- AtPrx64。
[0016]通過電轉(zhuǎn)化法將pK-35S- AtPrx64轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌pMP90中，Spe篩選獲得陽(yáng)性克隆菌株，將檢測(cè)正確的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后通過葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型煙草，轉(zhuǎn)染后將煙草葉片放在含有Km和頭孢噻肟鈉(Cef)的MS4培養(yǎng)基上誘導(dǎo)外植體發(fā)芽，兩周換一次培養(yǎng)基。待轉(zhuǎn)染的葉片生長(zhǎng)出芽后，切下長(zhǎng)勢(shì)好的芽放入含Cef和Km的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽生根。約I個(gè)月后提取煙草幼苗葉片基因組DNA、RNA和總蛋白，檢測(cè)擬南芥AtPrx64在煙草中的整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況。
[0017]實(shí)施例3:轉(zhuǎn)基因植株的基因組、mRNA水平、蛋白表達(dá)水平及POD活性的檢測(cè)
(I )A tPrx6m因在煙草基因組中的整合情況檢測(cè):用CTAB法從煙草葉片中提取基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)d 在轉(zhuǎn)基因煙草基因組中的整合情況。取0.1 g煙草的葉片迅速放入液氮中冷凍，在研缽中快速研磨至粉末狀，加入預(yù)熱到65 °C的2 X CTAB緩沖液900 pL(20 mM EDTA，2% CTAB和1.4 M NaCl)，研磨混勻后65 °C水浴15 min，冷卻后加入500 HL氯仿-異戊醇(24:1)混合液上下顛倒搖勻后室溫離心。取上清于EP管后加入等體積的異丙醇和1/10醋酸鈉混勻后置于-20 0C放置20 min，于4 °C離心機(jī)離心20 min。棄上清后，用乙醇清新兩次，真空干燥，最后用RNase的TE緩沖液溶解，37 °C放置20 min后取出用于PCR檢測(cè)，有條帶證明有d tPrx64m因的整合，共獲得了 6株整合了擬南芥AtPrx64基因的轉(zhuǎn)基因煙草(如圖1所示)
(2)用RNA提取試劑(TRIzol ? Reagent)提取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草根的總RNA，提取步驟參照說明書進(jìn)行。取3 Hg的總RNA進(jìn)行RT-PCR，取3 yL總RNA后加入10 yL體系(1.5 yLoligc^P8.5 uL DEPC水)于70°C金屬浴5 min后立即置于冰上，5 min后再加入12 yL的反應(yīng)體系(I pL M-MLVRT、1 pL RNA 酶抑制劑、1.5 pL dNTP、3.5 pL DEPC水、5 pL MLV-byffer)于42 °(:金屬浴，I h后取出于72 °C保溫10 min即獲得煙草的cDNA，放_(tái)20°C保存?zhèn)溆谩Ｒ苑崔D(zhuǎn)錄成的cDNA為模板進(jìn)行d iPrJT財(cái)?shù)膍RNA表達(dá)分析。有條帶的證明有d的
mRNA轉(zhuǎn)錄，結(jié)果如圖2所示，野生型煙草無條帶，說明沒有d 的mRNA轉(zhuǎn)錄，6株轉(zhuǎn)基因煙草均有J tPrjr份的mRNA轉(zhuǎn)錄。
[0018](3)轉(zhuǎn)基因煙草中基因的蛋白表達(dá)情況檢測(cè):取0.5 g煙草根，用液氮速凍后充分研磨，加入900 uL蛋白抽提液(100 mM Tris-HCl，pH 8.8,1 mM PMSF、10%甘油及5% PVP和10 mM硫基乙醇)，置于冰上5 min后，4°C，12000 rpm離心5 min后取上清即獲得總蛋白液，Bradf ord法測(cè)蛋白含量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，通過半干式轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF上，5%的脫脂奶粉室溫封閉I h后，用PBS清洗PVDF膜3次，每次5 min;加入1yL的AtPER64 份基因表達(dá)的蛋白)特異性抗體(兔抗，由本實(shí)驗(yàn)室自ffjij)與PVDF膜一起常溫孵育2 h;用PBS清洗PVDF膜3次后，再加入連有辣根過氧化物酶的羊抗兔二抗，常溫孵育Ih;最后加入ECL發(fā)光底物反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)觀察照相(圖3)。
[0019](4)總過氧化物酶(POD)活性測(cè)定(愈創(chuàng)木酚法):總POD活性測(cè)定參照Chance等的愈創(chuàng)木酚方法[35]。首先取水培2周的煙草，用0.5 mM CaCl2、ρΗ*4.3的hongland’s營(yíng)養(yǎng)液預(yù)處理12 h后，再用濃度分別為0、50、100、200、400 μΜ的AlCl3處理12 11后，取0.5 g根用液氮速凍后研磨，加入1.5 mL Tris-HCl (pH 7.0)(內(nèi)含有I mMDTT (二硫蘇糖醇)、20%甘油、I mMGSH (還原型谷胱甘肽)、1 mMASA (抗壞血酸)、1 mM EDTA、5 mM MgCl2)抽提，將抽提液轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，于4 °C、12000 rpm、離心15 min，取上清液待測(cè)。反應(yīng)混合液:在50 m L 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液中加入28 yL的愈創(chuàng)木酚，于磁力攪拌器上加熱攪拌直至愈創(chuàng)木酷溶解，再加入19 uL的30% H2O2,混合均勻，4 °C保存。酶活測(cè)定:取反應(yīng)混合液1.5 mL，加入10 pL的樣品提取液，馬上讀470 nm下的OD值，每個(gè)30 s讀一次，讀3 min。以每分鐘OD值的變化表示酶活的大小。結(jié)果如圖4所示，3個(gè)株系轉(zhuǎn)基因煙草中，AtPrx64-6株系的POD酶活性最高。
[0020]實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草(WT)處理的具體步驟如下:
1、實(shí)驗(yàn)材料為轉(zhuǎn)基因煙草P0D6轉(zhuǎn)基因株系和野生型煙草(WT)組培苗。煙草繼代2周后，挑選大小及根系生長(zhǎng)一致的組培苗，在霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯植株，用PH4.3的0.5mM/L的CaCl2預(yù)處理過夜后，用15 mmol/L的KNO3和不同濃度的O、50、100、200、400ymol AlCl3溶液(含有0.5mM CaCl2，pH 4.3)分別處理Id 和4d。對(duì)照只加KNO3不加招處理。
[0021]實(shí)施例5:采用實(shí)施例4中水培兩周的轉(zhuǎn)基因煙草P0D6和野生型煙草(WT)煙草，先用50 mmol pH為4.3的CaCl2預(yù)處理植株，再分別用0、50、100、200和400 ymol鋁及15mmolKNO3處理WT和P0D6轉(zhuǎn)基因煙草I d和4d，以不加鋁，只加KNO3處理的為對(duì)照(CK )。處理后每天測(cè)定處理液中硝態(tài)氮的濃度，根據(jù)處理前后的硝態(tài)氮含量差值計(jì)算WT和P0D6煙草硝態(tài)氮的吸收量。結(jié)果如圖5所示，處理后，招脅迫使WT和P0D6煙草硝態(tài)氮的吸收量減少，且隨著脅迫濃度的增加，兩種煙草硝態(tài)氮的吸收量均明顯降低，其中高濃度(400μπιο1)時(shí)硝態(tài)氮的吸收量最低，但在相同濃度處理?xiàng)l件下，P0D6轉(zhuǎn)基因煙草硝態(tài)氮的吸收量均明顯高于WT。
[0022]硝態(tài)氮吸收量的測(cè)定:根據(jù)中華人名共和國(guó)環(huán)境保護(hù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(HJ/T346-2007)中的紫外分光光度法略作修改測(cè)定農(nóng)田廢水中硝態(tài)氮的濃度。每天取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組四種植物分別處理過的水樣5mL，加入1-2滴氫氧化鋁懸浮液，靜置絮凝，離心后上清液用于硝態(tài)氮濃度測(cè)定。測(cè)定時(shí)用光程長(zhǎng)為1mm的石英比色皿，以新鮮去離子水為參比，分別在220nm和275nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，硝態(tài)氮吸光度的校正值為A22Q-2A275。分別配置含0.25、0.50、1.00、1.50,2.00 mg/L硝酸鹽氮的硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，按水樣測(cè)定相同步驟測(cè)量吸光度，以X軸為標(biāo)準(zhǔn)溶液校正后的吸光度，以Y軸為溶液中所含硝酸鹽氮的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得硝態(tài)氮濃度，單位:mg/L。
[0023]實(shí)施例6:取實(shí)施例4中用鋁處理的煙草，測(cè)定200μπιο1鋁(加15 mmol KNO3營(yíng)養(yǎng))脅迫處理Id后WT和P0D6煙草根尖氫栗活性、質(zhì)膜H+-ATPase活性及其與14-3-3的互作。結(jié)果如圖6、7、8所示，質(zhì)膜H+-ATPase活性與氫栗活性一致，未處理時(shí)P0D6煙草根尖質(zhì)膜H+-ATPase活性明顯高于WT，約為WT的1.35倍，鋁脅迫顯著降低兩種煙草植株質(zhì)膜H+-ATPase活性，但是在200μπιο1 Al脅迫處理?xiàng)l件下P0D6轉(zhuǎn)基因植株H+-ATPase活性仍顯著高于WT，約為WT的1.2倍。這說明POD轉(zhuǎn)入煙草能夠提高質(zhì)膜H+-ATPase活性從而提高氫栗活性，最終引起對(duì)硝態(tài)氮的吸收能力增強(qiáng)。Western和免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果說明，在沒有鋁處理?xiàng)l件下(-Al)，P0D6植株H+-ATPase磷酸化水平明顯高于WT，且與之互作的14_3_3蛋白也高于WT，用200μπιο1鋁處理后(+Al)，與未處理前相比，P0D6和WT煙草H+-ATPase磷酸化水平及其與14-3-3蛋白互作水平均降低，但是P0D6植株H+-ATPase磷酸化水平及與之互作的1-3-3蛋白均高于WT。這說明POD基因轉(zhuǎn)入煙草能夠提高質(zhì)膜H+-ATPase磷酸化水平及增強(qiáng)與14-3-3蛋白的互作，從而提高質(zhì)膜H+-ATPase活性及氫栗活性來提高對(duì)硝態(tài)氮的吸收量。
[0024]實(shí)施例7:取實(shí)施例4中的煙草，用0.5 mmol pH為4.3的CaCl2預(yù)處理生長(zhǎng)一致的WT過夜后，用200μπιο1 Al和15 mmol KNO3處理WT煙草Id和4d，對(duì)照CK為不加鋁和KNO3處理，收集根尖提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為從cDNA，以14-3-3基因亞型(Ntl4-3-3a~Ntl4-3-3i)和質(zhì)膜H+-八丁?386基因亞型(口1]^2、口1]^3、口11^4)為引物檢測(cè)硝態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)條件下招脅迫對(duì)這些基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果如圖9、10所示，硝酸鹽營(yíng)養(yǎng)和41脅迫后，胃1'煙草財(cái)14-3-3&、財(cái)14-3-3(:、財(cái)14-3-3(1、財(cái)14-3-3匕財(cái)14-3-38、財(cái)14-3-311亞型的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，而財(cái)14-3-313亞型較CK相比上升不明顯，Ntl4-3-3e、Ntl4-3-3i亞型轉(zhuǎn)錄水平先上升后下降，脅迫處理Id轉(zhuǎn)錄水平最高，4d后轉(zhuǎn)錄水平與k相比沒有變化;此外，3種不同亞型的質(zhì)膜H+-ATPase基因中，轉(zhuǎn)錄水平均在脅迫處理Id后CK最高，4d后都下降，跟CK相比沒有變化。說明鋁脅迫條件下14-3-3基因亞型和質(zhì)膜H+-ATPase基因亞型的表達(dá)會(huì)上調(diào)以響應(yīng)鋁脅迫，14-3-3基因和質(zhì)膜H+-ATPase基因參與硝態(tài)氮的吸收。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.^ tPrx64m因在鋁脅迫下提高植物硝態(tài)氮吸收中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK106047919SQ201610383899
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】李昆志, 劉文霞, 楊志麗, 張恒麗, 徐慧妮, 陳麗梅, 吳遠(yuǎn)雙
【申請(qǐng)人】昆明理工大學(xué)