一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，提供了一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，該方法包括將CKX1基因轉(zhuǎn)入玉米基因組中的步驟；所述CKX1基因具有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本發(fā)明通過(guò)將CKX1基因轉(zhuǎn)入玉米基因組中，可以誘導(dǎo)玉米植株根中特異表達(dá)CKX1基因，從而促進(jìn)玉米根系的生長(zhǎng)發(fā)育，有利于玉米植株獲得土壤深層的水分，從而提高玉米的抗旱性，同時(shí)還不會(huì)影響玉米在正常水分條件下的生長(zhǎng)發(fā)育。
【專利說(shuō)明】
-種通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別設(shè)及一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是全球種植范圍最廣、產(chǎn)量最大的谷類作物，居=大糧食作物之首。我國(guó)是玉 米生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，播種面積、總產(chǎn)量、消費(fèi)量?jī)H次于美國(guó)，均居世界第二位。但我國(guó)的玉米 生產(chǎn)面臨非常嚴(yán)峻的干旱問(wèn)題，頻繁發(fā)生的旱災(zāi)使玉米產(chǎn)量蒙受了巨大損失，根據(jù)農(nóng)業(yè)部 的統(tǒng)計(jì)，我國(guó)玉米產(chǎn)量發(fā)生波動(dòng)的最主要原因是干旱，例如2000年因嚴(yán)重干旱導(dǎo)致全國(guó)糧 食減產(chǎn)462億公斤，其中玉米減產(chǎn)221億公斤，占減產(chǎn)量的48%。因此培育抗旱玉米新品種對(duì) 我國(guó)糧食生產(chǎn)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，該方法通過(guò)將CKX1 基因轉(zhuǎn)入玉米基因組中，從而大大提高了玉米的抗旱性。
[0004] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將CKX1基因轉(zhuǎn)入玉米基因組中，可W誘導(dǎo)玉 米植株根中特異表達(dá)CKX1基因，從而促進(jìn)玉米根系的生長(zhǎng)發(fā)育，有利于玉米植株獲得±壤 深層的水分，從而提高玉米的抗旱性，同時(shí)還不會(huì)影響玉米在正常水分條件下的生長(zhǎng)發(fā)育。
[0005] 本發(fā)明提供了一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，所述方法包括將CKX1基因 轉(zhuǎn)入玉米基因組中的步驟;所述CKX1基因具有序列表中SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列。
[0006] 優(yōu)選地，該方法包括構(gòu)建CKX1基因的植物表達(dá)載體，并用所述CKX1基因的植物表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米的步驟。
[0007] 優(yōu)選地，所述CKX1基因的植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為PGreen0229質(zhì)粒載體，所述 CKX1基因的植物表達(dá)載體帶有啟動(dòng)子EXP18-D基因、終止子Nos基因和CKX1基因。
[000引優(yōu)選地，所述CKX1基因的植物表達(dá)載體的標(biāo)記基因?yàn)榭钩輨┑?5S Bar基因。
[0009]優(yōu)選地，所述35S Bar基因具有序列表中SEQ ID NO:2所示的核巧酸序列；
[0010] 所述Nos基因具有序列表中沈Q ID NO:3所示的核巧酸序列；
[0011] 所述EXP18-D基因具有序列表中SEQ ID N0:4所示的核巧酸序列。
[0012] 優(yōu)選地，所述構(gòu)建CKX1基因的植物表達(dá)載體包括W下步驟：
[0013] 先將所述35S Bar基因連接到PGreen0229質(zhì)粒載體，得到35S Bar-PGreen0229質(zhì) 粒載體；
[0014] 再將所述Nos基因連接到所述35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到NOS-35S Bar- PGreen0229質(zhì)粒載體；
[0015] 再將所述EXP18-D基因連接到所述NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到 EXP18-D-NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體；
[0016] 最后將所述CKX1基因連接到所述EXP18-D-NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得 到所述CKXl基因的植物表達(dá)載體。
[0017] 優(yōu)選地，通過(guò)花粉管通道法用所述CKX1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米。
[0018] 優(yōu)選地，所述通過(guò)花粉管通道法用所述CKX1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米包括W 下步驟：
[0019] 先對(duì)玉米植株進(jìn)行套袋授粉處理；
[0020] 再對(duì)所述玉米植株的花穗進(jìn)行修剪處理；
[0021] 在所述修剪處理形成的切口處用所述CKX1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米。
[0022] 優(yōu)選地，使用線性DNA在所述修剪處理形成的切口處用所述CKX1基因的植物表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化玉米;其中，
[0023] 所述線性DNA通過(guò)W所述CKX1基因的植物表達(dá)載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得， 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的引物對(duì)具有序列表中SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示的核巧酸序 列。
[0024] 優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?br>[0025] 96°C 預(yù)變性 4min;98°C 變性 1〇3,56°(：退火153,72°(：延伸7111111，共30個(gè)循環(huán);72°(：延 伸lOmin。
[0026] 本發(fā)明提供的提高玉米抗旱性的方法具有如下有益效果：
[0027] 1、本發(fā)明采用來(lái)自單子葉植物水稻的根特異啟動(dòng)子EXP18-D來(lái)驅(qū)動(dòng)擬南芥CKX1基 因表達(dá)在玉米自交系中，促進(jìn)了玉米根系的生長(zhǎng)發(fā)育，有利于玉米植株獲得±壤深層的水 分，從而提高了轉(zhuǎn)基因玉米的抗旱性。
[0028] 2、本發(fā)明的方法能夠促進(jìn)玉米根系的生長(zhǎng)W增加各種營(yíng)養(yǎng)離子的吸收，對(duì)轉(zhuǎn)基因 玉米在正常有水分條件下的生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有負(fù)面影響，就是說(shuō)在干旱條件下能夠提高轉(zhuǎn)基因 玉米產(chǎn)量，而水分充足條件下轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)量不減產(chǎn)，甚至還能增產(chǎn)。
[0029] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在如下的【具體實(shí)施方式】部分詳細(xì)描述。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為實(shí)施例1中構(gòu)建得到的植物表達(dá)載體圖譜。
[0031] 圖2為實(shí)施例1中植物表達(dá)載體的酶切產(chǎn)物電泳圖譜。
[0032] 圖3為實(shí)施例3中玉米基因組PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜。
[0033] 圖4為實(shí)施例3中轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交結(jié)果圖。
[0034] 圖5為實(shí)施例3中比較對(duì)照植株和轉(zhuǎn)基因株系在旱棚中的生長(zhǎng)情況的照片。
[0035] 圖6為實(shí)施例3中比較對(duì)照植株和轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)度的照片。
[0036] 圖7為實(shí)施例3中比較對(duì)照植株和轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)度的柱狀圖。
[0037] 圖8為實(shí)施例3中比較對(duì)照植株和轉(zhuǎn)基因株系的單穗粒重和千粒重的柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn) 一步地詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并 不用于限制本發(fā)明。
[0039] 實(shí)施例1:
[0040]本實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明CKXl基因的獲取，w及CKXl基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建；該 CKX1基因的核巧酸序列如序列表中SEQ ID No:l所示。
[0041 ] CKX1基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括W下步驟：
[0042] (l)CKXl基因的獲得：
[0043] CKX1基因根據(jù)擬南芥基因 At5g56970cDNA序列由上海生工生物有限公司合成，其 核巧酸序列在序列表SEQ ID No: 1中示出；該CKX1基因編碼的多膚鏈的氨基酸序列如序列 表中SEQ ID No:5所示；SEQ ID No:l的序列的兩端帶有spe I和Not I酶切位點(diǎn)，連接在 puc57質(zhì)粒上，Wpuc57-CKX1質(zhì)粒的形式購(gòu)買得到；
[0044] 該CKX1基因也可W在擬南芥植物的基因組中通過(guò)RT-PCR方法克隆得到。
[0045] (2)植物表達(dá)載體(CKX1-EXP18-D-NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體)的構(gòu)建：
[0046] 方法一：
[0047] ①將35S Bar基因連接到PGreen0229質(zhì)粒載體，得到35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載 體：
[004引先將PUC57-35S Bar質(zhì)粒用Sac I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到帶有酶切位點(diǎn)的 35S Bar基因；再將PGreen0229質(zhì)粒載體用Sac I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到大小約為 4451bp的片段;之后將該帶有酶切位點(diǎn)的35S Bar基因和大小約為4451bp的片段進(jìn)行連接 反應(yīng)，得到35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體；
[0049] 上述35S Bar基因的核巧酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示；該35S Bar基因由 生工生物有限公司合成并連接在puc57質(zhì)粒上，Wpuc57-35S Bar質(zhì)粒的形式購(gòu)買得到。
[0050] ②將Nos基因連接到上述35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到NOS-35S Bar - PGreen0229質(zhì)粒載體：
[0051 ] 先將puc57-Nos質(zhì)粒用化nd虹和csp I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到帶有酶切位 點(diǎn)的Nos基因；再將所述的35S Ba;r-PGreen0229質(zhì)粒載體用化nd虹和csp I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切 反應(yīng)，回收得到大小約為5804bp的片段；之后將該帶有酶切位點(diǎn)的Nos基因和大小約為 5804bp的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，得到NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體；
[0化2] 上述Nos基因的核巧酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示；該Nos基因由生工生物 有限公司合成并連接在puc57質(zhì)粒上，Wpuc57-Nos質(zhì)粒的形式購(gòu)買得到。
[0053] ③將EXP18-D基因連接到上述NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到EXP18-D- NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體：
[0054]先將PUC57-EXP18-D質(zhì)粒用化ndin內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到帶有酶切位點(diǎn) 的EXP18-D基因；再將該NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體用Hind虹內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)， 回收得到大小約為6026bp的片段；之后將該帶有酶切位點(diǎn)的EXP18-D基因和大小約為 6026bp的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，得到EXP18-D-NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體；
[0化5] 上述EXP18-D基因的核巧酸序列如序列表中SEQ ID No:4所示；該EXP18-D基因由 生工生物有限公司合成并連接在PUC57質(zhì)粒上，WEXP18-D-PUC57質(zhì)粒的形式購(gòu)買得到。 [0056] ④將CKX1基因連接到上述EXP18-D-NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到 CKX1-EXP18-D-NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體：
[0057]先將PUC57-CKX1質(zhì)粒用spe I和Not I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到帶有酶切位 點(diǎn)的CKX1基因；再將EXP18-D-NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體用spe巧日Not I內(nèi)切酶進(jìn) 行酶切反應(yīng)，回收得到大小約為88028bp的片段;之后將帶有酶切位點(diǎn)的CKXl基因和大小約 為8028bp的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，得到CKX1-EXP18-D-NOS-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體，即 CKX1基因的植物表達(dá)載體。上述構(gòu)建CKX1基因的植物表達(dá)載體的酶切反應(yīng)中，酶切體系均 為：10 X buf f er: ;內(nèi)切酶:2山（雙酶切時(shí)，兩種內(nèi)切酶各化1)，質(zhì)粒：1化1，d地2〇;化1;于 37 °C反應(yīng)3小時(shí)；
[0化引上述構(gòu)建CKX1基因的植物表達(dá)載體的連接反應(yīng)中，連接體系為：10 X buffer: 1山， 分子量大的片段:化1，分子量小的片段:7iil，T4DNA連接酶：化1; 16°C連接過(guò)夜；
[0059] W上使用的各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均購(gòu)自化kara公司。
[0060] 上述植物表達(dá)載體的原始載體為pGreen0229,是轉(zhuǎn)化擬南芥和其他植物的通用載 體，來(lái)自擬南芥植物目的基因 CKX1插入在Spe I/Not I;該植物表達(dá)載體安全性強(qiáng)；上述啟 動(dòng)子為EXP18-D，是來(lái)自水稻根特異啟動(dòng)子;終止子為Nos，為根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)姻 脂堿合成酶基因終止子，用于終止CKX1基因轉(zhuǎn)錄。
[0061] 方法二：
[0062] 上述植物表達(dá)載體也可W通過(guò)W下方法構(gòu)建:利用PGM-35S Bar通用載體(構(gòu)建方 法記載于《PGM-35Sbar玉米通用表達(dá)載體的構(gòu)建及玉米轉(zhuǎn)化研究》，王霄漢等安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012,40:12367-12370)，用根特異啟動(dòng)子EXP18-D在Hind III位點(diǎn)替代UBQ I啟動(dòng)子，將目 的基因 CKX1插入位于Spe I/Not I酶切位點(diǎn)之間，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。
[0063] 上述方法一和方法二構(gòu)建的植物表達(dá)載體圖譜如圖1所示。
[0064] ⑤將上述兩種方法中的任意一個(gè)構(gòu)建的CKX1基因的植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理、 振蕩培養(yǎng)處理、質(zhì)粒提取處理、酶切反應(yīng)，W驗(yàn)證該植物表達(dá)載體構(gòu)建正確：
[0065] 該轉(zhuǎn)化處理為:取該CKX1基因的植物表達(dá)載體扣1加入10化1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上放置30分鐘;再42 °C熱激45秒，冰上放置2分鐘；再加入 SOOiil LB無(wú)抗培養(yǎng)基，于37°C轉(zhuǎn)速15化pm振蕩培養(yǎng)1小時(shí);再W轉(zhuǎn)速4000巧m離屯、5分鐘，用 槍吸掉40化1左右上清液，余下的用涂布棒涂布在含50mg/L的卡那霉素化an)的培養(yǎng)基上； 再于37°C過(guò)夜培養(yǎng)，得到單菌落。
[0066] 該振蕩培養(yǎng)處理為:分別挑取上述生長(zhǎng)出的單菌落，加入LB液體培養(yǎng)基，37 °C過(guò)夜 振蕩培養(yǎng)。
[0067] 該質(zhì)粒提取處理為:將上述過(guò)夜振蕩培養(yǎng)的菌液用寶生物工程(大連)有限公司的 DV801A型質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取處理，得到植物表達(dá)載體。
[0068] 該酶切反應(yīng)為:將提取到的植物表達(dá)載體用內(nèi)切酶Spe I和Not I進(jìn)行酶切反應(yīng)， 得到酶切產(chǎn)物，酶切體系與步驟④中相同；再將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳 結(jié)果如圖2所示，泳道1-4中為酶切產(chǎn)物，條帶由上至下分別為8.4化左右的大片段和1.化b 左右的小片段，可W證明該植物表達(dá)載體構(gòu)建正確。
[0069] 實(shí)施例2:
[0070] 本實(shí)施例是將實(shí)施例1制備的植物表達(dá)載體作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到篩 選表達(dá)盒的線性DNA，再將該線性DNA經(jīng)過(guò)花粉管通道法轉(zhuǎn)入玉米178中，包括如下步驟：
[0071] (1)線性DNA的制備：
[0072] 篩選表達(dá)盒的線性DNA(該線性DNA包括目的基因和除草劑篩選基因的完整表達(dá) 盒），通過(guò)W實(shí)施例1制備的植物表達(dá)載體為模板，采用PCR擴(kuò)增的方法獲得。
[0073] 其中，PCR擴(kuò)增的引物為：
[0074] 上游引物(LacZ-Fl)(序列表中沈Q ID N0:6所示）：
[00 巧]GTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGT;
[0076] 下游引物(RB-R)(序列表中SEQ ID N0:7所示）：
[0077] GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA。
[007引 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序如下：
[0079] 96°C 預(yù)變性 4min;98°C 變性 1〇3,56°(：退火153,72°(：延伸7111111，共30個(gè)循環(huán);72°(：延 伸 10min，4°C 保存；
[0080] PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系如下（W50]il體系為例）：
[0081 ]模板(0.2ng/山）1 山，5XPrime STAR Buffer 10山，dNTP(各2.5mM)5山，上游引物 (1〇咖）化1，下游引物（lOyM)化l，Prime STAR 服 DNA Polymerase(2.5UAU)化l，dd 此0加 至5化1。
[0082] 將獲得的線性DNA用無(wú)菌d地2〇調(diào)整濃度，得到濃度為30ng/山的線性DNA溶液。
[0083] (2)花粉管通道法轉(zhuǎn)化玉米：
[0084] ①在玉米開花期時(shí)，選擇發(fā)育正常的植株進(jìn)行套袋授粉處理；
[0085] ②在上述的授粉處理后20h，對(duì)玉米植株的花穗按照如下方法進(jìn)行修剪處理:先將 玉米植株的雌穗上的紙袋摘下，用剪刀剪去大約距離穗軸頂端1~2cm的花絲和巷葉，保持 花絲切面平齊，并使巷葉內(nèi)的花絲略高于巷葉；
[0086] ③然后用一次性針管在上述修剪處理形成的切口處滴注20化1濃度為30ngAU的 線性DNA溶液，立即重新套上紙袋，記錄轉(zhuǎn)化的時(shí)間及線性DNA名稱。
[0087] 實(shí)施例3:
[0088] 待實(shí)施例2的轉(zhuǎn)化后的玉米果穗成熟時(shí)，將其收獲曬干脫粒，得到轉(zhuǎn)化種子;該轉(zhuǎn) 化種子播種后，在苗期3-5葉期噴灑200mg/L百速頓草錠麟除草劑，獲得抗性植株(部分株系 命名為 L77-4，L85-8，L122-1，L188-5，L242-2，L255-1，L264-8，L407-11)用于分子檢測(cè)。轉(zhuǎn) 基因株系自交擴(kuò)繁到T3代獲得純合株系。
[0089] 為了確定上述CKX1基因已經(jīng)整合進(jìn)玉米基因組中，對(duì)上述抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)、 Southern雜交檢測(cè)。
[0090] (l)PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)：
[0091] 根據(jù)CKX1基因的DNA序列組成設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：
[0092] 引物1(上游引物）（序列表中SEQ ID N0:8所示）：
[0093] 5 ' TCAAGCATTCAAGCATGGAC 3 '，
[0094] 引物2(下游引物）（序列表中SEQ ID N0:9所示）：
[00巧]5 ' GGTCCCTTGAAAATGCAGAAT 3 '
[0096] 采用SDS微量法提取玉米葉片的DM，然后W此DM為模板，W上述引物1和引物2為 引物，用PTC-100PCR擴(kuò)增儀(M. J. Research公司）擴(kuò)增CKX1基因片段；
[0097] 50山的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為aOXPCR buffer 5山，2mM dNTP扣1，50測(cè)的引物1和 引物2各化1，模板DNA( liigAU)化1; hq DNA聚合酶2.化1;加水至50iil;
[009 引 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：先 94°C 5min;然后 94°C Imin，57 °C Imin，72 °C 2min，共 30 個(gè)循 環(huán)；最后 72°C7min。
[0099] PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，可 見泳道1-4中，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出24化P的片段(泳道M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量;泳道1:質(zhì)粒， 泳道2:水，泳道3:非轉(zhuǎn)基因植株，泳道4-7為轉(zhuǎn)基因植株；泳道4:株系L77-4,泳道5:株系 L85-8，泳道6:株系L122-1，泳道7:株系L188-5)。
[0100] (2)Southern blot雜交檢測(cè)：
[0101] 采用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II試劑盒 (Roche公司），對(duì)經(jīng)PCR檢測(cè)獲得的部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Southern blot分析，具體方法 為：
[0102] 采用CTAB大量提取法提取葉片的基因組DNA，取60iig玉米基因組總DNA經(jīng)限制性內(nèi) 切酶BamHI (化KaRa公司）完全消化后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后，利用 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將DNA轉(zhuǎn)移至帶正電荷的Hybond-護(hù)尼龍膜上，所用探針為CKX1核巧酸序列， 用瓊脂糖凝膠電泳回收該DNA片段后對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，探針標(biāo)記操作流程按上述試劑盒的使 用說(shuō)明書進(jìn)行。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示(泳道M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量;泳道1:質(zhì)粒，泳道2:水，泳道3: 非轉(zhuǎn)基因植株，泳道4-7為轉(zhuǎn)基因植株:泳道4:株系L77-4，泳道5 :株系L85-8，泳道6:株系 L122-1，泳道7:株系L188-5)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因玉米存在CKX1的雜交信號(hào)，而對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植株 則無(wú)此雜交信號(hào)，表明外源DNA已經(jīng)整合到玉米的基因組中。
[0103] (3)轉(zhuǎn)基因玉米植株性狀檢測(cè)：
[0104] ①對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系在旱棚中的生長(zhǎng)情況：
[0105] 對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系材料在北京塑料旱棚中按株距40厘米、行距60厘米進(jìn)行播種，3 葉期間苗，播種后30天內(nèi)不誘水，到第30天充分誘水一次之后到收獲不再誘水;如圖5所示， 生長(zhǎng)60天的植株(左側(cè)為對(duì)照植株，右側(cè)為轉(zhuǎn)基因植株:株系L122-1)，轉(zhuǎn)基因植株的株高和 長(zhǎng)勢(shì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于對(duì)照組植株，運(yùn)說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性顯著高于對(duì)照組植株。
[0106] ②對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)的比較：
[0107] 在普通日光溫室中采用盆栽試驗(yàn)，在每個(gè)直徑20厘米高40厘米的花盆填充營(yíng)養(yǎng)± 中播種10粒對(duì)照或轉(zhuǎn)基因玉米的飽滿種子，每個(gè)轉(zhuǎn)基因材料或?qū)φ?個(gè)重復(fù)，充分誘水等種 子出苗后長(zhǎng)到3葉期進(jìn)行間苗，每個(gè)花盆中留下3株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，每3天誘水1次，保證花 盆中有充足水分供應(yīng)。
[0108] 等幼苗長(zhǎng)到5葉期時(shí)，用水小屯、沖走營(yíng)養(yǎng)±，留下玉米植株完整根系進(jìn)行拍照，并 對(duì)每個(gè)植株整個(gè)根系的每個(gè)側(cè)根進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)量，所有側(cè)根的長(zhǎng)度之和作為玉米單株的總根 長(zhǎng)，重復(fù)3次W上試驗(yàn)，對(duì)取得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0109] 如圖6所示，盆栽即十期時(shí)轉(zhuǎn)基因株系122-1的根長(zhǎng)可達(dá)到57cm，而對(duì)照植株的根長(zhǎng) 僅能達(dá)到30cm，比對(duì)照組植株增加90% (圖6中，CK代表對(duì)照組，其余均為轉(zhuǎn)基因植株）。
[0110] 如圖7所示，*表示轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照組植株相比有顯著差異，**表示轉(zhuǎn)基因材料 與對(duì)照相比有極顯著差異（圖7中，CK代表對(duì)照組，其余均為轉(zhuǎn)基因植株）。
[0111] ③轉(zhuǎn)基因株系結(jié)實(shí)情況比較：
[0112] 轉(zhuǎn)基因株系自交擴(kuò)繁到T4代獲得純合株系，在海南冬季11月5日播種，種前±壤充 分誘水，然后整個(gè)玉米生長(zhǎng)季不再誘水，按每個(gè)材料15株，株距30厘米行距60厘米，并進(jìn)行 自然授粉，130天后統(tǒng)計(jì)每個(gè)材料平均單穗的結(jié)實(shí)率和千粒重，轉(zhuǎn)基因株系比對(duì)照在穗粒數(shù) 和千粒重都有顯著性增加。結(jié)果如圖8所示。圖8中，可見轉(zhuǎn)基因株系的單粒穗數(shù)和千粒重均 明顯高于對(duì)照組。
[0113] 由實(shí)施例1-3可W看出，發(fā)明人通過(guò)采用來(lái)自單子葉植物水稻的根特異啟動(dòng)子 EXP18-D來(lái)驅(qū)動(dòng)CKX1表達(dá)在玉米自交系中，獲得了78個(gè)純合株系（T2代除草劑篩選不再分 離），篩選出了抗旱性顯著增加的轉(zhuǎn)基因株系。觀測(cè)苗期轉(zhuǎn)基因株系的根生長(zhǎng)量大于對(duì)照野 生型，在旱棚控水試驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因株系抗旱性顯著增加，結(jié)實(shí)率也有明顯提高。植物干旱應(yīng)答 的基因超過(guò)1000多個(gè)，選擇哪類或哪個(gè)基因進(jìn)行作物的抗旱改良一直是困擾科學(xué)界的一個(gè) 難題，本發(fā)明的發(fā)明人證實(shí)了通過(guò)在根中特異表達(dá)CKX1基因可W促進(jìn)玉米根系生長(zhǎng)發(fā)育， 從而提高玉米的抗旱性，而不影響玉米在正常有水分條件下的生長(zhǎng)發(fā)育。轉(zhuǎn)CKX1基因促進(jìn) 了玉米根系生長(zhǎng)發(fā)育，增加了根長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)，健壯根系提高了玉米的抗旱性，增加了在干旱 條件下玉米的產(chǎn)量，在水分充足條件下，轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)量與對(duì)照相比也是增產(chǎn)的。
[0114] 顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施方式僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所做的舉例，而并非是 對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還 可W做出其他不同形式的變化或變動(dòng)。運(yùn)里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予W窮舉。凡是屬于本 發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于:所述方法包括將CKX1基因轉(zhuǎn) 入玉米基因組中的步驟;所述CKX1基因具有序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于:該方法包括 構(gòu)建CKX1基因的植物表達(dá)載體，并用所述CKX1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米的步驟。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于:所述CKX1基 因的植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為PGreen0229質(zhì)粒載體，所述CKX1基因的植物表達(dá)載體帶有 啟動(dòng)子EXP18-D基因、終止子Nos基因和CKX1基因。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于:所述CKX1基 因的植物表達(dá)載體的標(biāo)記基因?yàn)榭钩輨┑?5S Bar基因。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高玉米抗旱性的方法，其特征在于： 所述35S Bar基因具有序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； 所述Nos基因具有序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列； 所述EXP18-D基因具有序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于:所述構(gòu) 建CKX1基因的植物表達(dá)載體包括以下步驟： 先將所述35S Bar基因連接到PGreen0229質(zhì)粒載體，得到35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載 體； 再將所述Nos基因連接到所述35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到Nos-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體； 再將所述EXP18-D基因連接到所述Nos-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到EXP18-D-Nos-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體； 最后將所述CKX1基因連接到所述EXP18-D-Nos-35S Bar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到所 述CKX1基因的植物表達(dá)載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于:通過(guò)花粉管 通道法用所述CKX1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于:所述通過(guò)花 粉管通道法用所述CKX1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米包括以下步驟： 先對(duì)玉米植株進(jìn)行套袋授粉處理； 再對(duì)所述玉米植株的花穗進(jìn)行修剪處理； 在所述修剪處理形成的切口處用所述CKX1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于：使用線性 DNA在所述修剪處理形成的切口處用所述CKX1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米;其中， 所述線性DNA通過(guò)以所述CKX1基因的植物表達(dá)載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得，所述 PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的引物對(duì)具有序列表中SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò) 增反應(yīng)的程序?yàn)椋?96°C預(yù)變性4min;98°C變性1〇8,56°(：退火158,72°(：延伸7111丨11，共30個(gè)循環(huán)；72°(：延伸 10min〇
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK106047922SQ201610398994
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】張春, 李向龍, 張中保, 吳忠義
【申請(qǐng)人】北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心