一種新型(r)?羥基腈裂合酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種比植物來源的羥基腈裂合酶穩(wěn)定性更高、使用其基因可以異源表達(dá)的羥基腈裂合酶，編碼該羥基腈裂合酶的基因以及該羥基腈裂合酶的制備方法。本發(fā)明涉及的羥基腈裂合酶，其特征在于，該羥基腈裂合酶具有序列編號3的氨基酸序列等特定的氨基酸序列。
【專利說明】
-種新型(R)-哲基臘裂合酶
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種比植物來源的徑基臘裂合酶穩(wěn)定性更高，并且也可W使用其基因 異源表達(dá)的（R)-徑基臘裂合酶，編碼該徑基臘裂合酶的基因，W及該徑基臘裂合酶的制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 徑基臘裂合酶是催化在氯化物供體的存在下將幾基化合物轉(zhuǎn)換為氯醇（a-徑基 臘)的反應(yīng)的酶。氯醇由于可轉(zhuǎn)換為a-徑基酸、a-徑基酬、0-氨基醇等各種化合物，是醫(yī)藥領(lǐng) 域和化學(xué)品領(lǐng)域等的重要中間體。因而，期待開發(fā)可W大量生產(chǎn)徑基臘裂合酶的方法。
[0003] 徑基臘裂合酶分為(S)選擇性和(R)選擇性兩種。其中，（R)-徑基臘裂合酶催化在 酸性條件下由酬或醒與氯化合物生成(R)-氯醇的反應(yīng)。作為該反應(yīng)的代表例，可W為由苯 甲醒和作為氯化合物的氯酸生成(R)-苯乙醇臘的反應(yīng)。此外，（1〇-徑基臘裂合酶可W用作 由低價的底物生產(chǎn)作為醫(yī)藥和化學(xué)制品中間體利用價值高的光學(xué)活性體的生物催化劑，在 多個領(lǐng)域中極其有用。
[0004] 為了在光學(xué)活性氯醇的工業(yè)生產(chǎn)中利用徑基臘裂合酶，期待開發(fā)可大量生產(chǎn)每個 菌體或每個蛋白質(zhì)的活性高的立體選擇性高的徑基臘裂合酶的方法。
[0005] 徑基臘裂合酶公知主要在具有氯巧的植物中存在。例如，作為(R)-徑基臘裂合酶 可知來源于扁桃(Primus amygdalus)等的菩薇科植物。此外，作為（S)-徑基臘裂合酶可知 來源于高梁（Sorghum bicolor)等的稻科植物，或木馨（Manihot esculenta)、橡膠樹 巧evea brasi 1 iensiS)、薇巧(Bal iospermum)等的大戟科植物。但是，僅能從W上的植物體 中提取微量的徑基臘裂合酶。
[0006] 因此，為了大量得到徑基臘裂合酶，嘗試通過基因工程方法得到徑基臘裂合酶(專 利文獻(xiàn)1-9)。然而，使用轉(zhuǎn)化株表達(dá)異源蛋白質(zhì)時，存在不能直接應(yīng)用根據(jù)同源蛋白質(zhì)的研 究得到的表達(dá)量和生化活性等的結(jié)果的情況。即，使用轉(zhuǎn)化株表達(dá)異源蛋白質(zhì)時，不能容易 地預(yù)先預(yù)測轉(zhuǎn)化株的行為、表達(dá)量、目標(biāo)蛋白質(zhì)的生化活性等。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) [000引專利文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)1:日本特表平11-508775號公報(bào)
[0010] 專利文獻(xiàn)2:日本特開2000-189159號公報(bào)
[0011] 專利文獻(xiàn)3:日本特開2000-189160號公報(bào)
[0012] 專利文獻(xiàn)4:日本特開2000-245486號公報(bào)
[0013] 專利文獻(xiàn)5:日本特開2002-330791號公報(bào)
[0014] 專利文獻(xiàn)6:國際公開第01/48178號小冊子
[0015] 專利文獻(xiàn)7:日本特開2004-194550號公報(bào)
[0016] 專利文獻(xiàn)8:日本特開2004-194551號公報(bào)
[0017] 專利文獻(xiàn)9:日本特開2000-125886號公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 如上述，徑基臘裂合酶是在產(chǎn)業(yè)上非常重要的酶，工業(yè)上的利用也需要穩(wěn)定供給。 但是，將在具有氯巧的植物中發(fā)現(xiàn)的徑基臘裂合酶從植物體中精制時，只能得到少量。另一 方面，徑基臘裂合酶存在難W異源表達(dá)的問題。此外，用徑基臘裂合酶生產(chǎn)光學(xué)活性化合物 時，酶需要暴露在苛刻的條件下，因此期待得到穩(wěn)定性高的酶。
[0019] 由此本發(fā)明的目的在于提供一種比植物來源的徑基臘裂合酶穩(wěn)定性更高并且也 可W使用其基因異源表達(dá)的(R)-徑基臘裂合酶，編碼該徑基臘裂合酶的基因，W及該徑基 臘裂合酶的制備方法。
[0020] 本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題進(jìn)行了深入研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在特定的區(qū)域 周期性大量出現(xiàn)的馬陸（個シパ瓜b哥力個乂尹)產(chǎn)生的(的-徑基臘裂合酶具有極好的穩(wěn)定 性，從而完成了本發(fā)明。
[0021] [1]具有下述(1)-(3)中的任意一項(xiàng)的氨基酸序列的(R)-徑基臘裂合酶。
[0022] (1)序列編號3所示的氨基酸序列；
[0023] (2)上述（1)中規(guī)定的氨基酸序列中，1個或數(shù)個的氨基酸缺失、替換和/或插入的 氨基酸序列，并且與具有序列編號3所示的氨基酸序列的天然型(的-徑基臘裂合酶相比較， 具有該氨基酸序列的（R)-徑基臘裂合酶的徑基臘裂合酶活性保持不變或者更高的氨基酸 序列；
[0024] (3)與上述(1)中規(guī)定的氨基酸序列具有至少30%的同源性的氨基酸序列，并且與 具有序列編號3所示的氨基酸序列的天然型(R)-徑基臘裂合酶相比較，具有該氨基酸序列 的(R)-徑基臘裂合酶的徑基臘裂合酶活性保持不變或者更高的氨基酸序列。
[0025] [2]上述[1]所述的(R)-徑基臘裂合酶，該(R)-徑基臘裂合酶為具有上述（1)-(3) 中的任意一項(xiàng)的氨基酸序列的亞基的二聚體。
[0026] [3]上述[1]或[2]所述的（R)-徑基臘裂合酶，該（1〇-徑基臘裂合酶為馬陸屬 (Qiamber 1 inius)來源。
[0027] [ 4]上述[3]所述的（R)-徑基臘裂合酶，該（R)-徑基臘裂合酶為馬陸 (Chamberlinius hu曰lienensis)來源。
[0028] [引具有下述(4)-(6)中任意一項(xiàng)的堿基序列的(R)-徑基臘裂合酶基因。
[0029] (4)序列編號2所示的堿基序列；
[0030] (5)上述(4)中規(guī)定的堿基序列中，1個或數(shù)個的堿基缺失、替換和/或插入的堿基 序列，并且與序列編號2所示的堿基序列編碼的天然型(R)-徑基臘裂合酶相比較，該堿基序 列編碼的(R)-徑基臘裂合酶的徑基臘裂合酶活性保持不變或者更高的堿基序列；
[0031] (6)與上述(4)中規(guī)定的堿基序列具有至少30%的同源性的堿基序列，并且與序列 編號2所示的堿基序列編碼的天然型(R)-徑基臘裂合酶相比較，該堿基序列編碼的（1〇-徑 基臘裂合酶的徑基臘裂合酶活性保持不變或者更高的堿基序列。
[0032] [6]上述[5]所述的(R)-徑基臘裂合酶基因，該(的-徑基臘裂合酶基因具有序列編 號1所示的堿基序列。
[0033] [7] -種載體，其特征在于，該載體含有上述[引或[6]所述的(的-徑基臘裂合酶基 因。
[0034] [引一種轉(zhuǎn)化株，其特征在于，該轉(zhuǎn)化株為通過上述[7]所述的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株。
[0035] [9]-種用于制備(R)-徑基臘裂合酶的方法，其特征在于，該方法包括，培養(yǎng)上述 [引所述的轉(zhuǎn)化株得到培養(yǎng)物的工序，W及從上述培養(yǎng)物中精制(的-徑基臘裂合酶的工序。
[0036] 本發(fā)明的(R)-徑基臘裂合酶在馬陸個體中含有，但其含量很少。但是，由于馬陸周 期性在局部地區(qū)大量出現(xiàn)，精制酶的原材料可W比較大量且容易地得到。即，本發(fā)明的(R)- 徑基臘裂合酶的精制的困難度，能夠通過作為原材料的馬陸的量克服。此外，本發(fā)明的(R)- 徑基臘裂合酶穩(wěn)定性良好，例如，能夠適用于作為重要合成中間體的氯醇的制備。從而本發(fā) 明的(R)-徑基臘裂合酶在產(chǎn)業(yè)上非常有用。
【附圖說明】
[0037] 圖1是分離了本發(fā)明的酶的馬陸（化amberlinius hualienensis)的照片。（A)為捕 獲時比較大型的馬陸的照片，（B)為比較小型的馬陸的放大照片。
[0038] 圖2是示出將從馬陸精制的(的-徑基臘裂合酶用SDS-PAGE分析的結(jié)果的凝膠的照 片。（A)是使用分子量標(biāo)記物求出分子質(zhì)量的凝膠的照片，（B)是為了確認(rèn)糖鏈的有無而進(jìn) 行了染色的凝膠的照片。
[0039] 圖3(A)-(C)分別為從馬陸精制的(R)-徑基臘裂合酶的紫外?可見?近紅外光譜、 紅外光譜W及圓二色譜的測定結(jié)果。
[0040] 圖4示出從馬陸精制的（1〇-徑基臘裂合酶的cDNA、推定氨基酸序列W及引物的退 火位點(diǎn)。
[0041] 圖5(A)和(B)分別為示出從馬陸精制的(的-徑基臘裂合酶的反應(yīng)抑與比活和殘余 活性的關(guān)系的圖表。
[0042] 圖6(A)和(B)分別為示出從馬陸精制的(1〇-徑基臘裂合酶的反應(yīng)溫度與比活和殘 余活性的關(guān)系的圖表。
[0043] 圖7(A)和(B)分別為示出從馬陸精制的(R)-徑基臘裂合酶與重組(R)-徑基臘裂合 酶的反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度W及比活與殘余活性的關(guān)系的圖表。
【具體實(shí)施方式】
[0044] W下，首先對本發(fā)明設(shè)及的(R)-徑基臘裂合酶進(jìn)行說明。
[0045] <(R)-徑基臘裂合酶〉
[0046] 本發(fā)明設(shè)及的(R)-徑基臘裂合酶為上述(1)-(3)中的任意一種。
[0047] 上述（1〇-徑基臘裂合酶中，"序列編號3所示的氨基酸序列"為馬陸 (化amberlinius hualienensis)來源的天然型徑基臘裂合酶的氨基酸序列。馬陸特別是在 鹿兒島縣周期性災(zāi)害，不僅導(dǎo)致列車停止等，并且，在想要驅(qū)除時會放出含有氨氯酸的氣 體，造成危害健康等問題。本發(fā)明的發(fā)明人注意到馬陸產(chǎn)生氨氯酸，考慮到其具有徑基臘裂 合酶，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而成功分離精制了本發(fā)明設(shè)及的（R)-徑基臘裂合酶。此外，由于本發(fā)明 設(shè)及的(R)-徑基臘裂合酶，是從災(zāi)害但是沒有確定驅(qū)除方法的馬陸中分離精制的，因此，本 發(fā)明作為馬陸處理方法的價值也很高。
[004引此外，與馬陸在分類上同屬帶馬陸目（Polydesmida)的Nedyopus tambanus tambanus (夕>"八7 力個乂尹）、口日'日;1!'0]11日1'1日 1:〇]1〇111；[]16日（；片、1^八八個乂尹）、 E；pane;rchodussp.(工パ幸/レ3テ'クス屬）、E；pane;rchodusfulvus化ga(工パ幸/レ3テ'ク 乂7瓜炒乂）、化腳;1!'〇]11日1'1日 laminate armigera(年シ中個乂尹）、化1山13 gracilis(個少 個乂尹）、化7口1：0。0巧地3 3口.（才才幸個乂尹屬）、化日]161'油0山13^'日口〇]1；[。日80日1'1(個7戶才 亡、、個乂尹）、Riukiaria semi circular is semicircularis( 了7 t、、。個乂尹）、Nedyopus patrioticus pahioticus(個力個乂尹）也會作為防御物質(zhì)產(chǎn)生氨氯酸或苯乙醇臘 等化uwahara等，J. Chem. Eco 1. , 37, PP. 232-238 (2011))。此外，本發(fā)明的發(fā)明人通過預(yù)備實(shí) 驗(yàn)石角認(rèn)了，Parafontaria tonominea和Riukiaria semicircularis semicircularis的磨 碎物具有的從苯甲醒合成苯乙醇臘的（R)-徑基臘裂合酶活性，分別為4.23U/mg和6.35U/ mg。因此，上述倍足綱動物也產(chǎn)生本發(fā)明設(shè)及的(R)-徑基臘裂合酶，可W從上述倍足綱動物 中精制本發(fā)明設(shè)及的(R)-徑基臘裂合酶。
[0049] 本發(fā)明中的"徑基臘裂合酶活性"是指，催化由氯化合物和酬化合物或醒化合物生 成氯醇的反應(yīng)的活性（W下稱為"合成活性"），和催化上述反應(yīng)的逆反應(yīng)的活性（W下稱為 "分解活性"）中的任意一種。本發(fā)明中，例如合成活性可W通過測定由苯甲醒生成(R)-苯乙 醇臘的生成量算出。苯乙醇臘的生成量，例如可通過HPLC定量。此外，分解活性可W通過測 定作為底物的苯乙醇臘生成苯甲醒的生成量算出。苯甲醒的生成量，例如可通過測定在巧 樣酸鋼緩沖液中，加入徑基臘裂合酶和消旋體苯乙醇臘時在波長28化m下的吸光值的增加 量而定量。
[0050] 本發(fā)明設(shè)及的（R)-徑基臘裂合酶，特別地，具有在廣泛的pH范圍和溫度范圍內(nèi)維 持活性的高穩(wěn)定性。
[0051] 本發(fā)明中酶"具有(特定的)氨基酸序列"是指，該酶的氨基酸序列含有特定的氨基 酸序列，并且可W維持該酶的功能。作為該酶中特定的氨基酸序列W外的序列，除了組氨酸 標(biāo)簽、用于固定化的接頭序列之外，可舉出二硫鍵等的交聯(lián)結(jié)構(gòu)等。此外，具有特定的氨基 酸序列時，也可具有糖鏈。
[0052] 本發(fā)明的上述氨基酸序列（2)中，"1個或數(shù)個的氨基酸缺失、替換和/或插入的氨 基酸序列"中的"1個到數(shù)個"的范圍沒有特別的限定，具有缺失等的(R)-徑基臘裂合酶只要 具有與具有上述氨基酸序列（1)的天然型(的-徑基臘裂合酶的天然型(的-徑基臘裂合酶相 同或更好的徑基臘裂合酶活性即可。上述"1個到數(shù)個"的范圍，例如可W為1個W上且30個 W下，優(yōu)選為1個W上且20個W下，更優(yōu)選為1個W上且10個W下，進(jìn)一步優(yōu)選為1個W上且7 個W下，更進(jìn)一步優(yōu)選為1個W上且5個W下，特別優(yōu)選為1個W上且3個W下、1個W上且2個 W下、1個左右。
[0053] 本發(fā)明的上述氨基酸序列（3)中，"與上述（1)中規(guī)定的氨基酸序列具有至少30% 同源性的氨基酸序列"中的"序列一致性"，只要是具有與該氨基酸序列同源性的（R)-徑基 臘裂合酶，為與具有上述氨基酸序列3的天然型(1〇-徑基臘裂合酶相同或更高的徑基臘裂 合酶活性的酶就沒有特別的限定。雖然與所述氨基酸序列同源性為30% W上就沒有特別的 限定，但優(yōu)選為30 % W上、40% W上、50 % W上、60% W上、70 W上或80 % W上，更優(yōu)選為 90% W上、92% W上、94% W上或95% W上，進(jìn)一步優(yōu)選為96% W上、98% W上、99% W上或 99.5% W上，特別優(yōu)選為99.8% W上。本發(fā)明中的"序列的同源性"運(yùn)一用語，指的是2個W 上氨基酸序列相互的氨基酸的一致性程度。因而，兩個氨基酸序列的一致性越高，他們的序 列一致性或類似性越高。巧巾氨基酸序列是否具有特定的同源性，可W通過序列的直接比較 分析，具體地，可w使用市售的序列分析軟件等分析。
[0054] 并且，本發(fā)明的發(fā)明人使用Blastp檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的（1〇-徑基臘裂合酶具 有同源性的已知的蛋白質(zhì)。具體地，Blastp檢索中檢出的蛋白質(zhì)僅5類，其中，相對于 BAD3083化ypothetical p;rotein[0ryza sativa Japonica Group]示出了最高的同源性。 但是，該同源性值只不過為44%。并且，該同源性值為與29個氨基酸殘基組成的部分序列比 較的結(jié)果，與該蛋白質(zhì)整體的氨基酸序列比較時，同源性值應(yīng)該是更小的值。即，可W說本 發(fā)明的(R)-徑基臘裂合酶是與至今已知的蛋白質(zhì)完全不具有同源性的新型的酶。
[0055] 上述氨基酸序列（2)和(3)中，"與具有序列編號3所示的氨基酸序列的天然型(R)- 徑基臘裂合酶相比較，（R)-徑基臘裂合酶的徑基臘裂合酶活性保持不變或者更高"是指，與 具有序列編號3所示的氨基酸序列的天然型(R)-徑基臘裂合酶相比較，作為對象的蛋白質(zhì) 的徑基臘裂合酶活性相對地相同或更高。具體地，針對將要比較的巧巾W上的酶，在相同條 件下進(jìn)行上述合成反應(yīng)或分解反應(yīng)，比較生成物的量，具有上述氨基酸序列（2)和(3)的酶 的活性比上述天然型酶高即可。
[0化6] <基因和載體>
[0057]本發(fā)明設(shè)及的基因?yàn)榫幋a上述(R)-徑基臘裂合酶的基因。
[005引上述基因（4)是從馬陸（化amberlinius hualienensis)分離精制的編碼天然型 (R)-徑基臘裂合酶的基因。因而，上述基因（4)也可W用從馬陸中制備的cDNA為模板通過 PCR等得到。
[0059] 本發(fā)明設(shè)及的基因的堿基序列(5)和(6)可W作為編碼上述(R)-徑基臘裂合酶(2) 或(3)的氨基酸序列的堿基序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。
[0060] 本發(fā)明的基因，例如可W為具有序列編號1或序列編號2的堿基序列的(R)-徑基臘 裂合酶基因 DNA或其互補(bǔ)序列，或W上述的片段為探針，通過菌落雜交、Southern blot等公 知的雜交方法從cDNA文庫中得到。此外，通過公知的方法合成基因，也可W合成具有序列編 號1或序列編號2的堿基序列的DNA。
[0061] 本發(fā)明中的"嚴(yán)格的條件"是指，雜交后的洗凈時的條件為鹽濃度300mMW上且 2000mM W下，溫度為40°C W上且75 °C W下，優(yōu)選為鹽濃度600mM W上且900mM W下，溫度為65 °C的條件。例如可舉出2XSSC、5(TC等的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員在運(yùn)樣的緩沖液的鹽濃度和 溫度等的條件的基礎(chǔ)上，選擇其它的探針濃度、探針長度、反應(yīng)時間等的各個條件，可W設(shè) 定用于得到本發(fā)明的(的-徑基臘裂合酶的條件。
[0062] 關(guān)于雜交法的詳細(xì)的步驟，可W參考"Mole州lar Cloning,A Laboratoiy Manual 化d ed/'Cold Spring化rbor Laboratoiy Press(1989)等。作為雜交的核酸，例如可舉出 含有相對于序列編號1或序列編號2的堿基序列，具有至少40% W上，優(yōu)選為60% W上，更優(yōu) 選為90% W上的同源性的堿基序列的核酸或其部分片段。
[0063] 本發(fā)明中，進(jìn)行制備(R)-徑基臘裂合酶基因的方法沒有特別的限定，通常可W采 用公知的方法進(jìn)行。例如可舉出，W天然型(R)-徑基臘裂合酶為基礎(chǔ)，采用市售的試劑盒產(chǎn) 生位點(diǎn)特異的替換的方法，或?qū)⒒?DNA選擇性地切開，接著除去或添加選擇的寡核巧酸并 連接的方法。
[0064] 運(yùn)些位點(diǎn)特異誘變法在"Molecular Cloning,A Laboratoir Manual 化d ed." Cold Spring Harbor Press( 1989)、('Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley&Sons(1987-1997)、Kunkel'Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,卵.488-92(1985)、Kramer and Fritz Method.Enzymol.,154,pp.350-67(1987)、Kunkel.Method.Enzymol.,85, pp. 2763-6( 1988)等中記載。近年來，利用WKunkel法和Gapped dupler法為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突 變法的引入變異用的試劑盒，例如可使用QuAChangeTM Site-Directed Mu1:agenesis Kit (Stratagene社制）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen社 制）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K,Mutan-Super Express Km等： TaKaRa Bio株式會社制）。
[0065] 此外，作為目標(biāo)的變異引入位點(diǎn)，位于對象基因序列中消化和連接容易的限制酶 位點(diǎn)的附近時，使用引入目標(biāo)變異的引物(合成寡DNA)并通過進(jìn)行PCR，可W簡單地得到引 入有目標(biāo)變異的基因 DNA片段。進(jìn)一步地，也可用將合成寡DNA組合的PCR法(assembly PCR) 進(jìn)行延長，得到合成基因。
[0066] 此外，通過與徑胺或亞硝酸等作為變異源的藥劑進(jìn)行接觸作用的方法、紫外線照 射誘發(fā)變異的方法、使用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))隨機(jī)引入變異的方法等的隨機(jī)引入變異的 方法，也能夠從天然型(的-徑基臘裂合酶基因得到期望的變異型(R)-徑基臘裂合酶基因。
[0067] 為了使通過上述的方法得到的本發(fā)明的(R)-徑基臘裂合酶基因在宿主中表達(dá)，在 基因的上游插入轉(zhuǎn)錄啟動子，下游插入終止子，構(gòu)建表達(dá)組件，該組件可W插入到表達(dá)載體 中?；蛘?，在導(dǎo)入該改良型徑基臘裂合酶基因的表達(dá)載體中已經(jīng)存在轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子 時，不需要構(gòu)建表達(dá)組件，利用載體中的啟動子和終止子，在啟動子和終止子之間插入該變 異基因即可。為了在載體中插入該改良型徑基臘裂合酶，可W采用使用限制酶的方法、使用 拓?fù)洚悩?gòu)酶的方法等。此外，插入時必要的話，也可W加入適當(dāng)?shù)慕宇^序列。并且，本發(fā)明 中，運(yùn)樣的重組操作可W在(R)-徑基臘裂合酶基因的制備過程的同時進(jìn)行。即，使用具有替 換成編碼其它的氨基酸的堿基序列的堿基序列的引物，W克隆了天然型徑基臘裂合酶基因 的重組載體為模板進(jìn)行PCR，能夠?qū)⒌玫降臄U(kuò)增產(chǎn)物重組入載體中。
[0068] 啟動子的種類沒有特別的限定，在宿主中可W適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)即可，例如可舉出大腸 桿菌來源的色氨酸操縱子的化P啟動子、乳糖操縱子的lac啟動子、A隧菌體來源的化啟動子 和PR啟動子、或枯草芽抱桿菌來源的葡萄糖酸合成酶啟動子（gnt)、堿性蛋白酶啟動子 (apr)、中性蛋白酶啟動子(噸r)，a-淀粉酶啟動子(amy)等。此外，也可W使用tac啟動子、 trc啟動子運(yùn)樣的經(jīng)改變、設(shè)計(jì)的序列。
[0069] 終止子不是必需的，其類型也沒有特別的限定，例如可W為不依賴P因子的終止 子，例如可舉出脂蛋白終止子、trp操縱子終止子、rrnB終止子等。
[0070] 此外，作為在翻譯成氨基酸過程重要的堿基序列，已知SD序列和Kozak序列等的核 糖體結(jié)合序列，可W將運(yùn)些序列插入變異基因的上游。使用原核生物作為宿主時，可W將SD 序列通過PCR法等插入，使用真核生物作為宿主時，可W將Kozak序列通過PCR法等插入。作 為SD序列沒有特別限定，雖然可舉出大腸桿菌來源或枯草芽抱桿菌來源的序列等，但只要 是在大腸桿菌或枯草芽抱桿菌等的需要的宿主內(nèi)起作用的序列就沒有特別的限定。例如， 與16S核糖體RNA的3'末端結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)的序列可W通過DNA合成制備4堿基W上連續(xù)的一致 序列進(jìn)行利用。
[0071] -般地，載體中含有用于篩選目標(biāo)轉(zhuǎn)化株的因子(篩選標(biāo)記）。作為篩選標(biāo)記，可舉 出耐藥性基因或營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因、賦予同化性基因（資化性付與遺伝子)等，可W根據(jù)目 標(biāo)和宿主進(jìn)行選擇。例如大腸桿菌中作為篩選標(biāo)記使用的耐藥性基因，可舉出氨節(jié)青霉素 抗性基因、卡那霉素基因、二氨葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因等。
[0072] 本發(fā)明中使用的載體沒有特別的限定，保持上述的變異基因即可，可W使用適應(yīng) 各自的宿主的載體。作為載體，例如可舉出質(zhì)粒DNA、隧菌體DNA、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子DNA、人工染 色體DNA等。例如，W大腸桿菌為宿主時，可W使用具有大腸桿菌中可W自主復(fù)制的結(jié)構(gòu)域 的 pTrc99A(Centraalbureau voor Sch imme 1 cu 1 tur e s ( CBS )，荷蘭，h t tp ://www.cbs.knaw.nl/KpUCigO'aKaRa Bio株式會社，日本）、p邸233-2(Centraa化ureau voor Schimmelcultures(CBS)，荷蘭，http: //www. cbs. knaw.nl/)、pET_12(Novagen社，德國）、 祀T-26b (Novagen社，德國）等。此外，可W根據(jù)需要使用上述載體經(jīng)過變異的載體。此外，可 W使用表達(dá)效率高的載體，例如具有trc啟動子、lac操縱子的表達(dá)載體pTrc99A或PKK233-2 等。
[0073] 上述的含有改良型徑基臘裂合酶基因的重組載體包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0074] <轉(zhuǎn)化株>
[0075] 將本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主中，可W制備轉(zhuǎn)化株。該轉(zhuǎn)化株也包含在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0076] 本發(fā)明中使用的宿主沒有特別的限定，導(dǎo)入上述的重組載體后，表達(dá)目標(biāo)的（R)- 徑基臘裂合酶即可。作為宿主，例如可舉出大腸桿菌、枯草芽抱桿菌等的細(xì)菌，己斯德畢赤 酵母（Pichiapasto;ris)等的畢赤酵母屬（Pichia)、酵母屬（Saccha;romyces)、曲霉 (Aspergillus)等的真菌，皿K293細(xì)胞等的動物細(xì)胞，Sf9細(xì)胞、Sf21細(xì)胞、High Five(BTI- TN-5B1 -4)細(xì)胞等的昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞等。
[0077] <(R)-徑基臘裂合酶的制備方法>
[0078] 本發(fā)明的(1〇-徑基臘裂合酶可W通過培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化株，通過從得到的培養(yǎng)物中精 制而制備。
[0079] 本發(fā)明中的"培養(yǎng)物"是指培養(yǎng)上清液、培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)菌體，或者細(xì)胞或菌體的破 碎物中的任意一種。培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化株得到的培養(yǎng)物包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0080] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)，可W按照宿主培養(yǎng)中使用的常規(guī)方法進(jìn)行。目標(biāo)的（R)- 徑基臘裂合酶在上述培養(yǎng)物中蓄積。
[0081] 培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)基含有宿主能夠同化的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等，能夠 有效地進(jìn)行培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)基即可，可使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基中的任意一種。作為 碳源，可舉出葡萄糖、半乳糖、果糖、薦糖、棉子糖、淀粉等的碳水化合物，乙酸、丙酸等的有 機(jī)酸，乙醇、丙醇等的醇類。作為氮源，可舉出氨、氯化錠、硫酸錠、乙酸錠、憐酸錠等的無機(jī) 酸或有機(jī)酸的錠鹽或其它含氮化合物。除此之外，也可W使用蛋白腺、酵母提取物、肉提取 物、玉米漿、各種氨基酸等。作為無機(jī)物，可舉出憐酸二氨鐘、憐酸氨二鐘、憐酸儀、硫酸儀、 氯化鋼、硫酸亞鐵、硫酸儘、硫酸鋒、硫酸銅、碳酸巧等。此外，根據(jù)需要，培養(yǎng)中為了防止發(fā) 泡也可W加入消泡劑。此外，也可W根據(jù)需要適當(dāng)添加維生素等。培養(yǎng)中根據(jù)需要可W在培 養(yǎng)基中添加氨節(jié)青霉素或四環(huán)素等的抗生素。
[0082] 培養(yǎng)中，為了防止載體和目標(biāo)基因的消除，可W在具有篩選壓力的狀態(tài)下培養(yǎng)。 良P，篩選標(biāo)記為耐藥性基因時，可在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的藥劑，篩選標(biāo)記為營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基 因時，可在培養(yǎng)基中去除相應(yīng)的營養(yǎng)因子。此外，篩選標(biāo)記為賦予同化性基因（資化性付與 遺伝子)時，可w根據(jù)需要添加相應(yīng)的同化因子作為唯一的同化因子。例如，培養(yǎng)用含有氨 節(jié)青霉素抗性基因的載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌時，培養(yǎng)基中可根據(jù)需要添加氨節(jié)青霉素。
[0083] 培養(yǎng)作為啟動子使用誘導(dǎo)性啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株時，根據(jù)需要可在培 養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑。例如，培養(yǎng)具有可用異丙基-e-D-硫代半乳糖巧（IPTG)誘導(dǎo)的啟動子的 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株時，可W在培養(yǎng)基中添加 IPTG等。此外，培養(yǎng)使用具有可用嗎I噪乙酸 (IAA)誘導(dǎo)的trp啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株時，可W在培養(yǎng)基中添加 IAA等。
[0084] 轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)條件沒有特別的限定，不影響目標(biāo)的(R)-徑基臘裂合酶的生產(chǎn)性和 宿主的增殖的條件即可，通常，培養(yǎng)溫度為l〇°CW上且45°CW下，優(yōu)選為10°CW上且40°CW 下，更優(yōu)選為15°CW上且40°CW下，進(jìn)一步優(yōu)選為20°CW上且37°CW下，根據(jù)需要也可W在 培養(yǎng)中改變溫度。培養(yǎng)時間可為5小時W上且120小時W下左右，優(yōu)選為5小時W上且100小 時W下，更優(yōu)選為10小時W上且100小時W下，進(jìn)一步優(yōu)選為15小時W上且80小時W下左 右。抑的調(diào)整可W使用無機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液等進(jìn)行，培養(yǎng)大腸桿菌時可調(diào)整為6W上且9W 下。作為培養(yǎng)方法，可舉出固體培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、通氣攬拌培養(yǎng)等。
[0085] 用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基的初始抑調(diào)整為7W上且9W下較為適宜。此外，培養(yǎng)在5°CW上 且40°C W下，優(yōu)選為10°C W上且37 °C W下進(jìn)行5小時W上且100小時W下。優(yōu)選通過通氣攬 拌深層培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)、流加培養(yǎng)等方式實(shí)施。
[0086] 本發(fā)明設(shè)及的（R)-徑基臘裂合酶，從上述培養(yǎng)物精制而成，其精制程度沒有特別 的限定。例如，可直接使用將上述培養(yǎng)物勻漿再通過過濾或離屯、等除去不溶物的溶液，也可 W使用進(jìn)一步通過柱層析等精制得到粗酶液或酶液。
[0087] <酶反應(yīng)>
[0088] (R)-徑基臘裂合酶是催化在氯化物供體的存在下將幾基化合物轉(zhuǎn)換為氯醇的反 應(yīng)的酶，此外也是催化作為其逆反應(yīng)的氯醇的分解反應(yīng)的酶。
[0089] 本發(fā)明中，作為徑基臘裂合酶活性的測定方法，例如可舉出在氯化鐘的存在下W 苯甲醒作為底物，通過HPLC測定苯乙醇臘的生成量的方法。或者，W消旋體苯乙醇臘為底 物，通過分光光度計(jì)在吸收波長280nm測定其分解而檢出的方法。作為溶劑，從氯醇的穩(wěn)定 性角度為中性到酸性，優(yōu)選使用巧樣酸鋼緩沖液。合成反應(yīng)優(yōu)選在抑4.0W上且4.2W下左 右進(jìn)行，分解反應(yīng)優(yōu)選在P冊W上且5.5 W下左右進(jìn)行。
[0090] 本發(fā)明主張2014年3月4日申請的日本專利申請第2014-42181號為基礎(chǔ)的優(yōu)先權(quán)。 2014年3月4日申請的日本專利申請第2014-42181號的說明書的全部內(nèi)容作為參考引入到 本申請。
[0091 ]實(shí)施例
[0092] W下，通過舉出實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明，本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可 在適應(yīng)上下文的宗旨范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兏鼘?shí)施，運(yùn)些均包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
[0093] 實(shí)施例1:天然型(R)-徑基臘裂合酶的獲得
[0094] (1) (R)-徑基臘裂合酶的精制
[00巧]在鹿兒島縣在確認(rèn)馬陸（Qiamberlinius hualienensis)災(zāi)害發(fā)生的2010年11月、 2011年11月和2012年8月將其捕獲。捕獲的馬陸在放入了干冰的容器中冷卻，在-80°C保管 至使用時。圖1為活著的馬陸的照片。
[0096]冷凍保存的上述馬陸(合計(jì)化g)在液氮中使用研鉢和研巧磨碎。在冰冷條件下，通 過將得到的微粒在20mM憐酸鐘緩沖液(pH7.0)中攬拌3小時W上而懸濁。小屯、地將得到的懸 濁液通過多層重疊的棉紗布過濾，除去固形物。將得到的液體用從娃魚精液中得到的硫酸 魚精蛋白（NACALAI TESQ肥社制）處理30分鐘后，在4°C、28500Xg條件下離屯、30分鐘。從得 到的上清液中，通過W下所示的條件精制酶。并且，W下操作在〇-4°C下進(jìn)行。
[0097]首先進(jìn)行硫酸錠分級沉淀，接下來通過柱層析從上述上清液中精制(的-徑基臘裂 合酶。柱層析使用DEAE樹脂(TOSOH社制/'DEAE-T0Y0PEA化(注冊商標(biāo))-650M")、疏水性樹脂 (TOSOH社制，"Butyl-TOYOPEAEL(注冊商標(biāo)）-650M")、陰離子交換柱（GE Healthcare BioSciences社制，"Q-Sepharose FF")、強(qiáng)陰離子交換柱（GE Healthcare BioSciences社 制，"MonoQTM 5/50化"）W及凝膠過濾層析柱（GE Healthcare BioSciences社制， "Superdex 75"和"Superdex 200 10/300GL")。此外，每個精制工序中，酶的活性在W下所 示的條件下測定。W下將從馬陸中精制的該(R)-徑基臘裂合酶略記為"R-化HNL"。
[009引（2)酶活性的測定
[0099] 徑基臘裂合酶的酶活性，W苯甲醒為底物，按W下的方法測定。即，在400nM巧樣酸 緩沖液(pH4.2，760化）中，將作為底物的苯甲醒1.25M的DMS0溶液(4化L)、適量的酶液(最大 10化L)混合。接下來加入1M KCN(l〇化L)開始合成反應(yīng)，22°C反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)后，回收反應(yīng) 液10化L，加入n-己燒:2-丙醇= 85:15的混合液劇烈攬拌，在4°C、16000Xg下離屯、分離3分 鐘。回收有機(jī)層(500化）。
[0100] 將得到的有機(jī)層(5化)在下述條件下用HPLC分析。
[0101] 層析柱：CHIRAL CE化 0J-H柱(Daicel社制）
[0102] 洗脫液:11-己燒:2-丙醇=85:15
[0103] 流速：lmL/min
[0104] 柱加熱溫度:30°C
[0105] 檢出：254nm
[0106] 保持時間:苯甲醒一5.5分鐘
[0107] (R)-苯乙醇臘一12分鐘
[010引 （S)-苯乙醇臘一14分鐘
[0109] 此外，作為底物的苯甲醒的消耗，通過測定280nm的吸光度進(jìn)行監(jiān)測。表1示出每個 精制工序中的酶數(shù)據(jù)。
[0110] [表 1]
[01111
[0112]此外，由消旋體苯乙醇臘向苯甲醒的分解反應(yīng)的活性，用下述方法測定。在含有 2mM的消旋體苯乙醇臘的1 OOmM巧樣酸緩沖液(P冊.0-5.5)中添加酶溶液，緩慢攬拌，22 °C反 應(yīng)1-2分鐘，苯甲醒的生成量用28化m的吸光度測定。作為苯甲醒的分子吸光系數(shù)，適用E280 =1.4mM^cnfi。精制酶的氯醇合成方向的活性，比氯醇分解方向的活性高2.6倍。
[0113] 實(shí)施例2:天然型(R)-徑基臘裂合酶的結(jié)構(gòu)分析
[0114] (1)分子量和四級結(jié)構(gòu)的分析
[011日]上述實(shí)施例1中精制的R-化ML的單體亞基的大小通過使用分子量標(biāo)記(B i 0-Rad 社制）的SDS-PAGE分析得到。分子量和四級結(jié)構(gòu)，通過使用GE化althcare社制的Superdex 10/300GL的凝膠過濾柱層析求得。具體可參照Dadashipour等，Journal of Biotechnology, 153 ,pp. 100-110(2011) (W下將該文獻(xiàn)略記為 "Dadashipour等（2011)")。 SDS-PAGE 的結(jié)果如圖2(A)所示。圖 2(A)中，1為從上開始 97.4kDA、66.2kDa、45KDa、31kDa、 21.5kDa和14.4kDa的分子量標(biāo)記的泳道，2為精制R-化HMj勺泳道。
[0116] 從SDS-PAGE和凝膠過濾的結(jié)果可知，R-畑歷L的分子量為47.3kDa，是分子量為 24.8kDa的亞基的同源二聚體。
[0117] (2)糖鏈的有無
[0118] 糖鏈的有無使用Pierce Glycoprotein Seining kit(The;rmo Scientific社制） 進(jìn)行確認(rèn)。具體地，SDS-PAGE凝膠中，糖蛋白中含有的順式二醇被高艦酸氧化為醒，生成的 醒基轉(zhuǎn)化為希夫氏堿呈紫紅色，從而可W確認(rèn)糖鏈的有無。上述反應(yīng)中確認(rèn)R-化H化的糖鏈 的有無的結(jié)果，作為代表性的糖蛋白的辣根過氧化物酶的結(jié)果一同在圖2(B)中示出。圖2 (B)中，1為R-化勺泳道，2為辣根過氧化物酶的泳道。
[0119] (3)分光分析
[0120] 將R-畑H化在20mM憐酸鐘緩沖液(PH7.0)中溶解，用紫外可見近紅外分光光度計(jì) (島津制作所制/'UV260(T)在210-600nm的范圍內(nèi)測定，檢出輔基。此外，將R-化歷L在室溫、 pH7.0下，通過分光計(jì)（Jasco社制，"720 Circular Dichroism Spechophotometer")在 170-30化m的范圍內(nèi)分析。進(jìn)一步地，用紅外分光光度計(jì)(Waltham社制，叩erkin-Elmer IR Spectrum 100")，推定精制酶的二級結(jié)構(gòu)。測定R-化證化的紫外?可見?近紅外光譜、紅外 光譜W及圓二色譜。各自的結(jié)果如圖3(A)-(C)所示。
[0121] 根據(jù)紫外?可見?近紅外光譜的測定結(jié)果（圖3(A))，R-^Hr化不含有輔酶FAD。此 夕h根據(jù)紅外光譜的測定結(jié)果（圖3(B))，從1645/cm的峰可知R-化ML是富含0亞基的蛋白 質(zhì)。進(jìn)一步地，根據(jù)圓二色譜的測定結(jié)果（圖3(C))，從222皿的圓二色性可知R-化曲化不是富 含a亞基的蛋白質(zhì)。
[0122] 實(shí)施例3:重組型(R)-徑基臘裂合酶的制備
[0123] (1)編碼R-ChH化的cDNA的克隆
[0124] 將馬陸冰冷麻醉，用綴子收集其體節(jié)側(cè)突。將取得的組織加入total RNA分離用試 劑（Invitrogen社製，"TRIzol Reagent")中，使用一次性勻漿器（Ni卵i社制，"BioMasher II")勻漿。根據(jù)說明書抽提RNA。用于5'/3'-RACE的cDNA使用Clontech Laboratories社制 的SMART RACE cDNA Amplification Kit和SMARTScribe Reverse Transcriptase合成，用 RNase H(TaKaRa Bio社制）處理。
[0125] (2)引物的設(shè)計(jì)
[01%]使用或不使用in-gel digestion法(APRO Life Science研究所），通過Edman降解 法確定精制的R-化HMJ勺氨基酸序列。W確定的氨基酸序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)下述的簡并引物。 [0127] PKAAINPI犯f:
[012 引 5'-CC(A/C/G/T)AA(A/G)GC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/T/C)AA(C/T)CC(A/C/G/ T)AT(A/T/C)CA(A/G)GA-3'（序列編號4)
[0129] APTALDIKf1：
[0130] 5'-GC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)TT(A/G)GA(C/T)AT(A/C/ T)AA-3'（序列編號5)
[0131] APTALDIKf2：
[0132] 5'-GC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)CT(A/C/G/T)GA(C/T)AT (A/C/T)AA-3'（序列編號6)
[0133] APTALDIKrl：
[0134] 5'-TT(A/G/T)AT(A/G)TC(C/T)AA(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)GG(A/C/G/ T)GC-3'（序列編號7)
[0135] APTALDIKr2：
[0136] 5'-TT(A/G/T)AT(A/G)TC(A/C/G/T)AG(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)GG(A/ C/G/T)GC-3'（序列編號8)
[0137] AAINPI犯f:
[013 引 5'-GC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G) GA-3'（序列編號9)
[0139] ATINPI犯f:
[0140] 5'-GC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G) GA-3'（序列編號10)
[0141] LAINPI 犯n:
[0142] 5 '-TT(A/G)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3 ' (序列編號11)
[0143] LAINPI犯f2:
[0144] 5'-CT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G) GA-3'（序列編號12)
[0145] LTINPI 犯n:
[0146] 5 '-TT(A/G)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3 ' (序列編號13)
[0147] LTINPI犯f2:
[014 引 5'-CT(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G) GA-3'（序列編號14)
[0149] AAINPI 犯r:
[0150] 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T) GC-3'（序列編號15)
[0151] ATINPI犯r:
[0152] 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(A/C/G/T) GC-3'（序列編號16)
[0153] LAINPI犯rl:
[0154] 5 '-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(C/T)AA-3 ' (序列編號17)
[01 巧]LAINPI 犯
[0156] 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T) AG-3'（序列編號18)
[0157] LTINPI犯rl:
[0158] 5 '-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(C/T)AA-3 ' (序列編號19)
[0159] LTINPI 犯曲
[0160] 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(A/C/G/T) AG-3'（序列編號20)
[0161] NCPET 服 CFA 阿：
[0162] 5 '-AA(C/T)TG(C/T)CC(A/C/G/T)GA(A/G)AC(A/C/G/T)CA(C/T)GG(A/C/G/T)TG(C/ T)TT(C/T)GC(A/C/G/T)TT-3'（序列編號21)
[0163] NCPET服CFAFr:
[0164] 5 '-AA(A/C/G/T)GC(A/G)AA(A/G)CA(A/C/G/T)CC(A/G)TG(A/C/G/T)GT(C/T)TC(A/ C/G/T)GG(A/G)CA(A/G)TT-3'（序列編號22)
[0165] 另外，序列前的記號表示設(shè)計(jì)簡并引物時作為基礎(chǔ)的氨基酸序列，最后的f和r表 不對應(yīng)cDNA堿基序列的引物退火的方向。
[0166] (3)PCR
[0167] 使用上述簡并引物和聚合酶（Thermo Fisher Scientific社制，"Dream hq DNA polymerase"和Clontech Laboratories制，"Advantage GC2 Polymerase Mix")，進(jìn)行PCR。 反應(yīng)為在94°C3分鐘后，（i)94°Cl分鐘，（ii)4(TCl分鐘，（iii)72°Cl分鐘的（i)-(iii)的循 環(huán)重復(fù)進(jìn)行70次。接下來，使用凝膠（Promega社制，"Wizard SV PCR and Gel Clean-Up System")精制PCR產(chǎn)物，連接至載體（Agilent Technologies社制，"pBluescript II SK ( + )")的Eco RV識別部位。用基因分析儀（Applied Biosystems社制，"3500Genetic Analyzer")確定DM序列。將得到的序列拼接，使用序列拼接軟件(Genetyx社制，"ATGC and Genetyx")進(jìn)行解析。
[0168] W得到的DM序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)W下的基因特異性引物。
[0169] R-ChHNL-1:5 '-CTGACTGAAACCTTCGAATGCACCACTCG-3 '（序列編號23)
[0170] R-ChHNL-2:5 ' -GGCATAATGAATCTTGTCGCCGTTTGGAAC-3 '（序列編號24)
[0171] R-ChHNk3:5 '-TTTGGTAGTGGACCAGCGAGCAGGTTGCAC-3 '（序列編號25)
[0172] R-ChHNL-4:5 '-ATAATCCCTTTAAAGTTCAGGTGCAATTAG-3 '（序列編號26)
[0173] R-ChHNL-5:5'-ATACCAACACATCAAACTTACCAAGCTTAG-3'（序列編號27)
[0174] R-ChHNL-6:5 '-ATTATGGCTTACGATTTCGTCGGTGGTCC-3 '（序列編號28)
[0175] 使用上述引物和DNA聚合酶（東洋紡社制/'K0D plus neo")，進(jìn)行PCR。作為模板， 使用SMART RACE cDNA Amplification Kit制備的上述cDNA。反應(yīng)為在94°C2分鐘后，（i)98 °C 10秒鐘W及（ii)68°Cl分鐘的循環(huán)重復(fù)進(jìn)行35次。PCR產(chǎn)物連接至載體（Agilent Technologies社制，"pBluescript II SK( + r )，確定序列。其它的操作與上述相同。為了避 免錯誤，全長cDNA序列使用18個獨(dú)立的克隆進(jìn)行測定。
[0176] 得到的cDNA的堿基序列和推定的氨基酸序列如圖4所示。圖4中，星號表示終止密 碼子，信號膚W斜體表示，箭頭表示引物退火位點(diǎn)，氨基酸殘基的下劃線表示確定的氨基酸 序列。如上述，克隆了編碼馬陸來源的（R)-徑基臘裂合酶(R-化HNL)的cDNA。推定的氨基酸 序列，Blastp search中沒有與任何蛋白質(zhì)表現(xiàn)出同源性。
[0177] (4)酵母系表達(dá)載體的構(gòu)建
[017引使用基因特異的引物ChHNk4和ChHNk5，W及DNA聚合酶(Agilent Technologies 社制，'申fu 叫tra II fusion HS DM polymerase")擴(kuò)增cDNA全長。PCR為在95°C2分鐘后， (i)95°C20秒鐘，（ii)40°C20秒鐘，（iii)72°C 1分鐘的循環(huán)重復(fù)進(jìn)行30次，最后在72°C反應(yīng)3 分鐘。反應(yīng)液用限制酶(New化gland Biolabs社制/'Dpn r)在37°C下處理1小時。DNA片段 用凝膠精制，連接至載體(Stratagene社制，"pBluescript II SK( + r )，與上述相同地確定 序列。
[01巧]為了將編碼成熟ChH化的cDNA片段插入質(zhì)粒載體pPICZaA(Life technologies社） 中，設(shè)計(jì)下述的含有限制酶識別位點(diǎn)的引物。
[0180]趾 〇Ikex2-mChua 歴L:
[0181 ] 5 '-GCGCTCGAGAAAAGACTGACTTGTGATCAACTTCCC-3 '（序列編號29)
[0182] ChuaHNLstop-Xbal:
[0183] 5 '-CGCTCTAGATTAGTAAAAAGCAAAGCAACCGTGGGTTTC-3 '（序列編號30)
[0184] 使用上述引物與上述同樣地進(jìn)行PCR，將得到的PCR產(chǎn)物連接至載體(S化atagene 社制，"pBluescript II SK( + )")確認(rèn)堿基序列后，將插入序列連接至質(zhì)粒載體化ife Technologies社，"pPICZaA")的限制酶識別位點(diǎn)。
[01化](5)轉(zhuǎn)化株的制備和重組型R-化曲化的精制
[0186] 將制備的質(zhì)粒載體用限制酶SacI在37°C消化3-4小時。為了得到陽性的酵母克隆， 使用EasySelect Pichia E邱ression KitiXife technologies社）和GS115系統(tǒng)的己斯德 畢赤酵母(Pichia pastoris) ePichia感受態(tài)細(xì)胞制備方法按照J(rèn)oan Lin-Cereghino等， BioTechniques，38，pp. 44-48(2005)的方法。將轉(zhuǎn)化株用組氨酸添加最少的丙S醇培養(yǎng)基 培養(yǎng)后，為了誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而在組氨酸添加最少的甲醇(0.5%)培養(yǎng)基化中，在30 °C下培養(yǎng)4天。
[0187] 將培養(yǎng)基用切線流過濾系統(tǒng)（夕シッ工シbフ才口一 ?フ小レbレ一シ3シシステ 厶）濃縮，加入陰離子交換柱(DEAE-T0Y0PEARL(注冊商標(biāo))-650M，柱體積：25mL)。非吸附性 成分用疏水性相互作用層析（Butyl-TOYOPEA化（注冊商標(biāo)）-650M)分離，進(jìn)而用Superdex 10/300化精制R-ChHNL
[018引實(shí)施例4: R-化歴L的底物
[0189] R-化ML的底物通過氯醇合成反應(yīng)篩選。為了確定R-化ML的底物，使用強(qiáng)陰離子 交換柱組分(2化L，表1)2.抓作為酶樣本，空白對照中使用重蒸饋水代替酶樣本。將300曲1〇1 的巧樣酸鋼緩沖液(pH4.2)、酶樣品、50mM的幾基化合物W及1 OOmM的KCN混合(總量：ImL)， 25°C下反應(yīng)5分鐘。結(jié)果使用檢出波長為254nm的0J-H手性柱的HPLC進(jìn)行監(jiān)測，通過檢出反 應(yīng)生成物從而確定活性的有無。
[0190] 但是，苯甲醒W外的芳香族待測化合物，作為50mM的DMS0溶液(4化)反應(yīng)。用于待 測化合物4-漠苯甲醒的提取溶劑，使用n-己燒:2-丙醇= 19:1的混合溶液。待測化合物不在 水中溶解時，在30°C下W1000-150化pm攬拌。此外，為脂肪族的待測化合物時，反應(yīng)時間為2 小時。反應(yīng)后，在反應(yīng)液40化L中加入二異丙酸60化L，劇烈攬拌，leOOOg下離屯、分離5分鐘。 在上清液4(K)化中，加入無水乙酸20化、化晚10化、4-二甲氨基化晚2-3mg，37°C下反應(yīng)一晚。 接下來，為了氯醇化合物和4-二甲氨基化晚的汽化，在60°C下反應(yīng)2-4小時。接下來加入水 100化和乙酸乙醋400化，離屯、后，將上清液150化作為樣品（參考Effenberger，Stelze;r， Tetrahedron : Asymmetry , 6 , pp . 283-286 (1995))。生成化合物的檢出中，使用連接有 Supelcof3-Dex 325柱的氣相色譜（Shimadzu社制"GC-20ir )，使用氮?dú)庾鳛檩d氣。確認(rèn)的活 性的化合物如表2所示。
[0191] [表 2]
[0192]
[0193] 如表2所示的結(jié)果一樣，R-化歷L不僅可W用一般的天然H化作為底物的苯甲醒，還 可W用各種幾基化合物為底物。
[0194] 實(shí)施例5:3-化曲化的動力學(xué)分析
[01%]作為基質(zhì)使用各種幾基化合物或苯乙醇臘的消旋體，在上述相同的條件下進(jìn)行了 酶反應(yīng)。但是，作為底物使用苯甲醒時，反應(yīng)條件為抑5.2且為22°C，或者抑5.8且為35 °C。使 用各種濃度的苯甲醒作為底物，酶活性測定分別進(jìn)行3次，算出其平均值制作底物飽和曲 線，求出Vmax、Km和kcat的值作出Hanes-Woolf曲線。結(jié)果如表3所示。并且，表3中的"S.A/'為 比活，相對比活是相對于作為基質(zhì)使用苯甲醒在抑5.2、22°C反應(yīng)時的比活。此外，作為基質(zhì) 使用苯乙醇臘消旋體時，發(fā)生分解反應(yīng)，不能算出比活。
[0196] [表 3]
[0197]
[019引如表3所示的結(jié)果一樣，R-化歷L與目前已知的歴L相比，即使它不利用作為的輔酶 FAD，也顯示出了最高的kcat/Km值。
[0199] 實(shí)施例6:相對于R-化HMi勺溫度和pH的穩(wěn)定性
[0200] 關(guān)于上述實(shí)施例1得到的天然型R-化ML或上述實(shí)施例3得到的重組型R-化HNL，使 用最終濃度400mM的巧樣酸鹽緩沖液W及作為底物的苯甲醒，通過與上述相同的酶反應(yīng)條 件試驗(yàn)相對于溫度和pH的穩(wěn)定性。根據(jù)溫度的穩(wěn)定性通過在PH7.0的反應(yīng)液中，在0-70°C的 溫度范圍內(nèi)反應(yīng)1小時來測定。此外，將反應(yīng)溫度設(shè)定為20°C、pH變更為3-11并進(jìn)行了同樣 的反應(yīng)。運(yùn)時，在抑3-8使用巧樣酸-憐酸緩沖液，在抑8-11使用甘氨酸-NaOH緩沖液。酶活性 按照化dasMpour等(2011)記載的方法測定。天然型R-化歴L的反應(yīng)抑與比活和殘余活性的 關(guān)系分別如圖5(A)和圖5(B)所示，反應(yīng)溫度與比活和殘余活性的關(guān)系分別如圖6(A)和圖6 (B)所示。此外，兩種R-畑HNL的反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH與殘余活性的關(guān)系分別如圖7(A)和圖7 (B)所示。圖7中，重組型R-ChH化表示為"rec-Pichia"。
[020。 如圖5所示，天然來源的R-化ML在抑5.8下顯示出的最大活性，pH4時，顯示出最大 活性的約10%的活性。運(yùn)一最適pH，比其它植物來源的ML的最適PH5.1更高。此外，如圖5 (B)所示的一樣，天然來源的R-化歴L在較寬的抑范圍內(nèi)具有穩(wěn)定性。
[0202] 此外，如圖6所示可知，天然來源的R-化ML在0-70°C的寬的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出活 性，35°C為最適溫度，60°CW下表現(xiàn)出高活性。并且，已知的植物來源的ML中最穩(wěn)定的為杏 仁來源的HNL，記載了其即使在60°C下1小時也是穩(wěn)定的（Woke;r,R等，Methods Enzymol., 228,卵.584-590(1994);化1136]1,1.等，8;[016油]1〇1.4口口1.8;[0油6111.,15,口口.90-99(1992))。 但是，即使是最穩(wěn)定的杏仁來源的HNL，在75°C下30分鐘也會完全失活。相對于此，本發(fā)明設(shè) 及的R-化歷L的活性，如圖6所示，可預(yù)測其即使在60°C下保持超過1小時也可維持活性，在 75 °C下保持1小時也可維持20 %的活性。因此，本發(fā)明設(shè)及的R-化H化與已知的ML相比穩(wěn)定 性更高。
[0203] 進(jìn)一步地，如圖7所示，重組型R-化HNL，雖然不具有天然來源的R-化ML那樣高的 相對于溫度的穩(wěn)定性，但是相對于pH的穩(wěn)定性與天然來源的R-化ML相同甚至更高，此外， 與一般的酶相比，顯示出了非常高的穩(wěn)定性。
[0204] 實(shí)施例7 :R-ChHNL活性抑制劑的研究
[0205] 針對R-化HNL，用每種活性抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在與上述相同的酶反應(yīng)條件下，使用 實(shí)施例1中得到的天然來源的R-化HNL，在反應(yīng)液中加入ImM或0.1 mM濃度的待測化合物，在 lOmM憐酸鐘緩沖液(PH7.0)中，在20°C進(jìn)行60分鐘的反應(yīng)。殘余活性測定了立次。其平均值 如表4所示。
[0206] [表 4]
[0207]
[0208] 如表4所示的結(jié)果一樣，試驗(yàn)的待測化合物中，只有少數(shù)化合物顯示出了抑制活 性。例如，作為琉基試劑的艦乙酸和艦乙酷胺在濃度達(dá)到1 OmM時抑制R-化ML的活性。作為 著名的絲氨酸蛋白酶抑制劑的PMSF也顯示出了同樣的趨勢。硫氯酸錠強(qiáng)烈抑制大戟科植物 的橡膠樹^、°弓年7 厶）和斑巧屬來源的S-H化的活性，但是不抑制本發(fā)明設(shè)及的R-化HNL 的活性。金屬中，隸離子和銀離子僅顯示出30-40%的抑制活性。從W上的結(jié)果可知，本發(fā)明 設(shè)及的R-化HNL，即使在針對W往的酶的各種的活性抑制劑的存在下也顯示穩(wěn)定的活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種(R)-羥基腈裂合酶，其中，該(R)-羥基腈裂合酶具有下述（1)-(3)中的任意一項(xiàng) 的氨基酸序列； (1) 序列編號3所示的氨基酸序列； (2) 上述（1)中規(guī)定的氨基酸序列中，1個或數(shù)個的氨基酸缺失、替換和/或插入的氨基 酸序列，并且與具有序列編號3所示的氨基酸序列的天然型(R)-羥基腈裂合酶相比較，具有 該氨基酸序列的(R)-羥基腈裂合酶的羥基腈裂合酶活性保持不變或者更高的氨基酸序列； (3) 與上述（1)中規(guī)定的氨基酸序列具有至少30%的同源性的氨基酸序列，并且與具有 序列編號3所示的氨基酸序列的天然型（R)-羥基腈裂合酶相比較，具有該氨基酸序列的 (R)-羥基腈裂合酶的羥基腈裂合酶活性保持不變或者更高的氨基酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)_羥基腈裂合酶，其中，所述(R)_羥基腈裂合酶為具有上述 (1)-(3)中的任意一項(xiàng)的氨基酸序列的亞基的二聚體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的（R)-羥基腈裂合酶，其中，所述(R)-羥基腈裂合酶為馬陸 屬(Chamber linius)來源。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的（R)_羥基腈裂合酶，其中，所述（R)_羥基腈裂合酶為馬陸 (Chamberlinius hualienensis)來源。5. -種(R)_羥基腈裂合酶基因，其中，該(R)_羥基腈裂合酶基因具有下述(4)-(6)中任 意一項(xiàng)的喊基序列； (4) 序列編號2所不的喊基序列； (5) 上述(4)中規(guī)定的堿基序列中，1個或數(shù)個的堿基缺失、替換和/或插入的堿基序列， 并且與序列編號2所示的堿基序列編碼的天然型(R)-羥基腈裂合酶相比較，該堿基序列編 碼的(R)-羥基腈裂合酶的羥基腈裂合酶活性保持不變或者更高的堿基序列； (6) 與上述(4)中規(guī)定的堿基序列具有至少30%的同源性的堿基序列，并且與序列編號 2所示的堿基序列編碼的天然型(R)_羥基腈裂合酶相比較，該堿基序列編碼的（R)_羥基腈 裂合酶的羥基腈裂合酶活性保持不變或者更高的堿基序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的(R)-羥基腈裂合酶基因，其中，所述(R)-羥基腈裂合酶基因具 有序列編號1所示的堿基序列。7. -種載體，其特征在于，該載體含有權(quán)利要求5或6所述的(R)-羥基腈裂合酶基因。8. -種轉(zhuǎn)化株，其特征在于，該轉(zhuǎn)化株為通過權(quán)利要求7所述的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株。9. 一種用于制備(R)_羥基腈裂合酶的方法，其特征在于，該方法包括，培養(yǎng)權(quán)利要求8 所述的轉(zhuǎn)化株得到培養(yǎng)物的工序，以及從上述培養(yǎng)物中精制(R)-羥基腈裂合酶的工序。
【文檔編號】C12N1/19GK106062191SQ201580011747
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年3月3日 公開號201580011747.X, CN 106062191 A, CN 106062191A, CN 201580011747, CN-A-106062191, CN106062191 A, CN106062191A, CN201580011747, CN201580011747.X, PCT/2015/56179, PCT/JP/15/056179, PCT/JP/15/56179, PCT/JP/2015/056179, PCT/JP/2015/56179, PCT/JP15/056179, PCT/JP15/56179, PCT/JP15056179, PCT/JP1556179, PCT/JP2015/056179, PCT/JP2015/56179, PCT/JP2015056179, PCT/JP201556179
【發(fā)明人】淺野泰久, M·D·拉克莫薩利, 石田裕幸
【申請人】公立大學(xué)法人富山縣立大學(xué)