一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括檢測(cè)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)內(nèi)切酶HaeIII。本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌易感性風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。
【專利說(shuō)明】
一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率逐年增高，發(fā)病率占惡性腫瘤的7%?10%，全年約120萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌，占女姓腫瘤的18%。
[0003]經(jīng)研究，BRCAl與BRCA2基因的突變很大程度上增加了女性患有乳腺癌的可能性。在正常情況下，這兩種基因可傳遞控制細(xì)胞繁殖的信息。如果它們出現(xiàn)變異，細(xì)胞就會(huì)無(wú)節(jié)制地繁殖導(dǎo)致癌癥形成。但BRCAl和BRCA2在預(yù)測(cè)乳腺癌家族性風(fēng)險(xiǎn)上卻不能令人滿意，因?yàn)閿y帶BRCAl與BRCA2基因突變的人群相對(duì)很少。
[0004]人轉(zhuǎn)錄因子叉狀頭翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/wingedhelixtranscript1n factor Foxp3 )基因定位Xpl I.2?Xql3.3，屬于轉(zhuǎn)錄因子forkhead/winged_he21ix家族。Foxp3含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，cDNA全長(zhǎng)為1869bp，其編碼的蛋白Foxp3/ Scurfin由431個(gè)氨基酸組成，N末端有鋅指蛋白、亮氨酸拉鏈和一個(gè)富含脯氨酸的區(qū)域。fork2hea結(jié)構(gòu)域位于羧基端(氨基酸殘基的337?420)，通過(guò)該結(jié)構(gòu)域與DNA特定位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因的活化和表達(dá)。于2003年被證實(shí)為⑶4+0)25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryT cell ,Treg)的特異性標(biāo)志。
[0005]人CD14基因位于人5號(hào)常染色體的長(zhǎng)臂端5q23_q31，約含有1338個(gè)核苷酸殘基。從核苷酸的第76位到1200位，編碼一段有375個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。
⑶14有兩個(gè)形態(tài)，S卩m⑶14和s⑶14。111⑶14是一種55kDa的糖蛋白，通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨固于細(xì)胞膜。mCD14蛋白質(zhì)部分由包括356個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈和一個(gè)由19個(gè)氨基酸殘基組成的末端多肽鏈構(gòu)成，其末端多肽為強(qiáng)疏水性性多肽鏈。人⑶14氨基酸序列中39?44位區(qū)段是與LPS結(jié)合的必要部分。s⑶14也是一種糖蛋白其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與mCD14的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相同。
[0006]m⑶14是由含有⑶14基因的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，自行轉(zhuǎn)錄、翻譯蛋白質(zhì)多肽鏈，在高爾基復(fù)合體內(nèi)糖化后，其羧基端再與PI結(jié)合，并由PI的磷脂部分與細(xì)胞膜連接。IL-Ιβ和TNF-α能夠調(diào)節(jié)CD14基因的表達(dá)，促進(jìn)CDHmRNA的轉(zhuǎn)錄;FMLP和GM-CSF可刺激中性粒細(xì)胞，使其細(xì)胞表面的mCD14增多。sCD14則是由單核細(xì)胞產(chǎn)生。
rs2569190位于⑶14基因上5’ UTR，為A/G多態(tài)，在亞洲人群中該多態(tài)的頻率分布為 A0.500，G0.500,基因型 A/A0.205、A/G0.590、G/G0.205ors2569190 位點(diǎn)不同的基因型可以通過(guò)影響CD14基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而對(duì)CD14的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。SNP(Single nucleotide polymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，是一類基于單堿基變異引起的DNA多態(tài)性，被遺傳界稱為第三代遺傳標(biāo)記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異弓丨起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的的一類多態(tài)性標(biāo)記，占大約90%。這些基因組序列變異可以導(dǎo)致個(gè)體間表型的差異以及不同個(gè)體對(duì)疾病、特別是復(fù)雜疾病的易感性和對(duì)環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異。
[0007]基于此，研發(fā)并設(shè)計(jì)一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒，該試劑盒精密性高、穩(wěn)定性好。
[0009]本發(fā)明的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括檢測(cè)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上^2569190號(hào)5陬位點(diǎn)內(nèi)切酶他6111。
[0010]優(yōu)選，所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件:Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水，酶切常規(guī)組件:反應(yīng)緩沖液、去離子水。
[0011 ]優(yōu)選，所述PCR擴(kuò)增檢測(cè)常規(guī)組件的各組分含量為:每1yLPCR擴(kuò)增體系中包括:IyL 1X PCR 反應(yīng)緩沖液，0.5yL 25mM MgCl2 溶液，0.2yL 25mM dNTP 混合液，IU Taq DNA聚合酶，余量為去離子水。
[0012]優(yōu)選，所述試劑盒中酶切常規(guī)組件的組分和含量為，每20yL酶切反應(yīng)體系中包括2yL 1X內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液。
[0013]發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性與人體對(duì)乳腺癌易感性相關(guān)，可用于評(píng)估個(gè)體對(duì)乳腺癌的易感性的基礎(chǔ)，并且，當(dāng)被檢測(cè)DNA的Foxp3基因上的rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)基因型為雜合CT型，為乳腺癌易感型;被檢測(cè)DNA的⑶14基因上的rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)基因型攜帶有G型，為乳腺癌易感型；同時(shí)為Foxp3基因rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)為雜合CT型，⑶14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)攜帶G型的，罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)最高。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌易感基因風(fēng)險(xiǎn)性的評(píng)估。
【具體實(shí)施方式】
[0015]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的示意性實(shí)施方式及其說(shuō)明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0016]實(shí)施例1:
一種檢測(cè)乳腺癌易感性試劑盒，其組分和含量包括:1μ1 10XPCR反應(yīng)緩沖液，0.5μ125mM MgC12 溶液，0.2μ1 25mM dNTP 混合液，0.2μ1 (5UnitsAU )Taq DNA 聚合酶，ΙΟμΜ特異性引物對(duì)(四條)各0.2ul，0.5yl HaeIII內(nèi)切酶(10U/ul)，2μ1 1X內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，去離子水9μ1。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒保存溫度為-20°C。上述試劑盒的使用方法包括以下步驟:
DDNA模板的抽取
使用血液基因組DNA提取系統(tǒng)提取外周血的基因組DNA。
[0017]2):PCR反應(yīng)，目的片段的復(fù)制使用可檢測(cè)乳腺癌易感性的PCR檢測(cè)試劑盒其中，含有下列引物: 有義引物 2:5’ -ACACACAATCCATAAAGTCACC-3’
反義引物 2:5’ -ATCTCCATGCCCTAAGAAGGCCA—3’
有義引物 1:5，-CCCCAAGACCCTACACTCAC 3,
反義引物 1:5’ -AGGACACTGCCAGGAGACAC-3’
有義引物1，反義引物I特異性地復(fù)制Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性的片段，有義引物2，反義引物2特異性地復(fù)制⑶14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性的片段。PCR反應(yīng)體系總體積為ΙΟμΙ，包括Iul 1XPCR反應(yīng)緩沖液，0.5μ125mMMgC12溶液，0.2μ1 25mM dNTP 混合液，0.2μ1 (5Units/yl )Taq DNA 聚合酶，ΙΟμΜ 特異性引物對(duì)(四條)各0.2μ1，去離子水7.3μ1。在B1metra Tprofess1nalPCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件是94°C 5分鐘、進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的94°C40秒、56°C40秒、720C40 #,720C 10 分鐘。
3)限制性內(nèi)切酶酶切
使用可檢測(cè)乳腺癌易感性的PCR檢測(cè)試劑盒。在步驟2所得產(chǎn)物加入試劑盒中所包含1X內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液2μ1，HaeIII內(nèi)切酶0.5μ1 (lOU/μΙ)，去離子水7.5μ1，在37°C條件下水浴3小時(shí)。
[0018]4)SNP基因型分析
3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)步驟3所得酶切產(chǎn)物。
[0019]根據(jù)凝膠成像顯示不同條帶，所代表的基因型分析如下:
其中，同時(shí)含有3條大小為320bp，220bp，110bp的條帶，說(shuō)明被檢測(cè)DNA的Foxp3基因上的rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)基因型為雜合CT型，為乳腺癌易感型；含有2條290bp，60bp大小的條帶，說(shuō)明被檢測(cè)DNA的⑶14基因上的rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)基因型攜帶有G型，為乳腺癌易感型。聯(lián)合這3基因分析，同時(shí)為Foxp3基因rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)為雜合CT型，⑶14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)攜帶G型的罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)最高。
[0020]以上所述的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)F0Xp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上^2569190號(hào)5陬位點(diǎn)內(nèi)切酶他6111。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件:Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水，酶切常規(guī)組件:反應(yīng)緩沖液、去離子水。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增檢測(cè)常規(guī)組件的各組分含量為:每1yLPCR擴(kuò)增體系中包括:IyL 1X PCR反應(yīng)緩沖液，0.5yL 25mM MgCl2溶液，0.2yL 25mM dNTP混合液，IU Taq DNA聚合酶，余量為去離子水。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種乳腺癌易感基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中酶切常規(guī)組件的組分和含量為，每20yL酶切反應(yīng)體系中包括2yL 1X內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106048060SQ201610651265
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月10日 公開(kāi)號(hào)201610651265.7, CN 106048060 A, CN 106048060A, CN 201610651265, CN-A-106048060, CN106048060 A, CN106048060A, CN201610651265, CN201610651265.7
【發(fā)明人】黃平, 歐陽(yáng)小峰, 毛家麗, 彭宇
【申請(qǐng)人】四川金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司