無血清培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于間充質(zhì)干細(xì)胞生長的無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含F(xiàn)GF、TGF?β和脂蛋白。
【專利說明】
無血清培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種無需使用血清作為培養(yǎng)基組分的干細(xì)胞生長培養(yǎng)基、利用該培養(yǎng) 基的方法W及使用該培養(yǎng)基生產(chǎn)的細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是多潛能細(xì)胞，它可W分化成多種細(xì)胞類型，包括:成骨細(xì)胞 (骨細(xì)胞）、軟骨細(xì)胞(軟骨的細(xì)胞)和脂肪細(xì)胞(脂細(xì)胞）。運(yùn)種能力已對活體動物的特定細(xì) 胞和組織W及他們在組織培養(yǎng)中生長的相應(yīng)部分證實(shí)。
[0003] MSC是基于細(xì)胞的藥物發(fā)現(xiàn)W及對許多人類疾病的潛在治療的寶貴資源。MSC治療 包括移植物抗宿主病、多發(fā)性硬化癥、克羅恩病、1型糖尿病、骨折和骨關(guān)節(jié)炎等疾病的潛力 目前正在臨床試驗(yàn)中。
[0004] 據(jù)估計(jì)，MSC僅占骨髓單核細(xì)胞總數(shù)的0.001-0.01 % ;因此，運(yùn)類群需要廣泛的體 外細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)大W獲得足夠的數(shù)量用于基礎(chǔ)生物或臨床應(yīng)用。目前臨床應(yīng)用中使用大約1 億個(gè)細(xì)胞的劑量。
[0005] 再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞療法的目前發(fā)展表明，在未來幾年里，在細(xì)胞加工技術(shù)方面會有 一個(gè)巨大的增長。運(yùn)將設(shè)及成體和胚胎干細(xì)胞，W及用于治療目的的體細(xì)胞。此外，干細(xì)胞 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在藥物篩選應(yīng)用中使用的增加將大幅增加對細(xì)胞加工技術(shù)的需求。
[0006] 分離和培養(yǎng)運(yùn)些MSC大部分依賴于動物制品的使用，特別是胎牛血清(FBS)。
[0007] 干細(xì)胞需要特定的生長條件。目前，骨髓來源的MSC在含血清培養(yǎng)基中分離、培養(yǎng) 和分化。
[000引幾乎所有的在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中生長的哺乳動物細(xì)胞都需要在生長培養(yǎng)基中存在 FBS，它提供了細(xì)胞附著和增殖所必需的激素和生長因子。運(yùn)包括目前正在研究的用于治療 用途的人類細(xì)胞，如成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞W及其他體細(xì)胞。FBS是從肉類加工行業(yè)得到 的胎牛血中獲得的，它通常按照體積百分比濃度10%加入到生長培養(yǎng)基中。因此，干細(xì)胞的 供給依賴于讓它們生長的合適培養(yǎng)基的獲得。
[0009] 該技術(shù)已成功地應(yīng)用幾十年了，F(xiàn)BS是最常用的生長培養(yǎng)基的補(bǔ)充劑，因?yàn)樘パ?存在蛋白質(zhì)的復(fù)合混合物W及高水平的生長刺激因子。然而，在使用FBS時(shí)也存在相關(guān)問 題，其中一些如下：
[0010] 1.疾病傳播到細(xì)胞療法接受者的風(fēng)險(xiǎn)；
[0011] 2.疾病傳播到加工技術(shù)人員和醫(yī)務(wù)人員的風(fēng)險(xiǎn)；
[001 ^ 3.產(chǎn)品的不確定性和季節(jié)性供應(yīng)；
[0013] 4.需要在-20°C下冷凍保存；
[0014] 5.批次與批次之間的顯著變化；
[001引6.因需求增加，預(yù)期主要供應(yīng)鏈的問題。
[0016] FBS在用于人類治療的細(xì)胞生產(chǎn)中使用，主要相關(guān)問題是傳染性物質(zhì)傳播到接受 者的風(fēng)險(xiǎn)。此外，還有一個(gè)相當(dāng)大的風(fēng)險(xiǎn)，與處理運(yùn)些材料的加工技術(shù)人員和醫(yī)務(wù)人員相 關(guān)。運(yùn)種風(fēng)險(xiǎn)在最近幾年變得非常嚴(yán)重，因?yàn)閭魅拘耘：＞d狀腦病(BSE)俗稱瘋牛病的出 現(xiàn)，W及人類獲得變異型克雅氏病(vCJD)的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。迄今為止，BSE已在歐洲、北美和世界 其他許多地方的牛中被檢測到。幾乎所有現(xiàn)在批準(zhǔn)用于人類治療的細(xì)胞生長中的FBS，都來 自澳大利亞和新西蘭，運(yùn)些地方仍然是沒有B沈的。
[0017] BSE在世界各地的牛群中的出現(xiàn)，也導(dǎo)致重大的供應(yīng)問題，預(yù)計(jì)會對未來的細(xì)胞療 法可用性造成嚴(yán)重影響。目前，運(yùn)種有限供應(yīng)的血清一般是足夠?qū)嶒?yàn)室和研究使用的。然 而，運(yùn)些實(shí)驗(yàn)室和研究用途中的某些是針對生產(chǎn)將要進(jìn)行中型或大型規(guī)模生產(chǎn)的商業(yè)產(chǎn) 品。目前沒有批準(zhǔn)用于一般性使用的干細(xì)胞技術(shù)申請。因此，可W設(shè)想，當(dāng)一個(gè)干細(xì)胞技術(shù) 被釋放為一般性使用時(shí)，血清的供應(yīng)將根本不能滿足運(yùn)種需求。
[0018] 事實(shí)上，可W預(yù)見的是，當(dāng)細(xì)胞治療產(chǎn)品被批準(zhǔn)僅僅用于兩個(gè)主要的適應(yīng)癥時(shí)，整 個(gè)全球被批準(zhǔn)的供應(yīng)，即沒有BSE的FBS，將會在制造的一年內(nèi)消耗完。因此，當(dāng)細(xì)胞療法獲 得監(jiān)管部口的批準(zhǔn)和使用時(shí)，將會出現(xiàn)顯著而前所未有的對于無 FBS的生長培養(yǎng)基的需求。 顯然，干細(xì)胞生長培養(yǎng)基的供應(yīng)將會成為干細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用的限制因素。
[0019] 此外，F(xiàn)BS是一種異質(zhì)混合物，運(yùn)導(dǎo)致血清批次之間缺乏再現(xiàn)性與性能。血清中包 含許多不明或非量化的組分，因此不能被"定義"，也不能被再合成制造。因此，批次與批次 之間變化的血清組合物，用于實(shí)驗(yàn)或其他用途的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，使得標(biāo)準(zhǔn)化困難。同時(shí)，MSC是 貼壁細(xì)胞群，目前運(yùn)種附著到組織培養(yǎng)塑料上的能力大部分依賴于FBS。
[0020] 事實(shí)上，由于FBS中的很多組分影響細(xì)胞附著、增殖和分化，控制運(yùn)些參數(shù)，或相對 于運(yùn)些參數(shù)研究細(xì)胞具體要求，可W排除血清的使用。此外，血清的某些組分會抑制特定細(xì) 胞類型的增殖，并在一定程度上可能抵消其增殖作用，導(dǎo)致次優(yōu)的生長。
[0021] 運(yùn)種FBS的異質(zhì)性引起生長特性的變化導(dǎo)致血清批次間缺乏重現(xiàn)性，導(dǎo)致基于細(xì) 胞的產(chǎn)品和治療面臨制造和增長的問題。在良好制造協(xié)議(GMP)下制造的產(chǎn)品尤其如此，它 是W使用一致的(并因此是可靠的)初始材料為先決條件。
[0022] 此外，從治療和管理的角度來看，F(xiàn)BS的存在是不理想的，因?yàn)檫\(yùn)可能導(dǎo)致動物病 原體的轉(zhuǎn)移。雖然血清被批準(zhǔn)用于醫(yī)療用途，它可能含有影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的病毒，或當(dāng)培養(yǎng)的 細(xì)胞意圖用于植入人體時(shí)提供一個(gè)潛在的健康危害。此外，從監(jiān)管的角度來看，在臨床設(shè)置 中使用的動物源性產(chǎn)品是不可取的，不僅是因?yàn)橛袀魅拘圆≡w傳播的的風(fēng)險(xiǎn)，而且還有 引起免疫應(yīng)答的潛在性。
[0023] 因此，為繁殖和/或產(chǎn)生干細(xì)胞，存在對無需添加血清的生長培養(yǎng)基的需求。任何 運(yùn)種新的生長培養(yǎng)基，最好是相對簡單，而且易于大量生產(chǎn)。
[0024] 因此，人們已經(jīng)做出努力，W消除培養(yǎng)基中的FBS，和開發(fā)一種能夠在活體外（ex vivo)擴(kuò)增MSC的明確的無血清培養(yǎng)基。
[0025] W02011/111787公開了一種細(xì)胞制劑，其包含能維持免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì) 胞，由無血清或低血清培養(yǎng)基生產(chǎn)得到。其描述了一種包含間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制劑的制 備方法，包括:一增殖步驟，其中間充質(zhì)干細(xì)胞在包含。6。、？〇6。^6。-0、服。、66。、至少一種 憐脂和至少一種脂肪酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖;和一篩選步驟，其中，增殖步驟后的間充質(zhì)干 細(xì)胞經(jīng)篩選，得到維持或改善免疫抑制能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[00%] W098/104681公開了一種明確的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，它包含補(bǔ)充混合物、組分混合 物、維生素混合物、無機(jī)鹽混合物和氨基酸混合物。運(yùn)種明確的培養(yǎng)基被公開用于培養(yǎng)成纖 維細(xì)胞，尤其是軟骨細(xì)胞。該發(fā)明還公開了一種使用腫瘤生長因子e(TGF-e)增強(qiáng)軟骨細(xì)胞 的分化W及提高軟骨特異性基質(zhì)的合成的方法，W及使用TGF-0和膜島素樣生長因子(IGF) 的組合來增強(qiáng)軟骨細(xì)胞分化的方法。
[0027] 對于MSC的其他培養(yǎng)基也曾被提出。W0 2005/113751公開了MSC在無血清培養(yǎng)基中 的擴(kuò)增；運(yùn)種培養(yǎng)基是非常復(fù)雜的，除其它組分外，有些可W包含bFGF和TGF-e"US2010/ 0279412也公開了一種無血清培養(yǎng)基，其可包含。6。、了6。、66。、憐脂酸、憐脂酷膽堿和維生素 CoQiase et al ,Stem Cell Research&Therapy 2010,1:8公開了一種用于人類MSC的無血 清培養(yǎng)基，它包含bFGF、TGF-化和PDGF。
[0028] 本發(fā)明的目在于提供一種用于干細(xì)胞生長的培養(yǎng)基及方法，其作為上述的至少一 個(gè)替代，并優(yōu)選解決或至少改善一個(gè)或多個(gè)現(xiàn)有技術(shù)確認(rèn)的問題。特定的實(shí)施例的目的在 于提供一種用于MSC生長的培養(yǎng)基，無需補(bǔ)充血清，因此容易獲得而且相對便宜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0029] 因此，本發(fā)明提供了用于一種用于培養(yǎng)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括：
[0030] (a)成纖維細(xì)胞生長因子(FGF);
[0031] (b)轉(zhuǎn)化生長因子e(TGF-e);和
[0032] (C)脂蛋白。
[0033] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它能生產(chǎn)一種完全沒有FBS的培養(yǎng)基，即無血清生長培養(yǎng) 基，其適合干細(xì)胞的增殖和組織培養(yǎng)，尤其是間充質(zhì)細(xì)胞，尤其是人類細(xì)胞和組織。
[0034] 此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基適合于直接增殖從骨髓中分離的細(xì)胞，即，運(yùn)些分離的細(xì)胞 可W直接放置在本發(fā)明的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，不需要首先在含有血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行解育 或增殖。
[0035] 本發(fā)明培養(yǎng)基的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，細(xì)胞在在缺氧條件下培養(yǎng)可顯示優(yōu)越的生長動 力學(xué)。
[0036] 使用本發(fā)明培養(yǎng)基去生產(chǎn)細(xì)胞的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)在于:與現(xiàn)有技術(shù)中基于血清的培 養(yǎng)基相比，本發(fā)明培養(yǎng)基的使用可增加細(xì)胞的產(chǎn)量。與W前使用的條件下相比，本發(fā)明的培 養(yǎng)基能使制造商獲得高得多的產(chǎn)量的細(xì)胞(至少十倍W上）。因此，每劑量的生產(chǎn)成本降低 了約90%。因此，除了增強(qiáng)本發(fā)明培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長特性，該培養(yǎng)基還有望提高從事生產(chǎn) 臨床試驗(yàn)和用途的基于MSC的產(chǎn)品的臨床制造企業(yè)的競爭力。目前，在符合GMP的條件下，臨 床使用所需的大量MSC的生產(chǎn)成本，是企業(yè)發(fā)展再生醫(yī)學(xué)療法的主要問題之一。
[0037] 此外，運(yùn)種確定的培養(yǎng)基可W完全在符合GMP的標(biāo)準(zhǔn)下大規(guī)模生產(chǎn)，適用于人類細(xì) 胞生長的使用。因而本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基，在體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究過程中，允許較大的重 現(xiàn)性。
[0038] 因此，本發(fā)明培養(yǎng)基的一些進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)在于：
[0039] -制造商不再受FBS供應(yīng)不確定性的制約；
[0040] -疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)去除，因?yàn)樗性牧峡蓙碓从贕MP供應(yīng)商；
[0041] -克服了基于血清的生長培養(yǎng)基出現(xiàn)的批次間不同的問題;此外，由于無血清培養(yǎng) 基具有確定的組成，無需制造商或研究者進(jìn)行血清"批次試驗(yàn)"。
[0042] 無血清培養(yǎng)基的使用因此為細(xì)胞療法從實(shí)驗(yàn)到臨床使用的監(jiān)管提供了重要的保 障。當(dāng)單一的臨床劑量的生產(chǎn)成本昂貴得讓人望而卻步是因?yàn)槊看紊a(chǎn)的細(xì)胞產(chǎn)量可憐的 時(shí)候，無血清培養(yǎng)基也大大降低了大規(guī)模生產(chǎn)MSC的成本，特別是GMP條件下培養(yǎng)的細(xì)胞用 于治療用途。
[0043] 該培養(yǎng)基還可包含表皮生長因子化GF)，合適濃度為Ing/ml到lOOng/ml，優(yōu)選為 2ng/ml到50ng/ml，或化g/ml到25ng/ml;在一個(gè)具體的例子中，EGF在培養(yǎng)基中的濃度為大 約lOng/ml。該培養(yǎng)基還可包含纖連蛋白，濃度合適地為化g/na到lOOiig/ml，優(yōu)選為化g/ml 到2化g/ml。
[0044] 在本發(fā)明的培養(yǎng)基中包含EGF和纖連蛋白的優(yōu)點(diǎn)在于，使用時(shí)，直接取自骨髓的樣 本在運(yùn)樣的培養(yǎng)基產(chǎn)生每集落形成單位(CFU)最多的細(xì)胞。
[0045] 脂蛋白是復(fù)合顆粒，它在體內(nèi)運(yùn)輸膽固醇、憐脂和甘油=醋。脂蛋白包括，從最大 到最?。ㄗ畈幻芗阶蠲芗?，乳糜微粒(ULDL)、極低密度脂蛋白（VLDL)、中間密度脂蛋白 (IDL)、低密度脂蛋白化DL)和高密度脂蛋白化DL)。運(yùn)些都是本領(lǐng)域中公認(rèn)的和理解的術(shù) 語，在文獻(xiàn)中廣泛使用，無需進(jìn)一步定義。
[0046] 低密度脂蛋白化DL)此后設(shè)及的是一類有大小不等范圍的脂蛋白顆粒，其直徑從 約15nm或約18nm到約30nm，或到約25nm(基于激光的方法可用于此測量）。LDL顆粒通常包含 一單一的載脂蛋白B-100分子(Apo B-100)，和非常接近80至100個(gè)額外的輔助蛋白。每個(gè) LDL通常具有高度疏水的核屯、，該核屯、由被稱為亞油酸的多不飽和脂肪酸和數(shù)百至數(shù)千(約 1500通常被作為一個(gè)平均水平）的醋化和非醋化膽固醇分子組成。運(yùn)個(gè)核屯、也可W攜帶不 同數(shù)量的甘油S醋和其他脂肪，被憐脂和未醋化的膽固醇的外殼W及單拷貝的載脂蛋白B- 100包圍。一些特定的LDL顆粒直徑為約22nm，質(zhì)量約300萬道爾頓，雖然通常術(shù)語LDL是行業(yè) 公知的，包括落入上述明確的參數(shù)內(nèi)的顆粒。在典型的人體內(nèi)，由于LDL顆粒含有可變的和 不斷變化數(shù)量的脂肪酸分子，所W有一個(gè)LDL顆粒的質(zhì)量和大小的分布。
[0047] 極低密度脂蛋白（VLDL) -般含有Apo 6-100、4口〇(：1、4口〇6、膽固醇，膽固醇醋和甘 油S醋。當(dāng)它在血液中循環(huán)時(shí)，VLDL可接收其它組分，運(yùn)和其他的變化可及時(shí)將化化轉(zhuǎn)換到 其他脂蛋白形式。再次，術(shù)語化化為行業(yè)所公知，通?；w粒的直徑從約30nm到約80nm。 在體內(nèi)，VLDL往往運(yùn)輸內(nèi)源性產(chǎn)物，相反，乳糜微粒往往運(yùn)輸外源性產(chǎn)物。
[004引中間密度脂蛋白（I化)顆粒往往包含除了單一拷貝的Apo B-100外，還包含多個(gè)拷 貝的受體配體ApoE，直徑一般約25皿至35皿。最后，高密度脂蛋白化化)顆粒具有最高的密 度和最小的尺寸，直徑一般是從約7nm或8nm到約11 nm或12nm。
[0049] 該培養(yǎng)基可W包括一種或多種或所有W下脂蛋白：
[0050] 高密度脂蛋白化DL);
[0051] 低密度脂蛋白（LDL);
[0052] 中間密度脂蛋白（1化）；
[0053] 極低密度脂蛋白（VLDL);和 [0化4]乳糜微粒。
[0055] 本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，培養(yǎng)基包括LDL或化化。在使用下面的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì) 描述時(shí)，包含LDL的培養(yǎng)基和包含VLDL的培養(yǎng)基使得細(xì)胞更好地生長，并促進(jìn)具有所需形態(tài) 的細(xì)胞生長。
[0056] 優(yōu)選地，培養(yǎng)基包括LDL，其可W包括W下的一個(gè)或多個(gè)：
[0化7] 大而輕LDLab LDL)顆粒，
[005引小而密LDL(sd LDL)顆粒，和/或
[0059] 脂蛋白（a)(Lp(a))。
[0060] 據(jù)認(rèn)為，脂蛋白是必不可少的，因?yàn)樗峁┠懝檀己蛻z脂，運(yùn)些物質(zhì)不能容易地通 過任何其他方法提供。脂蛋白的適合水平為化g/ml或W上、化g/ml或W上、扣g/ml或W上， 并分別可高達(dá)l〇〇μg/ml、80μg/ml或60μg/ml。具體實(shí)施例中，濃度為約化g/m巧日約40μg/ml。
[0061] 在下面給出的更詳細(xì)的實(shí)施例中，數(shù)目增加的成纖維細(xì)胞集落形成單位-(CFU-f) 是在包含VLDL或LDL的培養(yǎng)基中獲得的。當(dāng)化化或LDL存在時(shí)，包括該CFU-f的細(xì)胞本身的形 態(tài)也得到了改善。當(dāng)培養(yǎng)基中含有HDL時(shí)，C即-f包括密集的細(xì)胞簇，其中發(fā)生了一些分枝 (outgrowth)。當(dāng)在包含胎牛血清的培養(yǎng)基中分離時(shí)，運(yùn)對觀察到的CFU-f是非典型的。相 反，使用包含化化或LDL的培養(yǎng)基獲得的CRJ-f具有分散的形態(tài)，其更加類似于與MSC相關(guān)的 典型CFU-f形態(tài)。
[0062] 此外，下面本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施例更詳細(xì)的描述中，我們評估是否：1)在無血清培 養(yǎng)基中加入纖連蛋白排除了預(yù)包被附著因子的需要，和2)或用無血清培養(yǎng)基配方從骨髓中 分離和增殖MSC，是否必需纖連蛋白。本發(fā)明的培養(yǎng)基存在或缺乏纖連蛋白時(shí)，無論是CRJ-f 數(shù)量還是后續(xù)增殖率，培養(yǎng)的MSC沒有觀察到可見差異。運(yùn)表明，對于(如從骨髓)分離或增 殖MSC，無血清培養(yǎng)基配方無需附著因子。
[0063] 培養(yǎng)基的FGF組分可W包括W下的一種或多種：FGFl，F(xiàn)GF2(bFGF)，F(xiàn)GF3，F(xiàn)GF4， FGF5，F(xiàn)GF6，F(xiàn)GF7，F(xiàn)GF8，F(xiàn)GF9，F(xiàn)GF10，F(xiàn)GF11，GF12，F(xiàn)GF13，F(xiàn)GF14，F(xiàn)GF15，F(xiàn)GF16，F(xiàn)GF17， 尸6尸18，尸6尸19，尸6尸20，尸6尸21，尸6尸22和尸6尸23;優(yōu)選的是尸6尸1，尸6尸2(6尸6尸），尸6尸3，尸6尸4，尸6尸5， FGF6，F(xiàn)GF7，F(xiàn)GF8，F(xiàn)GF9和FGF10中的一種或多種;更優(yōu)選的是，培養(yǎng)基包含F(xiàn)GF2 (bFGF)。優(yōu)選 地，F(xiàn)GF存在的濃度是0.5ng/ml或W上，Ing/ml或W上，高達(dá)50ng/ml，高達(dá)30ng/ml，高達(dá) 20ng/ml，或高達(dá)lOng/ml，或運(yùn)些范圍的任意組合。濃度從Ing/ml到20ng/ml是特別合適的。 在具體的實(shí)施例中，約5ng/ml的濃度被成功使用。培養(yǎng)基的TG邱組分可W包括TG邱-1，TGF 0-2和TG邱-3中的一種或多種，優(yōu)選的是TG邱-1。優(yōu)選的，TG邱存在的濃度是0.5ng/ml或W 上，Ing/ml或W上，高達(dá)50ng/ml，高達(dá)30ng/ml，高達(dá)20ng/ml，高達(dá)lOng/ml，或運(yùn)些范圍的 任意組合。濃度從Ing/ml到20ng/ml是特別合適的。在具體實(shí)例中，約5ng/ml的濃度被成功 使用。
[0064] 無血清培養(yǎng)基也可W包含或是基于一基礎(chǔ)培養(yǎng)基(也是無血清），旨在提供必需的 礦物質(zhì)、鹽和維生素。基礎(chǔ)培養(yǎng)基在本行業(yè)領(lǐng)域是公知的，一種運(yùn)樣的培養(yǎng)基是最低必需 Eagle-a-修飾培養(yǎng)基（MEM-a)。其它此類基礎(chǔ)培養(yǎng)基可從STEMCE化技術(shù)公司（STEMC化L Technologies SAI?L,France)和StemCelIs有限公司（StemCelIs , Inc,USA)，W及其他的本 行業(yè)技術(shù)所熟知的公司獲得，適用于本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基。
[0065] 所述培養(yǎng)基還可W適當(dāng)?shù)匕渌M分如地塞米松、人血清白蛋白和/或膜島素- 轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸（ITS)。一種具體的培養(yǎng)基在MEM-a中包含1 % 口S，1 OnM的地塞米松，50mg/ml的 人血清白蛋白。該培養(yǎng)基可W基于或包含其它基礎(chǔ)培養(yǎng)基。此外，培養(yǎng)基可W不包含其他生 長因子或包含進(jìn)一步的生長因子。
[0066] 除了本文其它地方描述的用途，該培養(yǎng)基還可W用于從供體(特別是人類供體)分 離細(xì)胞。所述培養(yǎng)基還可W用于將在含有血清的條件下分離或生長的細(xì)胞轉(zhuǎn)換到無血清條 件下。因此，例如，細(xì)胞(如人細(xì)胞)可w使用任何培養(yǎng)基或條件進(jìn)行分離，然后按照包括在 本發(fā)明培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)細(xì)胞的步驟，轉(zhuǎn)換為在無血清條件下生長。
[0067] 本發(fā)明還提供了一種在本發(fā)明培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，該方法包括在該培養(yǎng) 基中解育干細(xì)胞。使用該方法培養(yǎng)的細(xì)胞可W是一種或多種間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。有利的是， 本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長的MSC保留了成骨、成軟骨、成脂肪和/或血管生成的潛力。在本發(fā)明 的培養(yǎng)基存在和/或培養(yǎng)在其中的細(xì)胞，特別是MSC，可具有有利的免疫抑制性質(zhì)。
[0068] 因此，本發(fā)明還提供了在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞是間充質(zhì) 干細(xì)胞，更優(yōu)選細(xì)胞是成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞和/或血管生成細(xì)胞。
[0069] 同樣，本發(fā)明還提供了一群上述定義的成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞和/或血 管生成細(xì)胞。
[0070] 本發(fā)明還提供一種本發(fā)明培養(yǎng)基中的干細(xì)胞，例如用作藥物。本發(fā)明還提供了一 種本發(fā)明培養(yǎng)基中的干細(xì)胞，用于篩選應(yīng)用，例如藥物篩選。
[0071] 提供本發(fā)明培養(yǎng)基中的干細(xì)胞用于藥物的一個(gè)好處是，從干細(xì)胞的初始分離到植 入從分離的干細(xì)胞培養(yǎng)的干細(xì)胞，需要單一的生長培養(yǎng)基。換言之，分離或植入步驟無需分 開的培養(yǎng)基。運(yùn)大大簡化了生產(chǎn)和使用干細(xì)胞或干細(xì)胞系的過程。此外，采用單一的全目的 無血清培養(yǎng)基代替多種通常是基于血清的培養(yǎng)基，運(yùn)樣減少了運(yùn)些培養(yǎng)基帶來的感染風(fēng) 險(xiǎn)。
[0072] 優(yōu)選的，本發(fā)明的培養(yǎng)基中的干細(xì)胞用于形成下列組織中的一種或多種：
[0073] (a)骨組織；
[0074] (b)血管組織；
[00巧](C)軟骨組織;和/或
[0076] (d)脂肪組織。
[0077] 有利的是，無血清培養(yǎng)的MSC在體內(nèi)向骨組織的分化優(yōu)于對照實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)在含血 清培養(yǎng)基中的MSC。
[0078] 本發(fā)明現(xiàn)在參考W下具體實(shí)施例和隨附的附圖進(jìn)行說明，其中：
[0079] 圖1顯示了在10%FBS中分離的MSC在有bFGF存在的無血清條件下重附著，在涂布 (plating)lS小時(shí)后的相對附著程度。組織培養(yǎng)瓶預(yù)包被有纖連蛋白（FN;黑色）、透明質(zhì)酸 化A;藍(lán)色）、玻連蛋白（VN;紅色）或?qū)诱尺B蛋白（LN;綠色），使細(xì)胞在無血清條件下附著。對 照包括無細(xì)胞外基質(zhì)化CM)附著因子存在下的無血清涂布和10%FBS(灰色）。結(jié)果代表3個(gè) 生物學(xué)重復(fù)，n = 2;
[0080] 圖2顯示了在10%FBS中分離并在有bFGF存在的無血清條件下重附著的MSC相對于 無血清條件下的生長。組織培養(yǎng)瓶中預(yù)包被有FN(黑色）、HA(藍(lán)色）、VN(紅色）或LN(綠），使 細(xì)胞在無血清條件下附著。5天后獲取細(xì)胞數(shù)。對照包括無 ECM附著因子存在下的無血清涂 布和10%FBS(灰色）。結(jié)果代表了 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，n = 2;
[0081] 圖3顯示了在10%FBS中分離的MSC，在含F(xiàn)GF2的無血清條件下重附著，在3代(P)過 程中的附著程度。將MSC附著在有EGF(紅色）的存在下的組織培養(yǎng)瓶上，或預(yù)包被有FN(紫 色）的組織培養(yǎng)塑料制品上，或有EGF存在下的纖連蛋白包被的塑料上(綠色）并每3天進(jìn)行 傳代。對照包括不存在ECM附著因子的無血清涂布(藍(lán)色)和10%FBS(黑色）。結(jié)果代表3個(gè)生 物學(xué)重復(fù)，n = 2;
[0082] 圖4顯示了在10%FBS中分離的MSC，在無血清條件下，重附著在預(yù)包被有的組織 培養(yǎng)瓶2天的生長。然后將細(xì)胞在有生長因子的存在下進(jìn)行培養(yǎng)，每5天進(jìn)行傳代。對照包括 無生長因子的無血清涂布和10%FBS。結(jié)果代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，n = 2;
[0083] 圖5顯示了在10%FBS中分離的MSC，在無血清條件下，重附著在預(yù)包被FN的組織培 養(yǎng)瓶中2天的生長。細(xì)胞隨后在存在有PGE2、膽固醇或脂蛋白的包含F(xiàn)GF2巧ng/ml)的無血清 培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。對照包括無生長因子存在下的無血清涂布和10%FBS(A)。然后將細(xì)胞在 脂蛋白的存在下培養(yǎng)，每5天進(jìn)行傳代，傳代3次，對照包括無脂蛋白存在下的無血清涂布 (B)。結(jié)果代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，n = 2;
[0084] 圖6顯示了實(shí)施例的結(jié)果，其中，在含F(xiàn)GF2的無血清(SF)培養(yǎng)基中，MSC從骨髓分離 到預(yù)包被有纖連蛋白（FN)、玻連蛋白（VN)或透明質(zhì)酸化A)的塑料制品上，，W確定無血清 MSC分離的合適的細(xì)胞外基質(zhì)。集落形成單位(CFU;圖6A)的數(shù)量W及細(xì)胞數(shù)量（圖6B)是在 原代培養(yǎng)結(jié)束時(shí)確定的。接種另一骨髓在預(yù)先包被有不同濃度纖連蛋白的組織培養(yǎng)塑料制 品上，W確定所需纖連蛋白的最佳濃度。C即的數(shù)量（圖6C)和細(xì)胞產(chǎn)量（圖6D)是在原代培養(yǎng) 結(jié)束時(shí)確定的。對照包括10%FBS的存在下或沒有包被的組織培養(yǎng)塑料制品上的MSC分離；
[0085] 圖7顯示了實(shí)施例的結(jié)果，其中，MSC從骨髓分離到預(yù)包被有纖連蛋白的組織培養(yǎng) 塑料制品上和/或有EGF存在下的組織培養(yǎng)塑料制品上。集落形成單位的數(shù)量（圖7A)和細(xì)胞 的數(shù)量（圖7B)在原代培養(yǎng)結(jié)束時(shí)確定。對照包括在10 %FBS存在下或在沒有包被的組織培 養(yǎng)塑料制品上的MSC分離；
[0086] 圖8顯示了實(shí)施例的結(jié)果，其中，在無血清培養(yǎng)基中，MSC被分離在預(yù)包被有纖連蛋 白（6ug/ml)的組織培養(yǎng)塑料制品上，所述無血清培養(yǎng)基包含的生長因子如表1給出。每一代 結(jié)束時(shí)細(xì)胞用膜蛋白酶消化，并接種于包被有纖連蛋白的塑料制品上；對照細(xì)胞接種于 10 % FBS中的組織培養(yǎng)塑料制品上；
[0087] 圖9顯示了實(shí)施例的結(jié)果，其中，在無血清培養(yǎng)基中，MSC被分離到預(yù)包被有纖連蛋 白（6ug/ml)的組織培養(yǎng)塑料制品上，所述無血清培養(yǎng)基包含的生長因子如表3給出。每一代 結(jié)束時(shí)細(xì)胞用膜蛋白酶消化，并接種于包被有纖連蛋白的塑料制品上；對照細(xì)胞接種于 10 % FBS中的組織培養(yǎng)塑料制品上；
[008引圖10顯示了實(shí)施例的結(jié)果，其中，在無血清培養(yǎng)基中，分離的MSC在第3、6、9代結(jié)束 時(shí)的表面特性，所述無血清培養(yǎng)基使用表3給出的條件7和8。在10%FBS中培養(yǎng)的MSC被用作 對照；
[0089] 圖11顯示了實(shí)施例的結(jié)果，其中，在第3代開始時(shí)，在無血清培養(yǎng)基中，分離的MSC 的分化特征。對照為在10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MSCdMSC經(jīng)歷形成脂肪細(xì)胞的能力由油紅0 陽性液泡(a)來確定，茜素紅染色W及陽性巧試驗(yàn)確定MSC經(jīng)歷成骨作用的能力化），成軟骨 作用的能力是由甲苯胺藍(lán)染色和GAG蛋白定量確定(C);結(jié)果代表4個(gè)生物學(xué)重復(fù)；
[0090] 圖12顯示了，在第7代開始時(shí)，在無血清培養(yǎng)基中，分離的MSC的分化特征。對照為 在10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MSCdMSC經(jīng)歷形成脂肪細(xì)胞的能力由油紅0陽性液泡來確定(曰）， 茜素紅染色W及陽性巧試驗(yàn)確定MSC經(jīng)歷成骨作用的能力（b)，成軟骨作用由GAG蛋白的定 量確定(C);結(jié)果代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；
[0091] 圖13顯示了，在第3代開始時(shí)，在無血清培養(yǎng)基中，分離的MSC的血管生成分化特 征。對照為在10 % FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MSC;將MSC與人廝靜脈內(nèi)皮細(xì)胞化UVEC)共培養(yǎng)，并量 化所形成的小管的數(shù)量；結(jié)果表示為一百分比，其中單獨(dú)的HUVEC形成的小管數(shù)設(shè)置為 100 %。結(jié)果代表4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，n = 4;
[0092] 圖14顯示了在無血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)的MSC向骨組織的體內(nèi)分化；
[0093] 圖15顯示了在無血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)的MSC向骨組織的體內(nèi)分化；
[0094] 圖16顯示了在缺氧和常氧條件下，使用無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)的MSC 的生長動力學(xué)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)。圖16A顯示了MSC的生長動力學(xué)；圖16B顯示了所培養(yǎng)的MSC的 細(xì)胞形態(tài);圖16C顯示了來自4個(gè)不同的骨髓樣本的細(xì)胞預(yù)測產(chǎn)量；
[00M]圖17顯示了在缺氧和常氧的條件下，無血清培養(yǎng)基相對于含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)的 MSC的成骨分化。培養(yǎng)11天。平均值± SD，n = 4供體。比例尺:500um。**: P《0.05;
[0096] 圖18顯示了，在缺氧和常氧的條件下，無血清培養(yǎng)基相對于含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng) 的MSC的成脂分化。平均值± SD，n = 4供體，比例尺:500um，*: P《0.5;
[0097] 圖19顯示了在缺氧和常氧的條件下，無血清培養(yǎng)基相對于含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng) 的MSC的成軟骨分化。培養(yǎng)18天。平均值± SD，比例尺:500皿，n = 3供體；
[0098] 圖20顯示了在缺氧和常氧的條件下，無血清培養(yǎng)基相對于含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)的 MSC的促血管生成的能力。平均值+ SD，比例尺:200皿，n = 4供體；
[0099] 圖21顯示了在缺氧和常氧的條件下，無血清培養(yǎng)基相對于含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng) 的MSC的免疫原性程度。平均值± SD。n = 3MSC供體VS1MLR供體。統(tǒng)計(jì):t檢驗(yàn);*沖<0.05; W及
[0100] 圖22顯示了在缺氧和常氧的條件下，無血清培養(yǎng)基相對于含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng) 的MSC的表面細(xì)胞標(biāo)志物表型。平均值± SD，n = 3供體(P3)。
【具體實(shí)施方式】
[0101] 實(shí)施例1
[0102] 圖1顯示了一個(gè)初步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中，4種附著因子支持在10%血清存在下分離 的MSC在無血清環(huán)境中附著的能力在18h后檢查；所述因子為：透明質(zhì)酸（HA)、纖連蛋白 (FN)、玻連蛋白（VN)、層粘連蛋白化N)和表皮生長因子化GF)。在堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (bFGF2，F(xiàn)GF2)存在下附著的MSC的增殖在6天后也進(jìn)行評估。結(jié)果表明，在無血清環(huán)境下1她 后，玻連蛋白（〇.5μg/ml)支持MSC附著最佳（圖1);然而，6天后，纖連蛋白（6μg/ml)顯示出類 似玻連蛋白（0.5iig/ml)的MSC產(chǎn)量（圖2) dEGF(1 Ong/ml)也在傳代過程后增加 MSC的附著（圖 3)。
[0103] 無血清培養(yǎng)基配方是基于描述培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞的低血清細(xì)胞培養(yǎng)的文獻(xiàn)(Tarle et al. ,2010)選定的?；九囵B(yǎng)基由W下組成：ITS(1%，BD)、抗壞血酸（10mM，Sigma A1化ich)、地塞米松（10nM，Sigma A1化ich)、人血清白蛋白（50mg/ml，Sigma A1化ich)、青 霉素/鏈霉素溶液（l%，Gibco)和MEM-a(G化CO)。接著檢驗(yàn)一系列的生長因子對MSC增殖的 影響。在無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，MSC被附著在包被有纖連蛋白的組織培養(yǎng)塑料制品上4她。
[0104] 抗壞血酸是維生素 C源。MEM-a是最低必需培養(yǎng)基配方和緩沖液；其也提供，特別 是，氨基酸，并且是一養(yǎng)分。地塞米松是類固醇和雌激素樣因子，服A是蛋白源，W及口S提供 膜島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白（鐵源)和砸酸。
[01化]基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成如下：
[0106]
[0107] 傳代3次后，在第5、10和15天檢測。6。2/。6。巧郵6。7(1、5和1〇11旨/1111)、？06。曰曰/ PDGFab和PDG即b(1、5和lOng/ml)對MSC的增殖的影響。圖4顯示了FGF2(5ng/ml)、FGF4(5ng/ ml)和PDG化b (1 Ong/ml)在無血清培養(yǎng)基中如何提高M(jìn)SC的增殖。
[0108] 為了進(jìn)一步提高M(jìn)SC的活力和增殖，在無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入脂蛋白。在血清存 在下分離的MSC，在含F(xiàn)GF2的無血清培養(yǎng)基中，接種于涂有纖連蛋白的組織培養(yǎng)塑料制品 上。起初，篩選一系列因子W支持膜蛋白酶消化后的MSC活力;檢測前列腺素 E2 (PGE2; 50ug/ ml)、膽固醇（30ug/ml)和脂蛋白（4ug/ml)對MSC在含F(xiàn)GF2 (5ng/ml)的無血清培養(yǎng)基中的增 殖的影響。低密度脂蛋白（40ug/ml ;Sigma-Al化ich)顯示出提高M(jìn)SC增殖的作用，而PGE2和 膽固醇具有抑制作用（圖5a)。在傳代3次后，脂蛋白提高在含有FGF2的無血清培養(yǎng)基中的 MSC增殖(圖化），并因此被加入到無血清培養(yǎng)基配方中。
[0109] 起初，從巧中骨髓分離MSC來確定合適的附著基質(zhì)。玻連蛋白、透明質(zhì)酸和纖連蛋白 被篩選;在第1代結(jié)束時(shí)，纖連蛋白產(chǎn)生較多的集落形成單位（圖6A)和最多的細(xì)胞數(shù)量（圖 6B)。接著，進(jìn)一步的骨髓供體被篩選，W確定最佳纖連蛋白濃度;6ug/ml被選定為最適濃度 (圖6C和抓）。
[0110] 為檢測EGF在MSC分離和附著中的作用，5個(gè)骨髓被測試。在有FGF2(5ng/ml)存在 下，MSC被分離在有EGF存在的包被有纖連蛋白的塑料制品上，或在有EGF存在的組織塑料制 品上。結(jié)果表明，在骨髓供體之間存在變化，然而，得出的結(jié)論是，在此特定情況下，MSC的附 著需要纖連蛋白（圖7A和7B)。
[0111] 為評估生長因子對MSC的增殖的影響，將4個(gè)骨髓樣本接種于如表1所示的無血清 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包被有纖連蛋白的組織培養(yǎng)塑料制品上。
[0112] 表1.添加到無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長因子
[0113]

[0114] 第1次傳代后，MSC產(chǎn)量在不同條件問顯示無差異;但是，第3代W后，條件1-6下累 積群體倍增數(shù)廣泛地下降。在所有條件中，條件7、8和9顯示出平穩(wěn)地增長（圖8,骨髓1、2和 3)。運(yùn)些培養(yǎng)下的細(xì)胞產(chǎn)量見表2(注意，因此，表2中的培養(yǎng)基1和2分別對應(yīng)表1中的培養(yǎng)基 巧口8)。
[0115] 表2.圖8實(shí)驗(yàn)中預(yù)測的每ml細(xì)胞產(chǎn)量
[0116]
[0117] 此外，無血清培養(yǎng)基顯示出在促進(jìn)來自5個(gè)供體的MSC的分離和增殖方面優(yōu)于FBS， 生長維持到第10代。此外，與生長在FBS中的培養(yǎng)物比較，在無血清培養(yǎng)基中MSC產(chǎn)量在3代 末時(shí)是其十倍，在6代末時(shí)是其100倍之多。
[0118] 為進(jìn)一步評價(jià)MSC增殖，接種一額外的骨髓于如表3所示的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包 被有纖連蛋白的組織培養(yǎng)塑料制品上。
[0119] 表3.添加到無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長因子

[0121] 第1代后，MSC的產(chǎn)量在各條件之間沒有明顯的差異;但是，第2代后，條件5和6的累 積群體倍增數(shù)下降。條件7、8、9、10和11在群體倍增數(shù)上穩(wěn)步增加;然后，相對于條件7和8來 說，PDG化b的添加(條件10和11)并沒有增加 MSC的產(chǎn)量(圖9)。
[0122] MSC表面表型的表征是通過使用一面板的抗體去檢測陽性和陰性標(biāo)記來進(jìn)行，運(yùn) 種分析是在第3、6和9代的末期進(jìn)行。圖10說明，與在10%FBS中培養(yǎng)的MSC相對比，無血清培 養(yǎng)基(條件7和8)中培養(yǎng)的MSC，在標(biāo)準(zhǔn)面板的表面標(biāo)記物表達(dá)上沒有區(qū)別。此外，MSC的標(biāo)記 物CD90、CD73或CD105在第3、6和9代時(shí)仍然為陽性。然而，與血清培養(yǎng)的細(xì)胞相比，無血清條 件7和8下培養(yǎng)的MSC具有較高的CD146表達(dá)，而且運(yùn)在傳代中得到保留。
[01 Z3]為了進(jìn)一步研究MSC表型，在第3代開始時(shí)，接種MSC于成脂肪、成骨和成軟骨試驗(yàn) 中。圖11顯示了不同MSC培養(yǎng)物形成脂肪細(xì)胞（圖11a)、骨細(xì)胞（圖1化）、軟骨細(xì)胞（圖11c)的 能力沒有差異。
[0124] 為研究MSC表型的穩(wěn)定性，在第7代開始時(shí)，再次接種MSC于成脂肪、成骨和成軟骨 試驗(yàn)中。圖12顯示MSC在后續(xù)傳代后保留了其分化的能力，而且不同培養(yǎng)物形成脂肪細(xì)胞 (圖12a)、骨細(xì)胞(圖12b)或軟骨細(xì)胞(圖12c)的能力沒有差別。
[0125] 為研究不同的MSC培養(yǎng)物的血管生成潛力，在第3代開始時(shí)，將MSC與人廝靜脈血管 內(nèi)皮細(xì)胞化UVEC)在基質(zhì)膠上共培養(yǎng)。4小時(shí)后，對形成的小管的數(shù)量進(jìn)行定量。為進(jìn)一步評 估MSC培養(yǎng)物分泌血管生成因子的情況，將來自2日齡的MSC培養(yǎng)物的MSC培養(yǎng)基加入到類似 的基質(zhì)膠上的HUVEC。
[0126] 圖13表明，與在10%FBS中培養(yǎng)的MSC相比，在含bFGF和TG邱-1的無血清培養(yǎng)基中 培養(yǎng)的MSC(無論有或沒有EGF)形成較多的小管。此外，來自運(yùn)些培養(yǎng)物的培養(yǎng)基也支持小 管形成，因此說明運(yùn)些無血清培養(yǎng)物有血管生成因子的釋放。
[0127] 圖14和圖15顯示，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MSC在體內(nèi)向骨組織分化。所產(chǎn)生的骨 組織要優(yōu)于對照實(shí)驗(yàn)中含血清培養(yǎng)基中的MSC產(chǎn)生的骨組織。
[0128] 為了研究缺氧條件下MSC的培養(yǎng)是否增加細(xì)胞產(chǎn)量和/或維持骨髓來源的無血清 MSC的特征，對無血清培養(yǎng)基的完整鑒定包括W下研究:生長動力學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、=系分化 潛能、表面表型、促血管生成潛力和免疫學(xué)性質(zhì)。運(yùn)些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖16所示，結(jié)果表明，與 對照含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞相比，缺氧培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞具有更優(yōu)的生長動力 學(xué)，同時(shí)也產(chǎn)生了更大的細(xì)胞產(chǎn)量。
[0129] 實(shí)施例2 [0。0] 目的和方法
[0131]實(shí)施W下的操作W評估包含各種脂蛋白的本發(fā)明培養(yǎng)基對骨髓來源的MSC的增 殖、分化、細(xì)胞形態(tài)學(xué)W及表面標(biāo)記物表型的影響；W及評估對附著因子即纖連蛋白用于無 血清培養(yǎng)基的需求。
[0。。培養(yǎng)基的制備
[0133]對脂蛋白的研究，制備的無血清(SF)培養(yǎng)基包括:無脂蛋白（No lipo)、極低密度 脂蛋白（VLDL)、低密度脂蛋白化DL)和高密度脂蛋白化DL)。其他存在的脂蛋白是乳糜微粒 和中間密度脂蛋白，它們不在本研究評估之列，因?yàn)樗鼈兡壳盁o法在市面上獲得。
[0。4] MSC 培養(yǎng)
[0135] 基于在SF培養(yǎng)基中的塑料附著，分離MSC:按照40xl06人骨髓單核細(xì)胞/T-175進(jìn)行 涂布，并于37°(：，5%〇)2,21%化的條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞一旦達(dá)到80-90%匯合時(shí)進(jìn)行傳代培 養(yǎng)。在第3代(P3)末期時(shí)，評估MSC的生長動力學(xué)、=系分化和表面標(biāo)記物表型。為了研究脂 蛋白，SF培養(yǎng)基被改良為包含80ng/mL的各種脂蛋白中的一種，并將運(yùn)些細(xì)胞接種于T175培 養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)瓶中已預(yù)包被有纖連蛋白。對于描述的纖連蛋白的研究，使用包含LDL的 標(biāo)準(zhǔn)SF培養(yǎng)基(標(biāo)準(zhǔn)配方），將細(xì)胞接種于T175培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)瓶沒有纖連蛋白、預(yù)包被 有纖連蛋白或者纖連蛋白添加到培養(yǎng)基本身。
[0136] 為了傳代SF細(xì)胞，對培養(yǎng)基充氣，加入5ml的化ypLE于每一個(gè)T175培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng) 瓶在室溫下解育lOmin，在顯微鏡下觀察細(xì)胞分離。一旦細(xì)胞分離，加入5ml的培養(yǎng)基，將細(xì) 胞懸液轉(zhuǎn)移至50mL離屯、管中，400xg離屯、5min。細(xì)胞生長到第3代(P3)時(shí)，將其用于S系分化 研究或用于評估和流式細(xì)胞分析。
[0137] 細(xì)胞樣本的流式細(xì)胞分析如下所述。封閉液是在50mL管中，將ImL的小鼠血清加入 至lj49mL的D-PBS中制備得到。FACS緩沖液是2 %服A溶液，用D-PBS制備得到的。
[0。引 MSC染色
[0139] 吸取IxlO5細(xì)胞（10(hiU到置于冰上的96孔板的8個(gè)孔的每個(gè)孔中，W及每種抗體 一個(gè)孔，不染色細(xì)胞一個(gè)孔。接著將板在4°C、400g條件下離屯、4min。小屯、吸取懸浮液W免影 響細(xì)胞團(tuán)，每孔中加入50ul的封閉液，然后吹打溶液讓細(xì)胞團(tuán)重懸。將樣本在封閉液中解育 化。封閉后，和前面一樣將板離屯、，重懸于50化的包含合適抗體的FACS緩沖液中。樣品與抗 體在4 °C的黑暗中解育45min。與抗體解育后，樣品用FACS緩沖液洗涂S次，最后重懸于20化 L的FACS緩沖液中，并轉(zhuǎn)移到FACS管中。SYT0X紅色死活細(xì)胞染料按照1:10000的最終稀釋比 例也添加到樣品中，10分鐘后利用抓FACS化nto II評估標(biāo)志物的表達(dá)。
[0140]
[0141] 進(jìn)行C即-f檢測，將骨髓單核細(xì)胞(MNC)按照lxl06MNC/10cm 2的密度一式S份接種 于6孔板中。在第10天時(shí)，細(xì)胞用預(yù)冷的95%甲醇固定和2%結(jié)晶紫染色lOmin。然后，用PBS 洗涂樣品并成像。皿li且包含密集的CFU-f，而VLDL和LDL組包含分散的集落。
[0142] 從骨髓中分離出MSC，并直接置于SF培養(yǎng)基中預(yù)包被有纖連蛋白的組織培養(yǎng)塑料 審IJ品上，所述SF培養(yǎng)基含或不含各種上述列出來的脂蛋白。觀察到在含化化和U)L的組中 CFU-f數(shù)量增加(是皿L的約3-5倍）。
[0143] 對MSC的標(biāo)志物CD105、CD73和CD90進(jìn)行評估，并標(biāo)準(zhǔn)化至相同濃度下使用的他們 的同型對照。觀察到運(yùn)些標(biāo)志物的相當(dāng)表達(dá)。此外，對CD146、CD271和W8B2進(jìn)行評估。運(yùn)些標(biāo) 志物都是之前被證明是保留在SF培養(yǎng)的MSC中，并在血清存在下丟失或大幅度減少。運(yùn)些標(biāo) 志物的表達(dá)在供體之間變化很大，但MSC在暴露于不同的脂蛋白或在缺乏他們的情況下，沒 有觀察到變化。
[0144] 從骨髓中分離出MSC，直接涂布在組織培養(yǎng)塑料制品上，所述組織培養(yǎng)塑料制品沒 有預(yù)包被纖連蛋白、燒瓶預(yù)包被有纖連蛋白，或纖連蛋白添加到的培養(yǎng)基配方自身當(dāng)中。系 統(tǒng)中有或沒有纖連蛋白的存在，無論其是包含在培養(yǎng)基中或作為一個(gè)單獨(dú)的預(yù)包被步驟， CRJ-f的形成能力沒有觀察到區(qū)別。
[0145] ^
[0146] 進(jìn)行上述工作是為比較無血清中不同的特定脂蛋白，和評估纖連蛋白作為附著因 子的需求。
[0147] 在含HDL的SF培養(yǎng)基存在下的CFU-f形成密集細(xì)胞簇的CFU-f，細(xì)胞分枝 (outgrowth)稀疏。相反，在包含化化的SF培養(yǎng)基或包含LDL的SF培養(yǎng)基中，分離的MSC形成 的CFU-f具有分散的集落，其中細(xì)胞主要作為單個(gè)細(xì)胞被看見。VLDL和LDL參與在動脈中將 脂肪運(yùn)送到細(xì)胞，運(yùn)可W表明為什么運(yùn)些組的細(xì)胞形成更加分散、看起來更加健康的CRJ- f。然而，在P3時(shí)，細(xì)胞全部有彼此相似的細(xì)胞形態(tài)，運(yùn)可能表明，對于脂蛋白的一個(gè)需求可 能僅僅是發(fā)生在MSC的初始分離中（在此情況下，從骨髓分離）。包含有化化或LDL的組中 CFU-f數(shù)量增加。在每代結(jié)束時(shí)應(yīng)用運(yùn)些CRJ-f數(shù)量和細(xì)胞產(chǎn)量來計(jì)算生長曲線。在脂蛋白 組間沒有觀察到供體內(nèi)差異，生長動力學(xué)方面，多個(gè)MSC供體的供體間差異一致。
[0148] 為了進(jìn)一步研究脂蛋白對MSC的影響，進(jìn)行=系分化試驗(yàn)。成軟骨作用通過測量硫 酸化糖胺聚糖水平對DNA含量標(biāo)準(zhǔn)化的水平進(jìn)行評估。基于運(yùn)些結(jié)果，所有組之間沒有觀察 到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣的，評估細(xì)胞的成骨潛力。細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，成骨 作用通過測量巧水平作為形成的礦化基質(zhì)的指標(biāo)進(jìn)行評估。在運(yùn)些組內(nèi)沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異。成脂肪作用是通過測量脂肪形成進(jìn)行評估，當(dāng)用油紅0染色時(shí)，脂肪形成會染成紅色。 與成骨作用和成軟骨作用的情況一樣，用各種脂蛋白培養(yǎng)的MSC的成脂肪潛力沒有統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異。除了他們的=系潛力，MSC的特點(diǎn)是它們共表達(dá)CD90、CD105和CD73。在運(yùn)之外，我們觀 察到，SF培養(yǎng)的MSC維持CD27UCD146和W8B2的表達(dá)，運(yùn)些標(biāo)記物是體內(nèi)MSC的指示，其通常 在體外培養(yǎng)早期或過程中丟失或顯著減少。所有脂蛋白處理的細(xì)胞保持表達(dá)95% W上的 MSC標(biāo)志物CD105、CD73和CD90。所有組中也保持了 CD27UCD146和W8B2的表達(dá)，但在高度可 變的水平。然而，值得注意的是，由于各種脂蛋白的存在，運(yùn)些標(biāo)記物沒有供體內(nèi)差異。
[0149] 基于上述結(jié)果，脂蛋白似乎對MSC的表面標(biāo)志物表達(dá)、生長動力學(xué)或=系分化潛力 沒有影響。然而，脂蛋白的存在似乎對從骨髓中初始分離MSC是重要的。在含有皿L的SF培養(yǎng) 基中建立的集落緊湊，看起來擁擠，而不能維持正常的CFU-f形態(tài)。此外，當(dāng)在化化或LDL中 分離時(shí)，獲得的CFU-f的產(chǎn)量增加?；谏鲜鰯?shù)據(jù)，VLDL和LDL似乎比皿L更適合在無血清培 養(yǎng)基中使用。
[0150] 運(yùn)項(xiàng)工作的最終目的是確定，在專口的無血清培養(yǎng)基中的MSC培養(yǎng)物的分離和建 立中，纖連蛋白是否是必需的。添加纖連蛋白到無血清培養(yǎng)基也用來與培養(yǎng)表面預(yù)包被附 著因子的標(biāo)準(zhǔn)做法做對比。運(yùn)是通過看細(xì)胞的CRJ-f數(shù)量和細(xì)胞生長動力學(xué)進(jìn)行評估的，所 述細(xì)胞從骨髓分離，直接置于沒有纖連蛋白的組織培養(yǎng)塑料制品上、置于預(yù)包被有纖連蛋 白的組織培養(yǎng)塑料制品上，和最后置于本身加入纖連蛋白的培養(yǎng)基中。從骨髓分離的標(biāo)準(zhǔn) 化至MNC計(jì)數(shù)的CFU-f數(shù)量沒有觀察到差異。同樣，在有或無纖連蛋白存在下，MSC培養(yǎng)物的 生長動力學(xué)都沒有受到影響，說明本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中附著因子對于MSC的分離或增殖 不是必須的。
[0151] 因此，本發(fā)明提供了一種用于干細(xì)胞生長的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基不使用血清作為 培養(yǎng)基的組分;本發(fā)明還提供了利用該培養(yǎng)基的方法和使用該培養(yǎng)基產(chǎn)生的細(xì)胞。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，其包括： (a) 成纖維細(xì)胞生長因子(FGF); (b) 轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β);和 (c) 脂蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基中的脂蛋白濃度為lμg/ml~lOOμg/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基的脂蛋白組分包括下述一種 或多種： (a) 高密度脂蛋白（HDL); (b) 低密度脂蛋白（LDL); (c) 中間密度脂蛋白（IDL);及 (d) 極低密度脂蛋白（VLDL)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其包括LDL。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其中LDL包括下述一種或多種或全部： (a) 大而輕LDL(lb LDL)顆粒； (b) 小而密LDL(sd LDL)顆粒;和 (c) 脂蛋白（a)(Lp(a))。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的培養(yǎng)基，其包括直徑為15nm~30nm的LDL顆粒。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其包括VLDL。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其包括直徑為30nm-80nm的VLDL顆粒。9. 根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基的FGF組分為FGF2(bFGF)， 可選地濃度為lng/ml至10ng/ml。10. 根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基的TGFM&分為TGFiM，可 選地濃度為lng/ml至20ng/ml。11. 根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基還包括或基于一基礎(chǔ)培 養(yǎng)基。12. 根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基還包括地塞米松、人血清 白蛋白和/或胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（ITS)。13. 根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基不包含其他的生長因子。14. 一種培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞例如人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括在權(quán)利要求1-13任一項(xiàng) 所述的培養(yǎng)基中孵育干細(xì)胞。15. -種組合物，其在(b)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基中，包含(a)人類干細(xì)胞。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟 骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞或血管生成細(xì)胞。17. 權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基中的干細(xì)胞，其用在醫(yī)學(xué)上。18. 權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基中的干細(xì)胞，其用在骨組織、血管組織、軟骨組 織或脂肪組織的形成中。
【文檔編號】C12N5/00GK106062179SQ201580008299
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年2月16日
【發(fā)明人】F·P·巴里, E·J·穆尼, J·M·墨菲, G·M·肖, S·P·蓋納德
【申請人】愛爾蘭國立高威大學(xué)