一種胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑盒，包括檢測X射線交錯互補修復(fù)基因1XRCC1上Arg194Trp SNP位點、胸腺嘧啶合成酶基因TS上SNP位點的引物、特異性熒光探針對，本發(fā)明通過檢測XRCC1基因上Arg194Trp SNP位點和胸腺嘧啶合成酶基因TS上SNP位點的多態(tài)性實現(xiàn)對胰腺癌遺傳易感性風(fēng)險的評估檢測，且檢測靈敏度、準確度均較高。
【專利說明】
一種胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑合
ΙΤΓΤ.0
【背景技術(shù)】
[0002]胰腺癌惡性程度高，不易早期發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移早且快、預(yù)后差。據(jù)統(tǒng)計，在確診后只有12%?15%的病例可進行手術(shù)根治，術(shù)后5年生存率僅O?2%，而90%以上的病人在確診后I年內(nèi)死亡，平均存活期少于6個月。過去，人們常說，肝癌是“癌中之王”，而胰腺癌則是“王中之王”。胰腺癌早期無明顯癥狀，或僅僅有上腹部不適和食欲減退。癌腫發(fā)展到一定程度后開始出現(xiàn)癥狀，有上腹痛、黃疸和體重減輕。另外，由于消化功能紊亂，還可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹脹、腹瀉或便秘等消化道癥狀。
人類X射線交錯互補修復(fù)基因IXRCCl是第一個分離到的影響細胞對電離輻射敏感性的哺乳動物基因，該基因廣泛參與DNA損傷的修復(fù)。XRCCl基因Argl94Trp是該基因第6號外顯子上的一個C/T多態(tài)位點，引起XRCCl基因編碼蛋白的第194個氨基酸由Arg變?yōu)門rp。該位點有三種基因型，分別為CC(Arg/Arg)、CT(Arg/Trp)、TT(Trp/Trp)，其中CT(Arg/Trp)、TT(Trp/Trp)被確定為胰腺癌的風(fēng)險基因型。研究顯示，當個體攜帶風(fēng)險基因型時XRCCl蛋白的活性降低，堿基切除修復(fù)能力降低，DNA損傷增多，胰腺癌患者的總生存期的變短。
[0003 ] TS基因編碼的胸腺嘧啶合成酶參與葉酸代謝通路。葉酸代謝:在從葉酸轉(zhuǎn)變生成5-甲基四氫葉酸的過程中涉及四個基本的生化步驟。TS基因的啟動子區(qū)存在一個28bp的串聯(lián)重復(fù)多態(tài)(2R/3R)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，當該位點的串聯(lián)重復(fù)為3R時，第2個重復(fù)片段會出現(xiàn)一個G/C多態(tài)，因此形成雙重多態(tài)。以上兩種多態(tài)組成六種基因型:3Rg/3Rg、3Rg/3Rc、3Rg/2R、3Rc/2R、2R/2R、3Rc/3Rc，其中現(xiàn)已確定3Rc/3Rc為胰腺癌的風(fēng)險基因型。研究顯示，TS基因2R/3R多態(tài)可以調(diào)節(jié)TS基因表達，其中3R等位基因的第2個重復(fù)片段的G/C多態(tài)與TS表達水平下降有關(guān)，而TS酶活性下降將減少dUMP甲基化生成dTMP，破壞dNTP池(S卩dATP，dTTP，dCTP，dGTP的比例)的平衡，增加尿嘧啶錯誤滲入DNA的機會，尿嘧啶經(jīng)切除修復(fù)導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，引起染色體損傷和脆性位點的產(chǎn)生。有研究表明，攜帶3Rc/3Rc基因型者患胰腺癌的風(fēng)險明顯增加。
基于此，研發(fā)一種通過檢測相應(yīng)SNP位點的胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑盒，該試劑盒檢測精密性高、穩(wěn)定性好。
[0005]本發(fā)明的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
一種胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑盒，包括檢測X射線交錯互補修復(fù)基因IXRCCl上Arg194Trp SNP位點、胸腺嘧啶合成酶基因TS上SNP位點的引物、特異性熒光探針對。
[0006]優(yōu)選，所述試劑盒還包括PCR擴增檢測的常規(guī)組件:Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水，酶切常規(guī)組件:反應(yīng)緩沖液、去離子水。
[0007]優(yōu)選，所述檢測試劑盒還包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
[0008]優(yōu)選，所述檢測試劑盒中各組分及其含量為:10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5μ1，25πιΜdNTP混合液0.2μ1，25πιΜ MgC12溶液I.5μ1，5unitsAU Taq DNA聚合酶0.125μ1，20μΜ特異性引物對每條引物各0.25μ1，去離子水18.675μ1。
[0009]本發(fā)明所述的檢測試劑盒，保存溫度為-20°C。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果:
本發(fā)明通過檢測XRCCl基因上Argl94Trp SNP位點和胸腺嘧啶合成酶基因TS上SNP位點的多態(tài)性實現(xiàn)對胰腺癌遺傳易感性風(fēng)險的評估。
【具體實施方式】
[0011]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。
[0012]實施例1:
胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
(I)DNA模板的抽取
使用硅膠吸附法提取口腔上皮細胞的基因組DNA。
[0013](2):電泳檢測分型
檢測試劑盒中的電泳檢測套裝，反應(yīng)體系為總體積25μ1，包含濃度為12.5ng/yl的DNA模板 1μ1、10Χ PCR 反應(yīng)緩沖液 2.5μ1，25πιΜ dNTP 混合液 0.2μ1，25mM MgC12 溶液 1.5μ1，5unitsM Taq DNA聚合酶0.125μ1，20μΜ電泳檢測引物對每條引物各0.25μ1，去離子水18.675μ10
[0014]反應(yīng)條件為:在PCR擴增儀上進行反應(yīng)，94°C、12分鐘，進行30個循環(huán)的94°C、30秒，60 0C、30秒，72 °C、30秒，然后進行72 °C、1分鐘。
利用電泳技術(shù)，進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶的數(shù)量。
[0015](3):熒光定量PCR反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，分別進行2次獨立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個反應(yīng)的體系為總體積10μ1，包含濃度為20ngAU的DNA模板2μ1、1μ1 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、Ο.?μ? 25mM dNTP混合液、0.6μ1 25mM MgC12溶液、0.025yl(5unitsAU)Taq DNA聚合酶、20μΜ的有義引物和反義引物各0.225μ1、ΙΟμΜ的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25μ I，去尚子水5.325μ1。
[0016]在PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、1分鐘，進行60個循環(huán)的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
[0017](4)基因型分析
根據(jù)試劑盒使用說明書標示的基因分型圖示對SNP位點進行基因型分析。
[0018]熟悉電泳檢測技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識電泳圖上DNA條帶的位置和數(shù)量來確定所檢測的SNP位點的基因型。 熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0019]以上所述的【具體實施方式】，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的【具體實施方式】而已，并不用于限定本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測X射線交錯互補修復(fù)基因IXRCCl上Argl94Trp SNP位點、胸腺嘧啶合成酶基因TS上SNP位點的引物、特異性熒光探針對。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種胰腺癌遺傳易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒中各組分及其含量為:1X PCR反應(yīng)緩沖液2.5μ1，25mM dNTP混合液0.2μ1，25mMMgC12溶液1.5μ1，5unitsAU Taq DNA聚合酶0.125μ1，20μΜ特異性引物對每條引物各0.25μI，去尚子水18.675μ1 ο
【文檔編號】C12Q1/68GK106048061SQ201610652159
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月10日 公開號201610652159.0, CN 106048061 A, CN 106048061A, CN 201610652159, CN-A-106048061, CN106048061 A, CN106048061A, CN201610652159, CN201610652159.0
【發(fā)明人】周煒, 歐陽小峰, 毛家麗, 周宇
【申請人】四川金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司