一種egfr基因超低頻突變檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的引物組合物及其應(yīng)用，其中該引物組合物包括：第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物和所述第二通用引物的靶點位于所述目標(biāo)區(qū)域的兩端，分別用于構(gòu)成測序文庫的5’端和3’端；以及特異性引物組，所述特異性引物組包括n條特異性引物，各特異性引物的結(jié)構(gòu)相同，均是從5’端至3’端依次包括第一核酸序列、連接序列和第二核酸序列。該引物組合物能夠有效地用于檢測待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列信息，尤其是超低頻突變的檢測，且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【專利說明】
-種EGFR基因超低頻突變檢測試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是突變檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明設(shè)及一種 EGFR基因超低頻突變檢測試劑盒，更具體地設(shè)及用于檢測待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的引物組 合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 已知，疾病相關(guān)的基因及致病突變位點的檢測，對于深入的遺傳學(xué)和病理學(xué)研究 W及疾病治療的用藥和耐藥性等研究，均有重要意義。
[0003] 然而，目前的基因突變的檢測方法或者靈敏度較低，或者通量較低，無法滿足多樣 本同時檢測的需求。
[0004] 因此，目前急需一種高通量、檢測靈敏度高的基因突變檢測手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的 在于提出一種高通量、檢測靈敏度高的基因突變檢測手段。
[0006] 需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0007] 肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NS化C)約占所有肺癌的80%，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，5年生存率很低。 研究表明，非小細(xì)胞肺癌人群中有40%患者攜帶表皮生長因子受體化GFR)基因的體細(xì)胞突 變。目前祀向治療成為非小細(xì)胞肺癌臨床治療的重要手段。而在祀向治療中，EGFR基因的運 些突變起到至關(guān)重要的作用。目前已開發(fā)出了吉非替尼（gef it inib)和厄洛替尼 (erlotinib)等表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑（邱idermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitor EGFR-TKI)勒1向藥物?；颊邆€體EGFR基因的突變狀態(tài)和運些 祀向藥物的療效密切相關(guān)。因此確定患者是否攜帶有相關(guān)EGFR基因突變在一定程度上可W 避免無效用藥和解決耐藥性等方面的問題。
[0008] EGFR是表皮生長因子化GF)細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體。它是一種位于細(xì)胞膜表 面的跨膜受體酪氨酸激酶，分子量170邸a"EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn) 移及細(xì)胞調(diào)亡的抑制有關(guān)。EGFR由EGFR基因表達(dá)。EGFR基因位于7號染色體上，長約118肺， 包含28個外顯子。其酪氨酸激酶功能區(qū)由18-24號外顯子編碼。研究發(fā)現(xiàn)NS化C患者的EGFR 基因突變主要發(fā)生在18-21號外顯子上。主要突變類型包括18號外顯子上的點突變 (G719X)，19號外顯子上的缺失突變(主要位于747-750位氨基酸），20號外顯子上的插入突 變，20號外顯子上的耐藥點突變，21號外顯子上的點突變化858R和L861Q)等。
[0009] 目前，針對EGFR基因突變的檢測方法主要有直接測序法、等位基因特異性PCR法 (ARMS法）、數(shù)字微滴PCR法等。1)直接測序法一直W來被認(rèn)為是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)。但 該法有兩大缺點：一是靈敏度較低，一般需要突變基因豐度達(dá)到20% W上才能較準(zhǔn)確檢測。 因此只能檢測腫瘤細(xì)胞占多數(shù)的腫瘤組織。對于取樣方便的腫瘤患者血清/血漿樣本，其腫 瘤特異性突變的DM比例往往低于1%，該法則完全無法檢出。二是傳統(tǒng)的Sanger測序法通 量較低，無法滿足多樣本同時檢測的需求。2)等位基因特異性PCR法(ARMS法），該方法主要 用于對已知突變基因進行檢測。利用PCR引物的3'端末位堿基必須與其DNA模板互補才能有 效擴增的原理，設(shè)計兩個5 '端PCR引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補。對于純合 突變，分別加入運兩種引物及下游3'端引物進行兩個平行PCR。只有與突變DNA完全互補的 引物才能延伸進行PCR擴增。如果上游5 '端引物末端有錯配，貝化CR無法延伸。因此運種方法 可W選擇性擴增突變型DNA模板。該方法能夠達(dá)到1%的靈敏度，但顯然仍不足W對血漿、血 清等易取樣本進行檢測。同時也無法實現(xiàn)多樣本高通量檢測。3)數(shù)字微滴PCR的核屯、理念是 將傳統(tǒng)PCR的反應(yīng)體系進行細(xì)分，從而提升檢測靈敏度。但目前報到的該方法檢測EGFR基因 突變位點相對有限，仍處在摸索、積累經(jīng)驗的階段。該方法對操作人員和環(huán)境均有較高的要 求，未來應(yīng)用于臨床尚需要大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)驗證。
[0010] 因此，目前迫切需要一種高通量、檢測靈敏度高的EGFR基因突變檢測方法。
[0011] 進而，發(fā)明人經(jīng)過一系列的研究，意外發(fā)現(xiàn)了一種高通量、檢測靈敏度高的基因突 變檢測手段，其不僅能夠用于EGFR基因突變的檢測，同樣適用于其他基因的目標(biāo)區(qū)域檢測， 運些目標(biāo)區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變的至少之一，尤其是超低頻突變 的檢測。
[0012] 從而，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域 的引物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該引物組合物包括：
[0013] 第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物和所述第二通用引物的祀點位 于所述目標(biāo)區(qū)域的兩端，分別用于構(gòu)成測序文庫的5 '端和3 '端；W及
[0014] 特異性引物組，所述特異性引物組包括n條特異性引物，各特異性引物的結(jié)構(gòu)相 同，均是從5 '端至3 '端依次包括第一核酸序列、連接序列和第二核酸序列，
[0015] 其中，各特異性引物均滿足下列條件：
[0016] (1)各特異性引物的祀點，均是與所述第一通用引物的祀點分別位于所述目標(biāo)區(qū) 域的兩端，而與所述第二通用引物的祀點位于所述目標(biāo)區(qū)域的同端；
[0017] (2)所述第一核酸序列和所述第二核酸序列對應(yīng)的基因組位置位于所述目標(biāo)區(qū)域 的同端；
[0018] (3)所述第一核酸序列對應(yīng)的基因組位置與所述目標(biāo)區(qū)域之間的距離，大于所述 第二核酸序列對應(yīng)的基因組位置與所述目標(biāo)區(qū)域之間的距離；
[0019] (3)所述第一核酸序列和所述第二核酸序列在對應(yīng)的基因組位置上是連續(xù)的，但 無堿基重合；
[0020] (4)所述第一核酸序列的5'端第一個堿基距離目標(biāo)區(qū)域不超過待測核酸樣本的堿 基長度；
[0021] (5)所述連接序列由所述第二通用引物的3'端末的24個堿基構(gòu)成；
[0022] (6)n= 1-5的任意整數(shù)，Wn = 5為例，設(shè)所述特異性引物組的各特異性引物分別 為:Nl、N2、N3、N4、N5，W特異性引物的祀點與目標(biāo)區(qū)域之間的距離為衡量標(biāo)準(zhǔn)，各特異性引物 之間的距離遠(yuǎn)近關(guān)系為：
[0023] 化〉化〉化〉N4〉化。
[0024] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的引物組合物能夠有效地用于檢測待測核酸樣本目標(biāo) 區(qū)域的序列信息，尤其是超低頻突變的檢測。具體地，利用本發(fā)明的引物組合物，能夠有效 地通過PCR擴增富集所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列，進而進行建庫、測序，從而能夠有 效確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括目標(biāo)區(qū)域中所包含的點突變、插入、缺失或基 因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0025] 在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒 包含前面所述的引物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的試劑盒能夠有效地用于檢測 待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列信息，尤其是超低頻突變的檢測。具體地，利用該試劑盒中的 引物組合物，能夠有效地通過PCR擴增富集所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列，進而進行建 庫、測序，從而能夠有效確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括目標(biāo)區(qū)域中所包含的點 突變、插入、缺失或基因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0026] 在本發(fā)明的第=方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫 的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法利用前面所述的引物組合物或試劑盒，通過PCR擴增 富集所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列。
[0027] 由此，能夠有效地基于前述的本發(fā)明的引物組合物或試劑盒進行建庫，進而能夠 有效地用于測序，W確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括目標(biāo)區(qū)域中所包含的點突 變、插入、缺失或基因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，尤其適用于超低頻突變 的檢測。
[0028] 在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息的 方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：
[0029] 根據(jù)前面所述的構(gòu)建待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫的方法，構(gòu)建所述待測核 酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫；
[0030] 對所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫進行測序，W便獲得測序結(jié)果；W及 [0031 ]基于所述測序結(jié)果，確定所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列信息。
[0032] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠有效地基于前述的本發(fā)明的引物組合物或試劑盒構(gòu) 建目標(biāo)區(qū)域的測序文庫和測序，從而能夠有效確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括 目標(biāo)區(qū)域中所包含的點突變、插入、缺失或基因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可 靠，尤其適用于超低頻突變的檢測。
[0033] 在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域檢測文庫的 裝置。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該裝置設(shè)置有前面所述的引物組合物，所述裝置適于利用特異 性引物組、第一通用引物和第二通用引物的混合物對所述待測核酸樣本進行第一 PCR擴增， W便獲得第一 PCR擴增產(chǎn)物，其中所述第一 PCR擴增產(chǎn)物構(gòu)成所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域 檢測文庫。
[0034] 由此，利用該裝置能夠有效地基于前述的本發(fā)明的引物組合物或試劑盒進行建 庫，進而能夠有效地用于測序，W確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括目標(biāo)區(qū)域中所 包含的點突變、插入、缺失或基因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，尤其適用于 超低頻突變的檢測。
[0035] 在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供了一種確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息的 系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括：
[0036] 前面所述的構(gòu)建待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域檢測文庫的裝置，用于構(gòu)建所述待測核酸 樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫；
[0037] 測序裝置，所述測序裝置與所述構(gòu)建待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域檢測文庫的裝置相 連，用于對所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫進行測序，W便獲得測序結(jié)果；W及
[0038] 序列確定裝置，所述序列確定裝置與所述測序裝置相連，用于基于所述測序結(jié)果， 確定所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列信息。
[0039] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該系統(tǒng)能夠有效地基于前述的本發(fā)明的引物組合物或試劑盒構(gòu) 建目標(biāo)區(qū)域的測序文庫和測序，從而能夠有效確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括 目標(biāo)區(qū)域中所包含的點突變、插入、缺失或基因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可 靠，尤其適用于超低頻突變的檢測。
[0040] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0041] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得 明顯和容易理解，其中：
[0042] 圖1顯示了實施例1中預(yù)文庫擴增的PCR產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果；
[0043] 圖2顯示了實施例1中遞進式目標(biāo)區(qū)域富集后純化產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果；
[0044] 圖3顯示了實施例2中預(yù)文庫擴增的PCR產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果；
[0045] 圖4顯示了實施例2中遞進式目標(biāo)區(qū)域富集后純化產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果；
[0046] 圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的目標(biāo)區(qū)域特異性引物的結(jié)構(gòu)示意圖；W及
[0047] 圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息的系統(tǒng)的結(jié) 構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0048] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā) 明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0049] 在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的引物 組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該引物組合物包括：
[0050] 第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物和所述第二通用引物的祀點位 于所述目標(biāo)區(qū)域的兩端，分別用于構(gòu)成測序文庫的5 '端和3 '端；W及
[0051] 特異性引物組，所述特異性引物組包括n條特異性引物，各特異性引物的結(jié)構(gòu)相 同，均是從5 '端至3 '端依次包括第一核酸序列、連接序列和第二核酸序列，
[0052] 其中，各特異性引物均滿足下列條件：
[0053] (1)各特異性引物的祀點，均是與所述第一通用引物的祀點分別位于所述目標(biāo)區(qū) 域的兩端，而與所述第二通用引物的祀點位于所述目標(biāo)區(qū)域的同端；
[0054] (2)所述第一核酸序列和所述第二核酸序列對應(yīng)的基因組位置位于所述目標(biāo)區(qū)域 的同端；
[0055] (3)所述第一核酸序列對應(yīng)的基因組位置與所述目標(biāo)區(qū)域之間的距離，大于所述 第二核酸序列對應(yīng)的基因組位置與所述目標(biāo)區(qū)域之間的距離；
[0056] (3)所述第一核酸序列和所述第二核酸序列在對應(yīng)的基因組位置上是連續(xù)的，但 無堿基重合；
[0057] (4)所述第一核酸序列的5'端第一個堿基距離目標(biāo)區(qū)域不超過待測核酸樣本的堿 基長度；
[0058] (5)所述連接序列由所述第二通用引物的3'端末的24個堿基構(gòu)成；
[0059] (6)n= 1-5的任意整數(shù)，Wn = 5為例，設(shè)所述特異性引物組的各特異性引物分別 為:Nl、N2、N3、N4、N5，W特異性引物的祀點與目標(biāo)區(qū)域之間的距離為衡量標(biāo)準(zhǔn)，各特異性引物 之間的距離遠(yuǎn)近關(guān)系為：
[0060] 化〉化〉化〉N4〉化。
[0061] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的引物組合物能夠有效地用于檢測待測核酸樣本目標(biāo) 區(qū)域的序列信息，尤其是超低頻突變的檢測。具體地，利用本發(fā)明的引物組合物，能夠有效 地通過PCR擴增富集所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列，進而進行建庫、測序，從而能夠有 效確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括目標(biāo)區(qū)域中所包含的點突變、插入、缺失或基 因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述目標(biāo)區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變 的至少之一。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因上。
[0064] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，兩條通用引物分別為：
[00化]第一通用引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID N0:20)，
[0066] 第二通用引物:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAG AGACAG(SEQ ID N0:21)。由此，利用本發(fā)明的引物組合物富集目標(biāo)區(qū)域序列后，能夠方便地 利用Illumina測序平臺（例如化xtSeqSOO)進行后續(xù)的建庫和測序，W便實現(xiàn)目標(biāo)區(qū)域的檢 測。
[0067] 針對特異性引物組的各特異性引物，為方便理解，發(fā)明人用圖5示出了上述目標(biāo)區(qū) 域特異性引物(有時也稱為"特異性引物"）的結(jié)構(gòu):從5'端至3'端依次包括第一核酸序列、 連接序列和第二核酸序列。
[006引此外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述目標(biāo)區(qū)域特異性引物適用的PCR擴增程序必須： 能夠先使所述第一核酸序列和模板退火，再使所述第二核酸序列和模板退火。
[0069] 換言之，利用上述目標(biāo)區(qū)域特異性引物進行PC則寸，必須通過退火溫度的調(diào)節(jié)使寬 范圍目標(biāo)區(qū)域特異性序列先和模板退火，再降低退火溫度使精確目標(biāo)區(qū)域特異性序列和模 板退火。由此，能夠顯著提高擴增的特異性。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，當(dāng)n = 2-5的任意整數(shù)時，針對所述特異性引物組，其各特異 性引物的第一核酸序列的Tm值相近，第二核酸序列的Tm值相近，且所述第一核酸序列的Tm 值比所述第二核酸序列的Tm值大5-15C。由此，能夠方便地在PCR擴增時實現(xiàn)先使所述第一 核酸序列和模板退火，再使所述第二核酸序列和模板退火。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第一核酸序列不小于30bp，所述第二核酸序列不大于 lObp。
[0072] 根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因18號外顯子上，n = 2,所 述特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0073] EGFR18-SP1 :GTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAG(/'C-'G7'C4G/你 G 賄劇F A A GA GA CA GCTTGTGG AGC (SRO ID NO: 5)，
[0074] EGFR18-SP2: CCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACCCG'70G.47'6TGT A TAA GA GA CA G'TGAATTCAAA (SEQ ID NO: 6)，
[0075] 其中，斜體且用下劃線標(biāo)記的序列為連接序列，位于連接序列的5'端的是第一核 酸序列，而位于連接序列的3 '端的是第二核酸序列。
[0076] 根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因19號外顯子上，n = 2,所 述特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0077] EGFR19-SP1: CAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACA併-'(;八.-:46\47'(7乃7對 TAAGAGACAGATTGCCAGTT(SEQ ID N0：9),
[0078] EGFR19-SP2: CTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCGY；6T'G--?a47T；7T；7：4 7X4G.4G4C4GCCGTCGCTAT(沈Q ID NO: 10)，
[0079] 其中，斜體且用下劃線標(biāo)記的序列為連接序列，位于連接序列的5'端的是第一核 酸序列，而位于連接序列的3 '端的是第二核酸序列。
[0080] 根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因20號外顯子上，n = 3,所 述特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0081 ] EGFR20-SP1 : TCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGT_(KX迂01 魚1[。了 G巧FAi按IGATA^CCATGTGCCC(沈Q ID NO: 13)，
[0082] EGFR20-SP2: hCGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGhhGCCTh^CGTCAGATGTGTATAAG AmCAGCGTGATGGCCiSEQ ID NO: 14)，
[0083] EGFR20-SP3: CCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAGGCAGCTCATC(SEQ ID NO: 15)，
[0084] 其中，斜體且用下劃線標(biāo)記的序列為連接序列，位于連接序列的5'端的是第一核 酸序列，而位于連接序列的3 '端的是第二核酸序列。
[0085] 根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因21號外顯子上，n = 2,所 述特異性引物組的各特異性引物分別為：
[0086] EGFR21-SP1 : C T G T T T C A G G G C A T G A A C T A C T T G G A G G A C C G T C G 6' CT； T'CA GA TO TG TA TAA GA GA CA GCTTGGTGCAC (SRO ID NO: 18)，
[0087] EGFR21-SP2: GGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACCaZLC4MIZ/IZ/；iIL4/lC iSifiiSAGATTTTGGG(SEQ ID NO: 19)，
[0088] 其中，斜體且用下劃線標(biāo)記的序列為連接序列，位于連接序列的5'端的是第一核 酸序列，而位于連接序列的3 '端的是第二核酸序列。
[0089] 此外，需要說明的是，利用本發(fā)明的引物組合物，通過一次PCR即可W實現(xiàn)對目標(biāo) 區(qū)域核酸序列的高特異性富集，也即本發(fā)明的引物組合物中包含的各引物(包括第一通用 引物、第二通用引物、各特異性引物)能夠極大減少與模板DNA上目標(biāo)片段W外的區(qū)域結(jié)合， 且對低豐度的模板的檢測靈敏度很高。
[0090] 在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒 包含前面所述的引物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的試劑盒能夠有效地用于檢測 待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列信息，尤其是超低頻突變的檢測。具體地，利用該試劑盒中的 引物組合物，能夠有效地通過PCR擴增富集所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列，進而進行建 庫、測序，從而能夠有效確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括目標(biāo)區(qū)域中所包含的點 突變、插入、缺失或基因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，尤其適用于低頻率突 變的檢測。
[0091] 在本發(fā)明的第=方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫 的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法利用前面所述的引物組合物或試劑盒，通過PCR擴增 富集所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列。
[0092] 由此，能夠有效地基于前述的本發(fā)明的引物組合物或試劑盒進行建庫，進而能夠 有效地用于測序，W確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括目標(biāo)區(qū)域中所包含的點突 變、插入、缺失或基因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，尤其適用于超低頻突變 的檢測。
[0093] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括:利用特異性引物組、第一通用引物和第二通 用引物的混合物對所述待測核酸樣本進行第一PCR擴增，W便獲得第一PCR擴增產(chǎn)物，其中 所述第一 PCR擴增產(chǎn)物構(gòu)成所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫。由此，利用本發(fā)明的引 物組合物，通過一次PCR即可實現(xiàn)對目標(biāo)區(qū)域核酸序列的富集，方便快捷、且檢測靈敏度高， 結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0094] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，在進行所述第一 PCR擴增之前，進一步包括對所述待測 核酸樣本進行預(yù)處理的步驟:對所述核酸樣本進行接頭連接處理；W及對接頭連接產(chǎn)物進 行第二PCR擴增。由此，模板量大，有利于目標(biāo)區(qū)域序列的PCR擴增富集。
[0095] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述目標(biāo)區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變 的至少之一。
[0096] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因上。
[0097] 在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息的 方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括:根據(jù)前面所述的構(gòu)建待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢 測文庫的方法，構(gòu)建所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫;對所述待測核酸樣本的目標(biāo) 區(qū)域檢測文庫進行測序，W便獲得測序結(jié)果；W及基于所述測序結(jié)果，確定所述待測核酸樣 本目標(biāo)區(qū)域的序列信息。
[0098] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法，能夠有效地基于前述的本發(fā)明的引物組合物或 試劑盒構(gòu)建目標(biāo)區(qū)域的測序文庫和測序，從而能夠有效確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信 息，包括目標(biāo)區(qū)域中所包含的點突變、插入、缺失或基因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果 準(zhǔn)確可靠，尤其適用于超低頻突變的檢測。
[0099] 在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域檢測文庫的 裝置。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該裝置設(shè)置有前面所述的引物組合物，所述裝置適于利用特異 性引物組、第一通用引物和第二通用引物的混合物對所述待測核酸樣本進行第一 PCR擴增， W便獲得第一 PCR擴增產(chǎn)物，其中所述第一 PCR擴增產(chǎn)物構(gòu)成所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域 檢測文庫。
[0100] 由此，利用該裝置能夠有效地基于前述的本發(fā)明的引物組合物或試劑盒進行建 庫，進而能夠有效地用于測序，W確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括目標(biāo)區(qū)域中所 包含的點突變、插入、缺失或基因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，尤其適用于 超低頻突變的檢測。
[0101] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，進一步包括預(yù)處理單元，所述預(yù)處理單元適于在進行所述 第一 PCR擴增之前，按照W下步驟對所述待測核酸樣本進行預(yù)處理:對所述核酸樣本進行接 頭連接處理；W及對接頭連接產(chǎn)物進行第二PCR擴增。由此，可W擴大模板量，有利于目標(biāo)區(qū) 域序列的PCR擴增富集。
[0102] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述目標(biāo)區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變 的至少之一。
[0103] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因上。
[0104] 在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供了一種確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息的 系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，參照圖6,該系統(tǒng)1000包括:構(gòu)建待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域檢測文 庫的裝置100、測序裝置200和序列確定裝置300。
[0105] 具體地，根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)建待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域檢測文庫的裝置100用 于構(gòu)建所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫；測序裝置200與構(gòu)建待測核酸樣本目標(biāo)區(qū) 域檢測文庫的裝置100相連，用于對所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫進行測序，W便 獲得測序結(jié)果;序列確定裝置300與測序裝置200相連，用于基于所述測序結(jié)果，確定所述待 測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列信息。
[0106] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該系統(tǒng)能夠有效地基于前述的本發(fā)明的引物組合物或試劑盒構(gòu) 建目標(biāo)區(qū)域的測序文庫和測序，從而能夠有效確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息，包括 目標(biāo)區(qū)域中所包含的點突變、插入、缺失或基因融合突變，并且檢測靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可 靠，尤其適用于超低頻突變的檢測。
[0107] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述目標(biāo)區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變 的至少之一。
[0108] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因上。
[0109] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的 實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條 件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯 的《分子克隆實驗指南》，第=版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器 未注明生產(chǎn)廠商者，均為可W通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可W采購自Illumina公司。
[0110] 實施例1
[0111] 根據(jù)本發(fā)明的確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息的方法，利用本發(fā)明的引物組 合物或試劑盒對樣本進行目標(biāo)區(qū)域突變檢測，具體步驟如下：
[0112] 1.接頭設(shè)計
[0113] Pre1ib-ADT-S:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATI11111IGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC TTCCGATCTQ 為 index區(qū)），
[0114] Pre1ib-ADT-AS:pGATCGGAAGAGC,
[0115] W上序列需要退火成雙鏈。
[0116] 連接后產(chǎn)物結(jié)構(gòu)：
[0117] Top：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCTAGATCGGAAGAGC-3'，
[0118] Bottom:5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCTAGATCGGAAGAGC-3'。
[0119] 2.引物設(shè)計
[0120] 2.1預(yù)文庫PCR引物如下：
[01 別]Pre-primerl:GCTCTTCCGATC(SEQ ID N0:1)，
[0122] Pre-primer2：CAAGCAGAAGACGGCA(SEQ ID N0：2)〇
[0123] 2.1特異性引物設(shè)計
[0124] 需注意的是，為便于識別，將各特異性引物的結(jié)構(gòu)均進行了標(biāo)記，具體地：
[0125] 各特異性引物中斜體且用下劃線標(biāo)記的序列為連接序列，位于連接序列的5'端的 是第一核酸序列，而位于連接序列的3 '端的是第二核酸序列。
[0126] (1)針對EGFR的18號外顯子上待檢測位點設(shè)計同向延伸特異性引物：
[0127] EGFR18號外顯子序列如下：
[01 巧]CTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACT GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAG(SEQ ID NO：3),
[0129] EGFR18號外顯子及其上下游內(nèi)含子區(qū)序列如下：
[0130] ATGCCGTGGCTGCTGGTCCCCCTGCTGGGCCATGTCTGGCACTGCTTTCCAGCATGGTGAGGGCTGAGG TGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGC TCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATA AGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTG CAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACT(SEQ ID NO：4),
[0131 ] EGFR18號外顯子同向延伸特異性引物序列如下：
[0132] EGFR18-SP1 :GTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGGCG7r：4G：47'G7'G7：47^ 兒(一G.4('.'4G'CTTGTGGAGC(沈Q ID N0：5),
[0133] EGFR18-SP2: CCA ACC A AGCTCTCTTGAGGATCTTG A AGG A A AC6rG70GVrf6TGr .你心樹鮮貓GTGA ATTCA A A (SRQ ID NO: 6)。
[0134] (2)針對EGFR的19號外顯子待檢測位點設(shè)計同向延伸特異性引物：
[01巧]EGFR19號外顯子序列如下：
[0。6] GGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACA TCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGAT(沈Q ID N0:7)，
[0137] EGFR19號外顯子及其上下游內(nèi)含子區(qū)序列如下：
[0138] GCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCTCACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCA GATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTG GATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACA AGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCAT GTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAA(SEQ ID NO：8),
[0139] EGFR19號外顯子同向延伸特異性引物序列如下：
[0140] EGFR19-SP1: CAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACA6rG7r/jG.4TGTG7>j TAAGAGACAGATTGCCAOTT(SKQ ID NO:9)，
[0141] EGFR19-SP2: CTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTC避型巡錫經(jīng)鹽SH 7A4G'jG/iC、.4GCCGTCGCTAT(沈Q ID NO: 10)。
[0142] (3)針對EGFR的20號外顯子待檢測位點設(shè)計同向延伸特異性引物：
[0143] EGFR20號外顯子序列如下：
[0144] GAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCC ACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGG CTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAG(SEQ ID NO：11),
[0145] EGFR20號外顯子及其上下游內(nèi)含子區(qū)序列如下：
[0146] TCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCC CCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGT GGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCT TCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAG ATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATC(SEQ ID NO：12),
[0147] EGFR20號外顯子同向延伸特異性引物序列如下：
[0148] EGFR20-SP1 :TCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTGCGTC4a4r6T GTATAAGAGACAGCCATGTGCCC(SKQ ID NO: 13)，
[0149] EGFR20-SP2: ACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTA 遠(yuǎn)島[1魚1堅亞迂iZ生迫 -4Gi0GCGTGATGGCC(SEQ ID NO: 14)，
[01 加 ]EGFR20-SP3 : CCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGT垃里互逆 GA CAGGCAGCTCATC(SEQ ID NO:15)，
[0151] (4)針對EGFR的21號外顯子待檢測位點設(shè)計同向延伸特異性引物
[0152] EGFR21號外顯子序列如下：
[01 巧]GGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAA ACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGA AGGAGGCAAA(SEQ ID NO：16),
[0154] EGFR21號外顯子及其上下游內(nèi)含子區(qū)序列如下：
[01 巧]GAGGCTCAGAGCCTGGCATGAACATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTC CCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAG CCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA GAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGA CCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTTTAACACATGCAGGGGAGGATGCTCTCCAGA(SEQ ID NO：17),
[0156] EGFR21號外顯子同向延伸特異性引物序列如下：
[0157] EGFR21-SP1 :CTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGGCG7CiGiIG7G： 7:4C4GCTTGGTGCAC(沈Q ID NO: 18)，
[0158] EGFR21-SP2:GGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCAC 遠(yuǎn)運亞i 魚1堅堅 A GA CA GAGATTTTGGG (SRO ID NO: 19)，
[0159] 通用引物序列如下：
[0160] 第一通用引物(Uni-Primerl):CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID N0:20);
[0161] 第二通用引物化ni-Primer2): AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID N0:21)。
[0162] 3.抽取5ml健康人外周血，分離2ml血漿，提取游離DM。
[0163] 4.游離DM末端修復(fù)
[0164] 配制如下反應(yīng)：
[01化]表1
[0166]
[0167] PCR儀上20°C溫浴30分鐘。
[0168] 使用12化1 Ampure XP beads進行純化，3化 1 Elution Buffer洗脫。
[0169] 5.3'端加多聚腺嚷嶺尾
[0170] 配制如下反應(yīng)：
[0171] 表2
[0172]
[0173] PCR儀上37°C溫浴30分鐘。
[0174] 使用60iU Ampure XP beads進行純化，1化1 Elution Buffer洗脫。
[0175] 6.連接接頭
[0176] 配制如下反應(yīng)：
[0177] 表3 [017 引
[0179]
[0180] PCR儀上20°C溫浴15分鐘。
[0181] 使用60]il Ampure XP beads進行純化，3化 1 Elution Buffer洗脫。
[0182] 7.預(yù)文庫擴增
[0183] 配制如下反應(yīng)：
[0184] 表4
[0185]
[0186] PCR程序如下：
[0187] a)95°C3 分鐘；
[018引 b) 10循環(huán)程序如下：
[0189] 95°C15 秒
[0190] 62°C30 秒
[0191] 72°C30 秒
[0192] c)72°C5 分鐘
[0193] d)4°C 保存。
[0194] 取加 1 PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖膠電泳檢測。檢測結(jié)果見圖1所示。
[0195] 剩余PCR產(chǎn)物使用5化1 Ampure XP beads進行純化，2化1 Elution Buffer洗脫。
[0196] 8.遞進式目標(biāo)區(qū)域富集
[0197] 將各外顯子的同向延伸特異性引物全部混合，W便得到巧GFR特異性引物組"，然 后配制如下反應(yīng)，W便一次PCR檢測多個位點：
[019引表5
[0199]
0200 0201 0202 PCR程序如下： a)95°C10 分鐘； b)2個循環(huán)程序如下：
[0203] 95°C30 秒
[0204] 68°C30 秒
[0205] 72°C1 分鐘
[0206] c) 18個循環(huán)程序如下：
[0207] 95°C30 秒
[020引 58°C30 秒
[0209] 72°C1 分鐘
[0210] d)72°C7 分鐘 e)4°C 保存。
[0212] 使用60ulAmpure XP beads進行純化，30u化B洗脫。
[0213] 取其中化1純化產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果見圖2所示。
[0214] 9.文庫經(jīng)過巧光定量PCR質(zhì)控后，進行Illumina公司化xtSeqSOO進行75bp雙端測 序。
[0215]將高通量測序下機數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控過濾后，進行BWA比對，評估各個目標(biāo)檢測位點得 到的序列數(shù)，分析結(jié)果見表6。
[0^6]表 6
[0217]
0218 0219 0220 0221 0222 0223
[0218] 本實施例使用的樣本為健康人的血漿(其待檢測區(qū)域并不含有突變），上述結(jié)果表 明：利用本發(fā)明的方法及試劑盒能夠同時檢測到目標(biāo)區(qū)域巧6。318、19、20、2巧外顯子的目 標(biāo)區(qū)域）。
[0219] 實施例2
[0220] 根據(jù)實施例1的方法對樣本進行目標(biāo)區(qū)域突變檢測，區(qū)別僅在于:本實施例采用的 樣本來自冊RIZ0N DISCOVERY公司的商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品MultiplexIcfDNAReferenceStandardSe t(Catalogue#:HD780)，取該產(chǎn)品中在EGFR待檢區(qū)域突變頻率分別為0% (野生型）和1%的 片段化DNA樣本進行檢測。
[0221] 其中，預(yù)文庫擴增的PCR產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果如圖3所示，遞進式目標(biāo)區(qū)域富集后 純化產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果如圖4所示。
[0222] 將高通量測序下機數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控過濾后，進行BWA比對，并對數(shù)據(jù)進行進一步分 析，評估突變檢測比例，分析結(jié)果見表7。
[0223] 表 7
[0224]
[0225] 上述結(jié)果表明，利用本發(fā)明的方法和試劑盒能夠準(zhǔn)確檢測突變頻率低至1 %的 EGFR基因突變。
[0226] 綜上，結(jié)合實施例1與實施例2，結(jié)果表明，本發(fā)明能夠成功地對核酸樣本的目標(biāo)區(qū) 域化GFR基因待檢區(qū)域)進行特異性檢測，且靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0227] 在本說明書的描述中，參考術(shù)語"一個實施例"、"一些實施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不 一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可W在任何 的一個或多個實施例或示例中W合適的方式結(jié)合。
[0228] 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W理解:在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可W對運些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的引物組合物，其特征在于，包括： 第一通用引物和第二通用引物，所述第一通用引物和所述第二通用引物的靶點位于所 述目標(biāo)區(qū)域的兩端，分別用于構(gòu)成測序文庫的5 '端和3 '端；以及 特異性引物組，所述特異性引物組包括n條特異性引物，各特異性引物的結(jié)構(gòu)相同，均 是從5 '端至3 '端依次包括第一核酸序列、連接序列和第二核酸序列， 其中，各特異性引物均滿足下列條件： (1) 各特異性引物的靶點，均是與所述第一通用引物的靶點分別位于所述目標(biāo)區(qū)域的 兩端，而與所述第二通用引物的靶點位于所述目標(biāo)區(qū)域的同端； (2) 所述第一核酸序列和所述第二核酸序列對應(yīng)的基因組位置位于所述目標(biāo)區(qū)域的同 端； (3) 所述第一核酸序列對應(yīng)的基因組位置與所述目標(biāo)區(qū)域之間的距離，大于所述第二 核酸序列對應(yīng)的基因組位置與所述目標(biāo)區(qū)域之間的距離； (3) 所述第一核酸序列和所述第二核酸序列在對應(yīng)的基因組位置上是連續(xù)的，但無堿 基重合； (4) 所述第一核酸序列的5'端第一個堿基距離目標(biāo)區(qū)域不超過待測核酸樣本的堿基長 度； (5) 所述連接序列由所述第二通用引物的3 '端末的24個堿基構(gòu)成； (6) n=l-5的任意整數(shù)，以n = 5為例，設(shè)所述特異性引物組的各特異性引物分別為:他、 N2、N3、N4、N 5，以特異性引物的靶點與目標(biāo)區(qū)域之間的距離為衡量標(biāo)準(zhǔn)，各特異性引物之間 的距離遠(yuǎn)近關(guān)系為： Nl〉N2>N3>N4>N5。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述第一核酸序列不小于30bp，所 述第二核酸序列不大于l〇bp， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域特異性引物適用的PCR擴增程序必須:能夠先使所述第一核酸序 列和模板退火，再使所述第二核酸序列和模板退火， 任選地，當(dāng)n = 2-5的任意整數(shù)時，針對所述特異性引物組，其各特異性引物的第一核酸 序列的Tm值相近，第二核酸序列的Tm值相近，且所述第一核酸序列的Tm值比所述第二核酸 序列的Tm值大5-15°C， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變的至少之一， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因上。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于，兩條通用引物分別為：任選地，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因18號外顯子上，n = 2,所述特異性引物組的各特異 性引物分別為：其中，斜體且用下劃線標(biāo)記的序列為連接序列，位于連接序列的5'端的是第一核酸序 列，而位于連接序列的3 '端的是第二核酸序列， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因19號外顯子上，n = 2,所述特異性引物組的各特異 性引物分別為：其中，斜體且用下劃線標(biāo)記的序列為連接序列，位于連接序列的5'端的是第一核酸序 列，而位于連接序列的3 '端的是第二核酸序列， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因20號外顯子上，n = 3,所述特異性引物組的各特異 性引物分別為：其中，斜體且用下劃線標(biāo)記的序列為連接序列，位于連接序列的5'端的是第一核酸序 列，而位于連接序列的3 '端的是第二核酸序列， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因21號外顯子上，n = 2,所述特異性引物組的各特異 性引物分別為：其中，斜體且用下劃線標(biāo)記的序列為連接序列，位于連接序列的5'端的是第一核酸序 列，而位于連接序列的3 '端的是第二核酸序列。4. 一種試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1-3任一項所述的引物組合物。5. -種構(gòu)建待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫的方法，其特征在于， 利用權(quán)利要求1-3任一項所述的引物組合物或權(quán)利要求4所述的試劑盒，通過PCR擴增 富集所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括： 利用特異性引物組、第一通用引物和第二通用引物的混合物對所述待測核酸樣本進行 第一PCR擴增，以便獲得第一PCR擴增產(chǎn)物，其中所述第一PCR擴增產(chǎn)物構(gòu)成所述待測核酸樣 本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫， 任選地，在進行所述第一 PCR擴增之前，進一步包括對所述待測核酸樣本進行預(yù)處理的 步驟： 對所述核酸樣本進行接頭連接處理；以及 對接頭連接產(chǎn)物進行第二PCR擴增， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變的至少之一， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因上。7. -種確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息的方法，其特征在于，包括： 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，構(gòu)建所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫； 對所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫進行測序，以便獲得測序結(jié)果；以及 基于所述測序結(jié)果，確定所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列信息。8. -種構(gòu)建待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域檢測文庫的裝置，其特征在于，設(shè)置有權(quán)利要求1-3 任一項所述的引物組合物，所述裝置適于利用特異性引物組、第一通用引物和第二通用引 物的混合物對所述待測核酸樣本進行第一PCR擴增，以便獲得第一PCR擴增產(chǎn)物，其中所述 第一PCR擴增產(chǎn)物構(gòu)成所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其特征在于，進一步包括預(yù)處理單元，所述預(yù)處理單元 適于在進行所述第一 PCR擴增之前，按照以下步驟對所述待測核酸樣本進行預(yù)處理： 對所述核酸樣本進行接頭連接處理；以及 對接頭連接產(chǎn)物進行第二PCR擴增， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變的至少之一， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因上。10. -種確定待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域序列信息的系統(tǒng)，其特征在于，包括： 權(quán)利要求8或9所述的構(gòu)建待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域檢測文庫的裝置，用于構(gòu)建所述待測 核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫； 測序裝置，所述測序裝置與所述構(gòu)建待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域檢測文庫的裝置相連，用 于對所述待測核酸樣本的目標(biāo)區(qū)域檢測文庫進行測序，以便獲得測序結(jié)果；以及 序列確定裝置，所述序列確定裝置與所述測序裝置相連，用于基于所述測序結(jié)果，確定 所述待測核酸樣本目標(biāo)區(qū)域的序列信息， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域包含選自點突變、插入、缺失、基因融合突變的至少之一， 任選地，所述目標(biāo)區(qū)域位于EGFR基因上。
【文檔編號】C12N15/10GK106048008SQ201610387723
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】王永利, 宋卓, 袁夢兮
【申請人】人和未來生物科技（長沙）有限公司