用于抑制植物種子發(fā)芽的混合菌株及其作為除草劑的用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌株，所述混合菌株由乳酸菌菌株和酵母菌株組成；還提供一種除草劑，其特征為，所述除草劑包含所述菌株、所述菌株的培養(yǎng)物或所述菌株的培養(yǎng)液的濃縮液和農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體；還提供一種除草劑的制備方法，所述制備方法包括培養(yǎng)所述混合菌株的步驟；還提供一種雜草的去除方法，所述方法通過用所述菌株、所述菌株的培養(yǎng)物或所述菌株的培養(yǎng)液的濃縮液對(duì)土壤進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)。KCTC12710BP20141113KCTC12711BP20141113KCTC12712BP20141113KCTC12713BP20141113KCTC12714BP20141113KCTC12715BP20141113KCTC12716BP20141113KCTC12717BP20141113
【專利說明】
用于抑制植物種子發(fā)芽的混合菌株及其作為除草劑的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種用于抑制植物種子發(fā)芽的混合菌株及其作為除草劑的用途，更詳 細(xì)地，設(shè)及一種用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌株，其由乳酸菌菌株和酵母菌株組成； 還提供一種除草劑，其特征為，其包含所述菌株、所述菌株的培養(yǎng)物或所述菌株的培養(yǎng)液的 濃縮液和農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體;還提供一種除草劑的制備方法，其包括培養(yǎng)所述混合菌 株的步驟;還提供一種雜草的去除方法，其通過用所述菌株、所述菌株的培養(yǎng)物或所述菌株 的培養(yǎng)液的濃縮液對(duì)±壤進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中雜草種的種類非常多，并且，其危害巨大。雜草與作物爭(zhēng)奪作物在 生長(zhǎng)中所必需的水分、營(yíng)養(yǎng)及太陽光線，從而降低作物的質(zhì)量和數(shù)量，因此成為降低作物生 產(chǎn)性的重要限制因素。目前，為了防治雜草，盡管使用各種有機(jī)合成除草劑，但是由雜草引 起的作物的生產(chǎn)損失仍然很大，運(yùn)是由于除草劑的持續(xù)使用會(huì)引起雜草菌落的生態(tài)學(xué)變 化，W及會(huì)誘發(fā)對(duì)于除草劑的耐性所致。至今，為了防治雜草而大量使用的有機(jī)合成除草 劑，即發(fā)芽抑制劑或莖葉處理劑所引起的環(huán)境污染及人畜毒性的問題非常嚴(yán)重，因此，一直 需要開發(fā)出毒性低、環(huán)保的新微生物除草劑。
[0003] 運(yùn)種微生物除草劑作為可W代替現(xiàn)有的合成除草劑的環(huán)保防治方法法而被人們 接受。最近，為了防治雜草，正在進(jìn)行很多應(yīng)用微生物衍生植物毒素(phytotoxins)的研究。
[0004] 另外，雖然韓國公開專利第2004-0034764號(hào)公開了 一種新菌株鏈霉菌屬8E12及利 用其的除草劑，韓國公開專利第2009-0005917號(hào)公開了一種種子發(fā)芽抑制組合物及其生產(chǎn) 方法，但沒有公開本發(fā)明中所述的"用于抑制植物種子發(fā)芽的混合菌株及其作為除草劑的 用途'。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 要解決的技術(shù)問題
[0006] 本發(fā)明是根據(jù)上述要求而提出的，本發(fā)明人用處理于植物的微生物營(yíng)養(yǎng)劑對(duì)植物 種子進(jìn)行處理的結(jié)果，確認(rèn)了發(fā)芽被抑制后，從所述微生物營(yíng)養(yǎng)劑中純系分離出4種乳桿菌 屬菌株和4種酵母。并且，在運(yùn)些菌株中，使用作為由短乳桿菌LBV-61菌株、植物乳桿菌亞種 LPT30菌株及德爾布有抱圓酵母TDB-34菌株組成的混合菌株的培養(yǎng)液的DAG-A培養(yǎng)液和作 為由類干酪乳桿菌堅(jiān)初亞種LPC63菌株、布氏乳桿菌LBN62菌株、庫德里阿茲威畢赤酵母 P邸-51菌株及拜耳接合酵母ZBA-22菌株組成的混合菌株的培養(yǎng)液的DAG-B培養(yǎng)液，分別對(duì) 作為雜草植物的碑子、馬唐、反枝寬、一年蓬及荷麻植物的種子進(jìn)行處理的結(jié)果，確認(rèn)了與 使用混合其它乳桿菌屬菌株和酵母菌株而培養(yǎng)的培養(yǎng)液進(jìn)行處理時(shí)相比，各雜草植物種子 的發(fā)芽顯著被抑制。由此確認(rèn)了本發(fā)明的兩套混合菌株分別抑制雜草植物種子的發(fā)芽，從 而能夠作為除草劑非常有效地使用，并且完成了本發(fā)明。
[0007] 技術(shù)方案
[0008] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種用于抑制雜草植物的種子發(fā)芽的混合菌株， 其由乳酸菌菌株和酵母菌株組成。
[0009] 并且，本發(fā)明提供一種除草劑，其特征為，所述除草劑包含所述混合菌株、所述菌 株的培養(yǎng)物或所述菌株的培養(yǎng)液的濃縮液和農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。
[0010] 并且，本發(fā)明提供一種除草劑的制備方法，所述制備方法包括培養(yǎng)所述混合菌株 的步驟。
[0011] 并且，本發(fā)明提供一種雜草的去除方法，所述方法通過用所述混合菌株、所述菌株 的培養(yǎng)物或所述菌株的培養(yǎng)液的濃縮液對(duì)±壤進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)。
[0012]有益效果
[0013] 本發(fā)明中，確認(rèn)了由乳酸菌菌株和酵母菌株組成的兩套混合菌株培養(yǎng)液分別抑制 雜草植物種子的發(fā)芽，從而雜草植物的除草效果優(yōu)異。因此，本發(fā)明的包含混合菌株作為有 效成分的除草劑可W作為環(huán)保型生物農(nóng)藥劑廣泛有用地使用。
【附圖說明】
[0014] 圖1示出用DAG-A處理1周后的碑子雜草植物種子的發(fā)芽形態(tài)（左邊的無處理表示 DAG-A無處理;右邊的25表示將DAG-A培養(yǎng)液稀釋為1/4而進(jìn)行的處理）。
[0015] 圖2示出用DAG-B處理1周后的馬唐雜草植物種子的發(fā)芽形態(tài)（左邊的無處理表示 DAG-B無處理;右邊的12.5表示將DAG-B培養(yǎng)液稀釋為1/8而進(jìn)行的處理）。
[0016] 圖3示出用DAG-A處理1周后的反枝寬雜草植物種子的發(fā)芽形態(tài)（左邊的無處理表 示DAG-A無處理;右邊的12.5表示將DAG-A培養(yǎng)液稀釋為1/8而進(jìn)行的處理）。
[0017] 圖4示出用DAG-A處理1周后的一年蓬雜草植物種子的發(fā)芽形態(tài)（左邊的無處理表 示DAG-A無處理;右邊的12.5表示將DAG-A培養(yǎng)液稀釋為1/8而進(jìn)行的處理）。
[0018] 圖5示出用DAG-A處理1周后的荷麻雜草植物種子的發(fā)芽形態(tài)（左邊的無處理表示 DAG-A無處理;右邊的3.13表示將DAG-A培養(yǎng)液稀釋為1/32而進(jìn)行的處理）。
[0019] 圖6示出插秩2周后的混合菌株培養(yǎng)液無處理區(qū)左側(cè)田和混合菌株培養(yǎng)液處理區(qū) 右側(cè)田的樣子(B和C為混合菌株培養(yǎng)液無處理區(qū)左側(cè)田（B)和混合菌株培養(yǎng)液處理區(qū)右側(cè) 田（C)的放大圖）。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌 株，其由乳酸菌菌株和酵母菌株組成。
[0021] 在本發(fā)明的一具體例的混合菌株中，所述乳酸菌菌株可W為乳桿菌屬 (Lactobacillus sp.)菌株，優(yōu)選為選自植物乳桿菌亞種LPT30(Lactobacillus plantarum subsp .plantarum LPT30)菌株化CTCl27lOBP)、短乳桿菌LBV-6ULactobacillus brevis LBV-61)菌株化CTC 12711BP)、布氏乳桿菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株 (KCTC 12712BP)及類干酪乳桿菌堅(jiān)初亞種 LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株化CTC12713BP)中的一種W上的菌株，但不限定于此。
[0022] 在本發(fā)明的一具體例的混合菌株中，所述酵母菌株可W為選自庫德里阿茲威畢赤 酵母P邸-51(Pichia kiulriavzevii P邸-51)菌株化CTC 12714BP)、德爾布有抱圓酵母TDB- 34(Torulaspora delbrueckii TDB-34)菌株化CTC 12715BP)、拜耳接合酵母ZBA-22 (Zygosaccharomyces bailii ZBA-22)菌株化CTC 12716BP)及雙抱接合酵母ZBP-52 (Zygosaccharomyces bisporus ZBP-52)菌株化CTC 12717BP)中的一種W上的菌株，但不 限定于此。
[0023] 所述四種乳桿菌屬菌株和四種酵母菌株于2014年11月13日，分別保藏在韓國典型 培養(yǎng)物保藏中屯、
I。保藏編號(hào)為各菌株名后括號(hào)內(nèi)所示出的編 號(hào)。
[0024] 在本發(fā)明的一具體例的混合菌株中，所述混合菌株可W優(yōu)選由短乳桿菌LBV-61 化 actobacillus brevis LBV-61)菌株（KCTC 12711BP)、植物乳桿菌亞種 LPT30 (Lactobacillus plantarum subsp.plantarum LPT30)菌株化CTC 12710BP)及德爾布有抱 圓酵母TDB-34(To;rulaspora de化rueckii TDB-34)菌株化CTC 12715BP)組成，但不限定于 此。
[0025] 在本發(fā)明的一具體例的混合菌株中，所述混合菌株可W優(yōu)選由類干酪乳桿菌堅(jiān)初 亞種LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株化CTC 12713BP)、布 氏乳桿菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株化CTC 12712BP)、庫德里阿茲威畢 赤酵母P邸-51(PicMa kiulriavzevii P邸-51)菌株化CTC 12714BP)及拜耳接合酵母ZBA- 22(巧gosaccharomyces bailii ZBA-22)菌株化CTC 12716BP)組成，或者可W由類干酪乳 桿菌堅(jiān)初亞種LPC63化actobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株化CTC 12713BP)、布氏乳桿菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株化CTC 12712BP)、庫德 里阿茲威畢赤酵母P邸-51(Pichia kiulriavzevii P邸-51)菌株化CTC 12714BP)及雙抱接 合酵母ZBP-52(Zygosaccha;romyces bisporus ZBP-52)菌株化CTC 12717BP)組成，但不限 定于此。
[0026] 在本發(fā)明的一具體例的混合菌株中，所述雜草植物作為一年生的雜草植物，其可 W為禾本科雜草或闊葉雜草，可W優(yōu)選為選自碑子、馬唐、反枝寬、一年蓬及荷麻中的一種 W上的雜草植物，但并不限定于此。
[0027] 尤其，對(duì)耕作預(yù)定地點(diǎn)的±壤進(jìn)行耕転時(shí)預(yù)先使用，因此，不會(huì)影響欲時(shí)機(jī)性栽培 的特定作物種子的發(fā)芽，在通常使用種子公司供應(yīng)的涂覆種子時(shí)更是如此。
[0028] 本發(fā)明的混合菌株除了對(duì)所述的碑子、馬唐、反枝寬、一年蓬及荷麻W外，對(duì)任何 一年生的雜草植物種子均可W示出發(fā)芽抑制活性。尤其是在欲栽培的特定作物種子的情況 下，由于種子公司在通常情況下已經(jīng)通過種子涂覆等操作來實(shí)施了病害蟲防治處理，因此， 即使使用本發(fā)明的混合菌株進(jìn)行處理，還是能夠?qū)﹄s草植物種子顯示出特異性發(fā)芽抑制活 性。
[0029] 另外，本發(fā)明提供一種除草劑，其特征為，所述除草劑包含所述混合菌株、所述菌 株的培養(yǎng)物或所述菌株的培養(yǎng)液的濃縮液和農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。運(yùn)種載體不受特別的 限制，其選自藥劑學(xué)或營(yíng)養(yǎng)學(xué)上可接受的載體及稀釋劑。
[0030] 將從本發(fā)明的培養(yǎng)菌株的步驟中獲得的所述菌株或所述菌株的培養(yǎng)物或所述菌 株的培養(yǎng)液的濃縮液作為添加物使用時(shí)，可W直接添加所述菌株或所述菌株的培養(yǎng)物或所 述菌株的培養(yǎng)液的濃縮液而使用，或者也可W與其它添加劑一起使用，并且，可W根據(jù)常規(guī) 的方法適當(dāng)使用。有效成分的混合量可W根據(jù)其的使用目的而適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行確定。添加劑優(yōu) 選為由糖蜜及西紅柿果汁組成的所述菌株的營(yíng)養(yǎng)劑，最優(yōu)選地，可W為將500g糖蜜（白利糖 度(Brix)79.8°)、50g西紅柿果汁溶解于1L水中而制備的微生物營(yíng)養(yǎng)劑，但并不限定于此。
[0031] 另外，本發(fā)明提供一種除草劑的制備方法，所述制備方法包括培養(yǎng)所述混合菌株 的步驟。
[0032] 本發(fā)明的培養(yǎng)菌株的方法，可W根據(jù)本領(lǐng)域通常利用的方法培養(yǎng)。
[0033] 另外，本發(fā)明提供一種雜草的去除方法，所述方法通過用所述混合菌株、所述菌株 的培養(yǎng)物或所述菌株的培養(yǎng)液的濃縮液對(duì)±壤進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)。下面根據(jù)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行更加詳細(xì)地說明。然而，下述實(shí)施例僅是用于例示本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不限定于 此。
[0034] 材料及方法
[0035] 菌株的分離及鑒定
[0036] 用使用生理鹽水對(duì)施用于園藝作物耕地的微生物營(yíng)養(yǎng)劑進(jìn)行稀釋后，將0.1ml的 其懸浮液分別涂抹于BCP培養(yǎng)基(BCP，E化en公司的BCP平板計(jì)數(shù)瓊脂板(Plate Count Agar Plate))和PDA培養(yǎng)基（PDA，DifCO公司的蛋白腺馬鈴馨葡萄糖瓊脂板（Bacto Potato Dextrose Agar Plate))上，BCP在37°C下培養(yǎng)、PDA在30°C下培養(yǎng)，并觀察了繁育的菌落。在 BCP中采集使菌落周圍變成黃色的菌落，并再次在BCP中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，從而分離了乳酸菌， 另外，對(duì)在PDA中繁育的菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)，從而分離了酵母。
[0037] 根據(jù)16S rDNA序列，對(duì)乳酸菌進(jìn)行了系統(tǒng)學(xué)分類。從在37°C下，在MRS培養(yǎng)基(MRS, Difco公司的蛋白腺乳酸桿菌MRS瓊脂平板（Bacto Lactobacilli MRS Agar Plate))中培 養(yǎng)72小時(shí)的菌體中提取了DNA，用PCR(引物：27F，5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'（SEQ ID No:9)及 1492R，5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'（沈Q ID No:10)/30周期：95°C15分 鐘，95 °C 20秒，55 °C 40秒，72 °C 1分鐘30秒，72 °C 5分鐘，之后10°C無限)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增而精制， 然后使用DNA分析儀ABI 3730XL(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems))分析堿基 序列后，用序列比對(duì)(CLUSTAL)X(化omson et al. ,1994)和MEGA程序確認(rèn)了系統(tǒng)學(xué)位置。 [003引另外，根據(jù)18S rDNA序列，對(duì)酵母進(jìn)行了分類。即從在30°C下在PDA中培養(yǎng)48小時(shí) 的菌體中，提取了DNA，用PCR(引物：ITS1，5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'（沈Q ID No: 11)及ITS4,5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'（SEQ ID N0:12)/30周期：95°C15分鐘，95 °C20秒，55°C40秒，72°C 1分鐘30秒，72°C5分鐘，之后10°C無限）對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增而精制，然后 用如上的方法分析堿基序列后，確認(rèn)了系統(tǒng)學(xué)位置。
[0039] 微生物的培養(yǎng)方法
[0040] 將乳酸菌類分別接種于MRS(MRS，Difco公司的蛋白腺乳酸桿菌MRS肉湯（Bacto Lactobacilli MRS Broth))培養(yǎng)基中，并在32°C下靜置培養(yǎng)96~120小時(shí)，從而獲得了活菌 數(shù)為108c.f.u.ml-i水平的完全培養(yǎng)液（卻叫註嗎）。將酵母類分別接種于PDB(PDB，Difco 公司的蛋白腺馬鈴馨葡萄糖肉湯（Bacto化化to Dextrose Broth))培養(yǎng)基中，并在30°C下 振蕩培養(yǎng)48~72小時(shí)，從而獲得了活菌數(shù)為108c.f.u.mri水平的完全培養(yǎng)液。將在前面獲 得的各菌株的完全培養(yǎng)液分別W0.5%接種于糖蜜培養(yǎng)基(Molasses化〇化）中，并在24±2 °C下靜置培養(yǎng)4~6周，從而實(shí)施了本培養(yǎng)。將5g酵母提取物、50g糖蜜（白利糖度79.8°) W及 lOg西紅柿果汁溶解于1L水中，從而制備了用于本培養(yǎng)的糖蜜培養(yǎng)基(P冊(cè).5±0.2,25°C)。
[0041] 培養(yǎng)液的回收
[0042] 培養(yǎng)期間，微生物的活菌數(shù)被控制為，在培養(yǎng)初期上升，在中期W后減少，與乳酸 菌類的活菌數(shù)相比，酵母類的活菌數(shù)一直低。培養(yǎng)后期的活菌數(shù)中，乳酸菌類為l〇6c化/ml 水平，酵母類為l〇4c化/ml水平。培養(yǎng)期間，培養(yǎng)液的抑從抑6.5逐漸減少，直到末期抑達(dá)到 3.2~4.2范圍。
[0043] 混合培養(yǎng)液DAG-A及DAG-B的制備
[0044] 首先，根據(jù)前述微生物培養(yǎng)方法，分別將短乳桿菌LBV-61 (Lactobacillus brevis LBV-61)菌株化CTC 1271 IBP)及植物乳桿菌亞種LPT30(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum LPT30)菌株化CTC 12710BP)在MRS培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)120小時(shí)，并將德爾 布有抱圓酵母TDB-34(Torulaspora de化rueckii TDB-34)菌株化CTC12715BP)在PDB培養(yǎng) 基中振蕩培養(yǎng)60小時(shí)。將由此獲得的培養(yǎng)液分別W0.5%接種于糖蜜培養(yǎng)基中，并再次靜置 培養(yǎng)6周，并由此回收了混合培養(yǎng)液DAG-A。
[0045] 分別將類干酪乳桿菌堅(jiān)初亞種LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株化CTC 12713BP)及布氏乳桿菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株化CTC 12712BP)在MRS培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)120小時(shí)，并將庫德里阿茲 威畢赤酵母P邸-51(PicMa kiulriavzevii P邸-51)菌株化CTC 12714BP)、拜耳接合酵母 ZBA-22(巧gosaccharomyces bailii ZBA-22)菌株化CTC 1271 她P)或雙抱接合酵母ZBP-52 (Zygosaccharomyces bisporus ZBP-52)菌株化CTC 12717BP)在PDB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)60 小時(shí)。將由此獲得的培養(yǎng)液分別W0.5%接種于糖蜜培養(yǎng)基中，并再次靜置培養(yǎng)6周，并由此 回收了混合培養(yǎng)液DAG-B。
[0046] 發(fā)芽抑制活性的測(cè)定
[0047] 對(duì)象雜草植物種子為禾本科雜草的碑、馬唐種子、闊葉雜草的反枝寬、一年蓬、荷 麻的種子。對(duì)于處理濃度，W試驗(yàn)藥劑即培養(yǎng)液原液100作為基準(zhǔn)，每次將其稀釋為1/2倍而 使用。即，按100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05等依次進(jìn)行稀 釋而試驗(yàn)。在60 X 15mm培養(yǎng)皿上鋪上兩張55mm濾紙，并將10-20個(gè)雜草種子接種到上面后， 按照混合培養(yǎng)液的濃度分別處理5ml，并且，用5ml蒸饋水來代替培養(yǎng)液進(jìn)行處理，從而進(jìn)行 了對(duì)照試驗(yàn)(無處理區(qū)）。將培養(yǎng)皿用石蠟?zāi)っ芊庵蠓湃肷L(zhǎng)箱中保管并觀察。此時(shí)，生長(zhǎng) 箱調(diào)節(jié)成光條件12小時(shí)（3(TC)/暗條件12小時(shí)（25°C)。將處理一周后發(fā)芽的個(gè)體數(shù)即產(chǎn)生 幼根的數(shù)字進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，并用百分率表示相對(duì)于無處理區(qū)中的發(fā)芽率的處理區(qū)發(fā)芽率。 [004引包含微生物營(yíng)養(yǎng)劑的混合菌株培養(yǎng)液的制備
[0049] 為了施用混合培養(yǎng)液，對(duì)于田面積1段步（枉占，韓國±地面積單位，一段步為300 坪，即1.48畝）（10a)準(zhǔn)備30化的水，在其中加入500ml的DAG-B和1，000ml營(yíng)養(yǎng)劑并進(jìn)行混合 之后噴灑在表面。此時(shí)，營(yíng)養(yǎng)劑是將500g糖蜜（白利糖度79.8°)、50g西紅柿果汁溶解于1L水 中而制得(pH 6.5±0.2,25°C)。添加營(yíng)養(yǎng)劑是為了提高混合培養(yǎng)液的稀釋過程和噴灑后的 混合菌株的±壤扎根的穩(wěn)定性。
[0050] 利用混合菌株的培養(yǎng)液的田間試驗(yàn)
[0化1]為了確認(rèn)對(duì)于杳作(首巧）的除草效果，2014年春天在位于韓國忠清南道論山市 練武邑陽地里的田里進(jìn)行了試驗(yàn)。田的管理遵守了商法。即在4月中旬對(duì)田的±壤進(jìn)行耕転 后，5月10日左右進(jìn)行了誘灌和祀地和插秩(=光稻）。^南北向的田巧作為中屯、進(jìn)行了區(qū) 分，即左側(cè)為無處理區(qū)，右側(cè)為處理區(qū)（參見圖6)，對(duì)于處理區(qū)，在4月中旬對(duì)田的±壤進(jìn)行 耕転后，立即施用了混合培養(yǎng)液DAG-B和營(yíng)養(yǎng)液。將500ml的DAG-B和1，000ml的營(yíng)養(yǎng)劑稀釋 于30化水后，均勻噴灑到±壤表面的每段步（10a)上。進(jìn)行插秩后，對(duì)于無處理區(qū)和處理區(qū) 的雜草產(chǎn)生狀態(tài)進(jìn)行了比較觀察。
[0052] 實(shí)施例1:菌株的分離及鑒定結(jié)果
[0053] 根據(jù)前述的方法，分離四種乳酸菌、四種酵母，并分析它們的rDNA堿基序列（參見 SEQ ID No:l至8)，并進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分類。其結(jié)果，乳酸菌LBV-61菌株被鑒定為短乳桿菌 化actobacillus brevis)、LPT30被鑒定為植物乳桿菌亞種化actobacillus plantarum subsp. plantarum)、LPC63被鑒定為類干酪乳桿菌堅(jiān)初亞種化actobacillus paracasei subsp. tolerans)、LBN62被鑒定為布氏乳桿菌（Lactobaci 1 lus buchneri)。并且，酵母TDB- 34菌株被鑒定為德爾布有抱圓酵母(Torulaspora de化rueckii)、PKD-51被鑒定為庫德里 阿茲威畢赤酵母（Pichia kud;riavzevii)、ZBA-22被鑒定為拜耳接合酵母 (Zygosaccharomyces bai 1 ii )、ZBP-52被鑒定為雙抱接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus)。
[0054] 實(shí)施例2:具有發(fā)芽抑制活性的混合菌株的篩選
[0055] 確認(rèn)了將本發(fā)明中分離的四種乳桿菌屬菌株和四種酵母進(jìn)行混合而培養(yǎng)時(shí)具有 發(fā)芽抑制活性，并由此分別組合為下述表1所示的12種情況并制備了混合菌株，從而獲得了 混合培養(yǎng)液。
[0056] 對(duì)運(yùn)些混合培養(yǎng)液對(duì)于禾本科雜草(碑子）、闊葉雜草(反枝寬)種子的發(fā)芽抑制活 性進(jìn)行了比較，并在表1中示出了其結(jié)果。其中，用示出0%發(fā)芽率的混合培養(yǎng)液的稀釋倍數(shù) 來表示種子發(fā)芽抑制濃度。即100表示用培養(yǎng)液原液進(jìn)行試驗(yàn)，50表示將培養(yǎng)液稀釋為1/2 而進(jìn)行試驗(yàn)。如表1中所示，根據(jù)菌株的組合，發(fā)芽抑制活性有差異。在3號(hào)組合(短乳桿菌 LBV-61 化actobacil lus brevis LBV-61)+植物乳桿菌亞種LPT30 化actobacil lus plantarum subsp.plantarum LPT30)+德爾布有抱圓酵母TDB-34(To;rulaspora de化rueckii TDB-：34))菌株和10號(hào)組合（類干酪乳桿菌堅(jiān)初亞種LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)+布氏乳桿菌LBN62(Xactobacillus buchneri LBN62) +庫德里阿茲威畢赤酵母PKD-51(Pichia kudriavzevii PKD-51)+拜耳接合酵母ZBA-22 (巧gosaccharomyces bailii ZBA-22))菌株中的活性較高。并且，在10號(hào)組合中，用雙抱接 合酵母ZBP-52(Zygosaccharomyces bisporus ZBP-52)菌株代替拜耳接合酵母ZBA-22也示 出了相同的結(jié)果。
[0057] 總而言之，本發(fā)明中分離的四種乳桿菌屬菌株和四種酵母進(jìn)行混合的混合菌株在 種子發(fā)芽抑制活性方面雖然有一定的差異，但在所有組合中都具有種子發(fā)芽抑制活性。
[005引表1混合培養(yǎng)菌株的組合和種子發(fā)芽抑制濃度(稀釋倍數(shù)）
[0化9]
[0060] *種子發(fā)芽抑制濃度用示出0%發(fā)芽率的混合培養(yǎng)液的稀釋倍數(shù)表示。即100:使用 培養(yǎng)液原液;50:將培養(yǎng)稀釋為1/2而使用。
[0061 ]實(shí)施例3:被篩選的混合菌株培養(yǎng)液的發(fā)芽抑制活性
[0062] 對(duì)實(shí)施例2中示出較高活性的3號(hào)及10號(hào)組合進(jìn)行了進(jìn)一步的試驗(yàn)。將3號(hào)組合的 培養(yǎng)液命名為DAG-A，將10號(hào)組合的培養(yǎng)液命名為DAG-B，并擴(kuò)大對(duì)象雜草植物，即對(duì)碑子、 馬唐(禾本科雜草)W及反枝寬，一年蓬、荷麻(闊葉雜草)的種子進(jìn)行了發(fā)芽抑制活性試驗(yàn)。
[0063] 將根據(jù)DAG-A及DAG-B的濃度的雜草種子發(fā)芽率表示在表2至表6中，將處理1周后 的發(fā)芽形態(tài)W照片的形式表示在圖1至圖5中。DAG-A及DAG-B混合菌株雖然在根據(jù)濃度的種 子發(fā)芽抑制活性方面具有差異，但對(duì)于所有禾本科雜草及闊葉雜草的種子發(fā)芽抑制活性優(yōu) 異。
[0064] 表2根據(jù)DAG-A及DAG-B的濃度的碑子的發(fā)芽率
[00 化]

[0066] *相對(duì)于無處理區(qū)中的發(fā)芽率的處理區(qū)的發(fā)芽率
[0067] 表3根據(jù)DAG-A及DAG-B的濃度的馬唐的發(fā)芽率 r00681
[00例~*相對(duì)于無處理區(qū)中的發(fā)芽率的處理區(qū)的發(fā)芽率
[0070] 表4根據(jù)DAG-A及DAG-B的濃度的反枝寬的發(fā)芽率
[0071]
[0C
[0073] *相對(duì)于無處理區(qū)中的發(fā)芽率的處理區(qū)的發(fā)芽率
[0074] 表5根據(jù)DAG-A及DAG-B的濃度的一年蓬的發(fā)芽率 r00751

[0079] *相對(duì)于無處理區(qū)中的發(fā)芽率的處理區(qū)的發(fā)芽率
[0080] 實(shí)施例4:利用混合菌株的培養(yǎng)液的包干試驗(yàn)結(jié)果
[00川 4月中旬試驗(yàn)藥劑的處理后至插秩為止，由于4月17日有20mm的降雨，27-29日有 60mm的降雨，因此，維持了±壤的濕潤(rùn)狀態(tài)，由于誘灌后的5月11日有10mm W上的降雨，因 此，于13日進(jìn)行了插秩。插秩之后，對(duì)于處理區(qū)和無處理區(qū)的雜草產(chǎn)生狀態(tài)進(jìn)行了比較觀 察。拍攝插秩15日之后的樣子并表示在圖6中。如圖6中所示，左側(cè)無處理區(qū)中的雜草萌芽， 使整體田呈綠色，相反，右側(cè)處理區(qū)中的雜草產(chǎn)生顯著減少，并且田地也看起來比較干凈。 并且，在處理區(qū)中不再働草也沒有產(chǎn)生影響，并一直持續(xù)到出穗期。
[0082] [保藏號(hào)]
[0083] 保藏機(jī)構(gòu)名:韓國典型培養(yǎng)物保藏中屯、
[0084] (訝耳嫂留呈司巧干智）
[0085] 保藏號(hào):KCTC12710BP [00化]保藏日：20141113
[0087] 保藏機(jī)構(gòu)名:韓國典型培養(yǎng)物保藏中屯、
[0088] (哥馬嫂留呈馬巧干智）
[0089] 保藏號(hào):KCTC12711BP
[0090] 保藏日：20141113
[0091] 保藏機(jī)構(gòu)名:韓國典型培養(yǎng)物保藏中屯、
[OOW](哥耳搜譚呈耐哲子智）
[0093] 保藏號(hào):KCTC12712BP
[0094] 保藏日：20141113
[00M]保藏機(jī)構(gòu)名:韓國典型培養(yǎng)物保藏中屯、
[0096] (哥馬過留受馬巧干智）
[0097] 保藏號(hào):KCTC12713BP [009引保藏日：20141113
[0099] 保藏機(jī)構(gòu)名:韓國典型培養(yǎng)物保藏中屯、
[0100] (哥馬娃留云馬巧干智）
[0101] 保藏號(hào):KCTC12714BP
[0102] 保藏日：20141113
[0103] 保藏機(jī)構(gòu)名:韓國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（豈耳嫂皆吾計(jì)巧子智）
[0104] 保藏號(hào):KCTC12715BP
[0105] 保藏日：20141113
[0106] 保藏機(jī)構(gòu)名:韓國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（豈馬過留吾馬巧干管!）
[0107] 保藏號(hào):KCTC12716BP [010引保藏日：20141113
[0109] 保藏機(jī)構(gòu)名:韓國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（哥馬嫂智號(hào)司巧干智）
[0110] 保藏號(hào):KCTC12717BP
[0111] 保藏日：20141113
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌株，所述混合菌株由乳酸菌菌株和酵母菌 株組成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌株，其特征在于，所述乳 酸菌為乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)菌株。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌株，其特征在于，所述乳 桿菌屬菌株為選自植物乳桿菌亞種LPT30(Lactobacillus plantarum subsp·plantarum LPT30)菌株(KCTC 12710BP)、短乳桿菌LBV-61 (Lactobacillus brevis LBV-61)菌株(KCTC 12711BP)、布氏乳桿菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株(KCTC 12712BP)及類 干酷乳桿菌堅(jiān)初亞種LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株 (KCTC 12713BP)中的一種以上的菌株。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌株，其特征在于，所述酵 母菌株為選自庫德里阿茲威畢赤酵母PKD-51(Pichia kudriavzevii PKD-51)菌株(KCTC 12714BP)、德爾布有抱圓酵母 TDB_34(Torulaspora delbrueckii TDB-34)菌株 (KCTC12715BP)、拜耳接合酵母ZBA-22(Zygosaccharomyces bailii ZBA-22)菌株（KCTC 127161^)及雙抱接合酵母21^-52(25^〇8&(^11&1'〇1115^68 13丨8。〇1'118 21^-52)菌株（1(〇1'0 12717BP)中的一種以上的菌株。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌株，其特征在于，所述混 合菌株由短乳桿菌LBV_61(Lactobacillus brevis LBV-61)菌株(KCTC 12711BP)、植物乳 桿菌亞種LPT30(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum LPT30)菌株（KCTC 12710BP)及德爾布有孢圓酵母TDB-34(Torulaspora delbrueckii TDB-34)菌株(KCTC 12715BP)組成。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌株，其特征在于，所述混 合菌株由類干酪乳桿菌堅(jiān)韌亞種LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株(KCTC 12713BP)、布氏乳桿菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株 (KCTC 12712BP)、庫德里阿茲威畢赤酵母PKD-51 (Pichia kudriavzeviiPKD-51)菌株(KCTC 12714BP)及拜耳接合酵母ZBA-22(Zygosaccharomyces bailii ZBA-22)菌株（KCTC 12716BP)組成。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌株，其特征在于，所述混 合菌株由類干酪乳桿菌堅(jiān)韌亞種LPC63(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans LPC63)菌株(KCTC 12713BP)、布氏乳桿菌LBN62(Lactobacillus buchneri LBN62)菌株 (KCTC 12712BP)、庫德里阿茲威畢赤酵母PKD-51 (Pichia kudriavzeviiPKD-51)菌株(KCTC 127141^)及雙抱接合酵母21^-52(25^〇8&(^11&1'〇1115^68 13丨8。〇1'118 21^-52)菌株（1(〇1'0 12717BP)組成。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制雜草植物種子發(fā)芽的混合菌株，其特征在于，所述雜 草植物為禾本科雜草或闊葉雜草。9. 一種除草劑，其特征在于，所述除草劑包含權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的混合菌株、 所述菌株的培養(yǎng)物或所述菌株的培養(yǎng)液的濃縮液和農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的除草劑，其特征在于，所述除草劑進(jìn)一步包含由糖蜜和西紅 柿果汁組成的微生物營(yíng)養(yǎng)劑。11. 一種除草劑的制備方法，所述制備方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的混 合菌株的步驟。12. -種雜草的去除方法，所述方法包括用權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的混合菌株、所 述菌株的培養(yǎng)物或所述菌株的培養(yǎng)液的濃縮液對(duì)土壤進(jìn)行處理的步驟。
【文檔編號(hào)】C12N1/00GK106062173SQ201580000156
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年2月5日
【發(fā)明人】樸起雄, 廉永鎬, 趙宰澈
【申請(qǐng)人】株式會(huì)社農(nóng)藝家, 忠南大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)