用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及臨床微生物細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法。該方法為先選用抗生素紙片和EDTA紙片，將已經(jīng)檢測(cè)的耐藥待檢菌制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙翰⒕鶆蛲磕ㄖ罬?H平皿表面，在涂布有待檢菌的M?H平皿表面上，將EDTA紙片置于M?H平皿表面中央，在EDTA紙片周?chē)謩e貼上頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片、厄他培南(ETP)抗生素紙片、美羅培南(MER)抗生素紙片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片，且EDTA紙片與各抗生素紙片、兩相鄰抗生素紙片留有間距；采用35℃孵育16～18h，觀(guān)察并分別記錄EDTA紙片、各抗生素紙片抑菌環(huán)直徑。本發(fā)明的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法成本低廉，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，不需要特殊實(shí)驗(yàn)條件，易于推廣應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及臨床微生物細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法。【背景技術(shù)】
[0002]碳青霉烯酶可分為絲氨酸類(lèi)((SCHBLs)和金屬類(lèi)(MCHBLs)兩大類(lèi);部分細(xì)菌如銅綠假單胞菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一種能水解碳青霉烯類(lèi)抗生素，如厄他培南(ETP)、美羅培南的酶，這些產(chǎn)酶的細(xì)菌對(duì)以上抗生素表現(xiàn)耐藥性，當(dāng)這些細(xì)菌引起感染，如敗血癥、肺炎、腎盂腎炎或傷口感染時(shí)，采用以上抗生素將會(huì)使治療失敗。目前為止，對(duì)產(chǎn)酶細(xì)菌的分類(lèi)檢測(cè)檢測(cè)，尚缺乏簡(jiǎn)單、有效的方法。
[0003]為解決上述問(wèn)題，本
【申請(qǐng)人】公開(kāi)發(fā)表了4種酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)方法(張國(guó)偉，明德松，吳一波.4種酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青酶烯酶的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志.2004(10)) 以2MA紙片置于9cm藥敏平皿中央，周?chē)胖肊DTA、MER、頂P、SCF、CAZ、OD〇2，兩相鄰紙片間距多24mm，35°C孵育16?18h，該方法需要制備含有二巰基乙酸(2MA)紙片和SCF紙片成本較高，且頂P紙片檢出率較低，因此有待改進(jìn)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種成本低廉，檢出率高的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，所述的碳青霉烯酶分為絲氨酸類(lèi) (SCHBLs)和金屬類(lèi)(MCHBLs)兩大類(lèi)，其特征在于:包括酶抑制劑和酶底物，所述的酶抑制劑為EDTA、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)和哌拉西林/他唑巴坦(TZP)，所述的酶底物為頭孢他啶(CAZ)、厄他培南(ETP)和美羅培南(MER)，所述的頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、厄他培南(ETP)和美羅培南(MER)以抗生素紙片為載體，所述的H)TA以紙片為載體;其具體步驟如下:
[0007](1)選用抗生素紙片和m)TA紙片；
[0008](2)將已經(jīng)檢測(cè)的耐藥待檢菌制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙翰⒕鶆蛲磕ㄖ罬-H平皿表面；
[0009](3)在涂布有待檢菌的M-H平皿表面上，將EDTA紙片置于M-H平皿表面中央；[〇〇1〇](4)在EDTA紙片周?chē)謩e貼上頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片、厄他培南(ETP)抗生素紙片、美羅培南(MER)抗生素紙片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片，且EDTA紙片與各抗生素紙片、兩相鄰抗生素紙片留有間距；
[0011](5)采用 35°C 孵育 I6 ?ish;
[0012](6)觀(guān)察并分別記錄EDTA紙片、各抗生素紙片抑菌環(huán)直徑；
[0013](7)如果厄他培南(ETP)抗生素紙片和/或美羅培南(MER)抗生素紙片與頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片和/或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片協(xié)同，則判斷為絲氨酸類(lèi)(SCHBLs);
[0014]如果頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片和/或厄他培南(ETP)抗生素紙和/或美羅培南 (MER)抗生素紙片與EDTA紙片協(xié)同，則判斷為金屬類(lèi)(MCHBLs)。[〇〇15]進(jìn)一步的，所述的抗生素紙片為英國(guó)0X0ID公司生產(chǎn)的抗生素紙片。
[0016]進(jìn)一步的，所述的布置于EDTA紙片周?chē)目股丶埰樞蛞来螢轭^孢他啶(CAZ) 抗生素紙片、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片、厄他培南(ETP)抗生素紙片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片、美羅培南(MER)抗生素紙片。
[0017]進(jìn)一步的，所述的EDTA紙片與各抗生素紙片、相鄰抗生素紙片間距為10-24mm。 [〇〇18]進(jìn)一步的，所述的EDTA紙片與各抗生素紙片、兩相鄰抗生素紙片間距為10mm時(shí)為高度耐藥，為24mm時(shí)為中低度耐藥。[0〇19]進(jìn)一步的，所述的EDTA紙片與頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片的間距為15mm。
[0020]進(jìn)一步的，所述的頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片和厄他培南(ETP)抗生素紙片、所述的哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片與美羅培南(MER)抗生素紙片的間距為10麵。
[0021]進(jìn)一步的，所述的M-H平皿直徑為9cm。[〇〇22]進(jìn)一步的，所述的EDTA紙片含量為1860ug。
[0023]由上述對(duì)本發(fā)明的描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，將酶抑制劑和酶底物聯(lián)合使用，通過(guò)檢測(cè)對(duì)產(chǎn)生碳青霉烯酶細(xì)菌抑菌環(huán)直徑改變來(lái)判斷碳青霉烯酶及其不同類(lèi)型的存在，避免了使用單一底物可能帶來(lái)的漏檢， 同時(shí)依據(jù)細(xì)菌藥敏結(jié)果靈活各抗生素紙片間距，調(diào)整提高檢測(cè)的陽(yáng)性率，檢出率達(dá)到90% 以上，提高了產(chǎn)酶細(xì)菌的檢出率，對(duì)于了解細(xì)菌耐藥機(jī)制、合理選用抗生素具有重要意義， 操作簡(jiǎn)單，成本低廉，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，不需要特殊實(shí)驗(yàn)條件，易于推廣應(yīng)用?！靖綀D說(shuō)明】
[0024]圖1為本發(fā)明的抗生素紙片分布示意圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0025]參照?qǐng)D1所示，用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，所述的碳青霉烯酶分為絲氨酸類(lèi)((SCHBLs)和金屬類(lèi)(MCHBLs)兩大類(lèi)，該方法包括3種酶抑制劑和3種酶底物，3種酶抑制劑為EDTA、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)和哌拉西林/他唑巴坦(TZP )，3種酶底物為頭孢他啶(CAZ)、厄他培南(ETP)和美羅培南(MER)，其中頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、厄他培南(ETP)和美羅培南(MER)以抗生素紙片為載體，EDTA以紙片為載體;其具體步驟如下:[〇〇26](1)選用EDTA紙片和英國(guó)0X0ID公司生產(chǎn)的抗生素紙片；[〇〇27](2)將已經(jīng)檢測(cè)的耐藥待檢菌制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙翰⒕鶆蛲磕ㄖ?cmM-H平皿表面；[〇〇28](3)在涂布有待檢菌的M-H平皿表面上，將EDTA紙片置于M-H平皿表面中央；[〇〇29](4)在EDTA紙片周?chē)謩e依次貼上頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片、厄他培南(ETP)抗生素紙片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片、美羅培南(MER)抗生素紙片，且EDTA紙片與各抗生素紙片、兩相鄰抗生素紙片間距為10-24mm，間距為10mm時(shí)為高度耐藥，為24mm時(shí)為中低度耐藥；[〇〇3〇](5)采用 35。(:孵育 I6 ?ish;[〇〇31](6)觀(guān)察并分別記錄EDTA紙片、各抗生素紙片抑菌環(huán)直徑；[〇〇32](7)如果厄他培南(ETP)抗生素紙片和/或美羅培南(MER)抗生素紙片與頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片和/或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片協(xié)同，則判斷為絲氨酸類(lèi)(SCHBLs);
[0033]如果頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片和/或厄他培南(ETP)抗生素紙和/或美羅培南 (MER)抗生素紙片與EDTA紙片協(xié)同，則判斷為金屬類(lèi)(MCHBLs)。
[0034]具體實(shí)施例1，用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法應(yīng)用于檢測(cè)血液標(biāo)本中產(chǎn)碳青酶烯酶的肺炎克雷伯菌，該細(xì)菌藥敏結(jié)果顯示泛耐藥，將EDTA紙片貼于涂布有分離菌的M-H平皿中心，周?chē)謩e依次貼上頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/ CLAV)抗生素紙片、厄他培南(ETP)抗生素紙片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片、美羅培南(MER)抗生素紙片，將EDTA紙片與頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片的間距調(diào)整為15mm，頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片與厄他培南(ETP)抗生素紙片的間距調(diào)整為10mm，哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片和美羅培南(MER)抗生素紙片間距分別調(diào)整為10mm，35 °(:培養(yǎng)過(guò)夜，其結(jié)果如下:EDTA紙片與頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片、厄他培南(ETP)抗生素紙片和美羅培南(MER)抗生素紙片間均出現(xiàn)協(xié)同，頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片和哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片與頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片、厄他培南(ETP)抗生素紙片和美羅培南(MER)抗生素紙片間均未出現(xiàn)協(xié)同，由此判定為產(chǎn)金屬類(lèi)(MCHBLs)，進(jìn)一步的，上述的H)TA紙片含量為1860ug。
[0035]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能以此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明專(zhuān)利涵蓋的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，所述的碳青霉烯酶分為絲氨酸類(lèi)(SCHBLs) 和金屬類(lèi)(MCHBLs)兩大類(lèi)，其特征在于:包括酶抑制劑和酶底物，所述的酶抑制劑為EDTA、 頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)和哌拉西林/他唑巴坦(TZP)，所述的酶底物為頭孢他啶 (CAZ)、厄他培南(ETP)和美羅培南(MER)，所述的頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)、哌拉西 林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、厄他培南(ETP)和美羅培南(MER)以抗生素紙片為載 體，所述的H)TA以紙片為載體;其具體步驟如下:(1)選用抗生素紙片和EDTA紙片；(2)將已經(jīng)檢測(cè)的耐藥待檢菌制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙翰⒕鶆蛲磕ㄖ罬-H平皿表面；(3)在涂布有待檢菌的M-H平皿表面上，將EDTA紙片置于M-H平皿表面中央；(4)在EDTA紙片周?chē)謩e貼上頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片、厄他培南(ETP)抗生素紙片、 美羅培南(MER)抗生素紙片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片、頭孢他啶/克拉維酸 (CAZ/CLAV)抗生素紙片，且EDTA紙片與各抗生素紙片、兩相鄰抗生素紙片留有間距；(5)采用35°C孵育16?18h;(6)觀(guān)察并分別記錄EDTA紙片、各抗生素紙片抑菌環(huán)直徑；(7)如果厄他培南(ETP)抗生素紙片和/或美羅培南(MER)抗生素紙片與頭孢他啶/克拉 維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片和/或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片協(xié)同，則判斷為絲 氨酸類(lèi)(SCHBLs);如果頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片和/或厄他培南(ETP)抗生素紙和/或美羅培南(MER)抗 生素紙片與H)TA紙片協(xié)同，則判斷為金屬類(lèi)(MCHBLs)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，其特征在于:所述的 抗生素紙片為英國(guó)OXOID公司生產(chǎn)的抗生素紙片。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，其特征在于:所述的 布置于EDTA紙片周?chē)目股丶埰樞蛞来螢轭^孢他啶(CAZ)抗生素紙片、頭孢他啶/克拉 維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片、厄他培南(ETP)抗生素紙片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素 紙片、美羅培南(MER)抗生素紙片。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，其特征在于:所述的 EDTA紙片與各抗生素紙片、相鄰抗生素紙片間距為10-24mm。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，其特征在于:所述的 EDTA紙片與各抗生素紙片、兩相鄰抗生素紙片間距為10mm時(shí)為高度耐藥，為24mm時(shí)為中低 度耐藥。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，其特征在于:所 述的EDTA紙片與頭孢他啶(CAZ)抗生素紙片的間距為15mm。7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，其特征在于:所 述的頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CLAV)抗生素紙片和厄他培南(ETP)抗生素紙片、所述的哌拉 西林/他唑巴坦(TZP)抗生素紙片與美羅培南(MER)抗生素紙片的間距為10mm。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，其特征在于:所述的 M-H平皿直徑為9cm。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用酶抑制劑分類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法，其特征在于:所述的 EDTA紙片含量為1860ug。
【文檔編號(hào)】C12Q1/18GK106047987SQ201610388006
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】明德松
【申請(qǐng)人】明德松