玉米基因zmspl1和zmspl2及其用圖
【專利摘要】提供了玉米基因ZmSPL1和ZmSPL2。還提供了由這些基因編碼的蛋白和這些基因的用途。
【專利說明】
玉米基因 ZMSPL1和ZMSPL2及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的領(lǐng)域，特別是玉米基因 ZmSPLl和ZmSPL2及其用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 器官大小是植物形態(tài)的一個重要特征。在相同生長條件下，在具有相同基因型和 相同物種內(nèi)的個體間的器官大小中存在較少差異。對于不同物種，種子和其它器官的大小 變化很大，而屬于一個物種的個體具有相對一致的種子和類似大小的其它器官的大小。運 些事實顯示，植物的器官大小嚴格地在遺傳控制下。同時，植物器官的形態(tài)受外部環(huán)境(包 括因素，諸如:光、溫度和營養(yǎng))強烈影響。因此，控制植物器官大小的機制是非常復(fù)雜的，因 為是植物的內(nèi)部機制，其精確地控制器官當(dāng)最終長大時的預(yù)定大小。植物器官大小是重要 的產(chǎn)量性狀。因此，關(guān)于植物的種子或其它器官的大小的研究將為可用于開發(fā)轉(zhuǎn)基因高產(chǎn) 量作物的可能遺傳修飾提供理論基礎(chǔ)和一些新穎遺傳來源。
[0004] 植物器官大小可W根據(jù)物種而變化很大。除了自然條件的限制，人工選擇在植物 器官大小中具有顯著影響。盡管植物的器官大小自我控制的機理仍不清楚，但存在至少兩 種支配植物的器官大?。醇毎麛?shù)目和細胞大?。┑囊阎獫撛谝蛩?。通常，不同物種的相同 器官的大小由其中的細胞數(shù)目確定。然而，單獨地改變細胞數(shù)目或細胞大小并不總是導(dǎo)致 器官大小的變化。運是因為一種因素的變化可由其它因素代償。例如，器官的細胞數(shù)目的減 少可能不會導(dǎo)致更小的植物器官，因為植物可W通過增加總細胞體積而彌補細胞數(shù)目的減 少，使得整個器官維持相同大小。運種細胞生長的協(xié)調(diào)機制提示植物本身的內(nèi)源調(diào)節(jié)。一些 最近研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過影響細胞數(shù)目、細胞大小或兩者而發(fā)揮作用W控制器官大小的基因 途徑的一些關(guān)鍵基因。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 在一個方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含定位W提供多核巧酸的表達的 在植物細胞中有功能的啟動子，所述多核巧酸具有W下核巧酸序列：
[0007] (l)SEQ ID NO: 1或3中所示的序列，或其互補序列；
[000引（2)在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 1或3中所示的序列雜交的序列；
[0009] (3)與沈Q ID N0:1 或3中所示的序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %、98.5 %、99 %或99.5 %序列同一性的序列，其編碼表現(xiàn)出控制植物 器官大小的功能的蛋白；或
[0010] (4)由通過缺失、取代、插入或添加一個或多個核巧酸而衍生化SEQ ID NO: 1或3中 所不的序列獲得的序列。
[0011] 在另一個方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含定位W提供多核巧酸的表達 的在植物細胞中有功能的啟動子，所述多核巧酸具有W下核巧酸序列：
[001^ (1)序列，其編碼沈Q ID N0:2或4中所示的多膚；
[0013] (2)序列，其編碼與SEQ ID N0:2或4中所示的序列具有至少85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%序列同一性的多膚;或
[0014] (3)序列，其編碼由通過缺失、取代、插入或添加一個或多個氨基酸而衍生化SEQ ID N0:2或4中所示的序列獲得的多膚。
[0015] 在又一個方面，本發(fā)明提供包含上述核酸分子的重組DNA構(gòu)建體。
[0016] 在又一個方面，本發(fā)明提供分離的多膚，其選自：
[0017] (1)具有沈Q ID N0:2或帥所示的氨基酸序列的多膚;和
[0018] (2)衍生自（1)的多膚，其包含SEQ ID N0:2或4中所示的氨基酸序列中取代、缺失 或添加一個或多個氨基酸殘基，并且表現(xiàn)出控制植物器官大小的功能。
[0019 ]在又一個方面，本發(fā)明提供包含上述核酸分子或重組DNA構(gòu)建體的植物細胞。
[0020]在又一個方面，本發(fā)明提供包含上述核酸分子或重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化植物。
[0021 ]在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，轉(zhuǎn)化植物與未轉(zhuǎn)化植物或野生型植物相 比具有改變的性狀，其中所述改變的性狀選自增加的種子大小、增加的種子數(shù)目、增加的種 子重量、增加的巧粒大小、增加的巧粒數(shù)目、增加的巧粒重量、增加的葉片大小、增加的葉片 面積、增加的葉片數(shù)目、增加的葉片細胞數(shù)目、增加的主根長、增加的側(cè)根數(shù)、增加的根鮮重 和增加的產(chǎn)量。總之，運也可W導(dǎo)致植物的器官大小增加和/或植物的生物量增加。
[0022] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，轉(zhuǎn)化植物是單子葉植物或雙子葉植物， 優(yōu)選作物植物。
[0023] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物選自玉米(Zea mays)、蕓苔屬 (Brassica)物種（例如，卷屯、菜型油菜（B.napus)、憲菁（B.rapa)、芥菜（B. juncea))、首猜 (Medicago sativa)、水稻（0;ryza sativa)、黑麥（Secale cereale)、高梁（Sorghum bicolor , Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Pennisetum glaucum)、黃米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龍爪稷（Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、紅花（Carthamus tinctorius)、小麥（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海島棉（Gossypium barbadense)、陸地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、渡蘿 (Ananas comosus)、相橘屬果樹（Citrus spp.)、可可（Theobroma cacao)、茶（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp.)、鱷梨（Persea americana)、無花果化i州s casica)、番石惱 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄攬（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲堅果（Macadamia integrifolia)、扁桃樹 (Primus amygdalus)、糖用甜菜（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麥、草替、藍 替和大麥。
[0024] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物是擬南芥（Arabidopsis thaliana)、水稻或玉米。
[0025] 在又一個方面，本發(fā)明提供上述基因、DNA分子、重組DNA構(gòu)建體或蛋白在控制植物 器官大小中的用途。
[0026] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述控制植物器官大小是增加植物器官 大小，且所述植物器官是植物種子、葉或根。
[0027] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物， 優(yōu)選作物植物。
[0028] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物選自玉米(Zea mays)、蕓苔屬 (Brassica)物種（例如，卷屯、萊型油萊（B.napus)、憲菁（B.rapa)、芥萊（B. juncea))、首猜 (Medicago sativa)、水稻（0:ryza sativa)、黑麥（Secale cereale)、高梁（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Penniseturn glaucum)、黃米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龍爪稷化leusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、紅花（Carthamus tinctorius)、小麥（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海島棉（Gossypium barbadense)、陸地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、聽蘿 (Ananas comosus)、豐甘橘屬果樹（Citrus spp.)、可可（Theobroma cacao)、茶（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp.)、鱷梨（Persea americana)、無花果化icus casica)、番石楷 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄才覽（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲堅果（Macadamia integrifolia)、扁桃樹 (F*runus amygdalus)、糖用甜萊（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麥、草霉、藍 霉和大麥。
[0029] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物是擬南芥、水稻或玉米。
[0030] 在又一個方面，本發(fā)明提供用于培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括將上述基因引入 靴植物^獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物具有比原始目標(biāo)植物更大的植物器官大 小。
[0031] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物， 優(yōu)選作物植物。
[0032] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物選自玉米(Zea mays)、蕓苔屬 (Brassica)物種（例如，卷屯、萊型油萊（B.napus)、憲菁（B.rapa)、芥萊（B. juncea))、首猜 (Medicago sat iva)、水稻（0:ryza sat iva)、黑麥（Secale cereale)、高梁（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Penniseturn glaucum)、黃米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龍爪稷化leusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、紅花（Carthamus tinctorius)、小麥（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海島棉（Gossypium barbadense)、陸地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、聽蘿 (Ananas comosus)、豐甘橘屬果樹（Citrus spp.)、可可（Theobroma cacao)、茶（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp.)、鱷梨（Persea americana)、無花果化icus casica)、番石楷 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄才覽（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲堅果（Macadamia integrifolia)、扁桃樹 (F*runus amygdalus)、糖用甜萊（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麥、草霉、藍 霉和大麥。
[0033] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物是擬南芥、水稻或玉米。
[0034] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物器官是植物種子、葉或根。
[0035] 在又一個方面，本發(fā)明提供用于增加植物產(chǎn)量的方法，其中所述方法包括用上述 重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物且獲得與未轉(zhuǎn)化植物或野生型植物相比顯示增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)化植 物。
[0036] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物， 優(yōu)選作物植物。
[0037] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物選自玉米(Zea mays)、蕓苔屬 (Brassica)物種（例如，卷屯、萊型油萊（B.napus)、憲菁（B.rapa)、芥萊（B. juncea))、首猜 (Medicago sativa)、水稻（0:ryza sativa)、黑麥（Secale cereale)、高梁（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Penniseturn glaucum)、黃米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龍爪稷化leusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、紅花（Carthamus tinctorius)、小麥（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海島棉（Gossypium barbadense)、陸地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、聽蘿 (Ananas comosus)、豐甘橘屬果樹（Citrus spp.)、可可（Theobroma cacao)、茶（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp.)、鱷梨（Persea americana)、無花果化icus casica)、番石楷 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄才覽（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲堅果（Macadamia integrifolia)、扁桃樹 (F*runus amygdalus)、糖用甜萊（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麥、草霉、藍 霉和大麥。
[0038] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物是擬南芥、水稻或玉米。
[0039] 在又一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有改變的性狀的轉(zhuǎn)化植物的方法，其中所述方 法包括用上述重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物且獲得轉(zhuǎn)化植物，與未轉(zhuǎn)化植物或野生型植物相比， 所述轉(zhuǎn)化植物顯示選自^下的改變的性狀:增加的種子大小、增加的種子數(shù)目、增加的種子 重量、增加的粹粒大小、增加的粹粒數(shù)目、增加的粹粒重量、增加的葉片大小、增加的葉片面 積、增加的葉片數(shù)目、增加的葉片細胞數(shù)目、增加的主根長、增加的側(cè)根數(shù)、增加的根鮮重和 增加的產(chǎn)量。
[0040] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物， 優(yōu)選作物植物。
[0041] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物選自玉米(Zea mays)、蕓苔屬 (Brassica)物種（例如，卷屯、萊型油萊（B.napus)、憲菁（B.rapa)、芥萊（B. juncea))、首猜 (Medicago sat iva)、水稻（0:ryza sat iva)、黑麥（Secale cereale)、高梁（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Penniseturn glaucum)、黃米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龍爪稷化leusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、紅花（Carthamus tinctorius)、小麥（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海島棉（Gossypium barbadense)、陸地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、聽蘿 (Ananas comosus)、豐甘橘屬果樹（Citrus spp.)、可可（Theobroma cacao)、茶（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp.)、鱷梨（Persea americana)、無花果化icus casica)、番石楷 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄才覽（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲堅果（Macadamia integrifolia)、扁桃樹 (Primus amygdalus)、糖用甜菜（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麥、草替、藍 替和大麥。
[0042] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述植物是擬南芥、水稻或玉米。
[0043] 在根據(jù)本發(fā)明的方面的一個實施方案中，所述產(chǎn)量相對于在類似條件下生長的非 轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量增加約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。優(yōu)選地，所 述植物是水稻，且1000-重量增加10-25 %。此外，優(yōu)選地，所述植物是玉米，且100-重量增加 15-25%。
[0044] 附圖簡述
[0045] 圖1顯示ZmSPLl基因的全長CDS擴增產(chǎn)物。
[0046] 圖2顯示ZmSPLl和擬南芥AtS化的聚類分析結(jié)果。
[0047] 圖3顯示不同玉米組織中的ZmSPLl基因的表達。
[004引圖4顯示ZmSPLl過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的種子的表型特征。
[0049] 圖5顯示ZmSPLl過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型植物中授粉后的種子和胚的表型 特征。
[0050] 圖6顯示ZmSPLl過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的根系的表型特征。
[0051] 圖7顯示ZmSPLl過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型植物中的葉的表型特征。
[0化2] 圖8顯示ZmSPL2基因的全長CDS擴增產(chǎn)物。
[0化3] 圖9顯示ZmSPL2和擬南芥AtS化的聚類分析結(jié)果。
[0化4] 圖10顯示不同玉米組織中的ZmSPL2的表達。
[0055] 圖11顯示ZmSPL2過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的種子的表型特征。
[0056] 圖12顯示ZmSPL2過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型植物中授粉后的種子和胚的表 型特征。
[0057] 圖13顯示ZmSPL2過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的根系的表型特征。
[005引圖14顯示ZmSPL2過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型植物中的葉的表型特征。
[0059] 圖15比較從ZmSPLl和ZmSPL2過表達的轉(zhuǎn)基因水稻植物獲得的巧粒和對照巧粒的 表型特征。
[0060] 圖16比較從ZmSPLl和ZmSPL2過表達的轉(zhuǎn)基因水稻和對照植物獲得的巧粒的粒長 和粒寬。
[0061 ]圖17比較從ZmSPLl和ZmSPL2過表達的轉(zhuǎn)基因水稻和對照植物獲得的巧粒的1000- 粒重量。
[0062] 圖18顯示過表達ZmSPL 1的轉(zhuǎn)基因玉米幼苗的PCR鑒定的結(jié)果。
[0063] 圖19對比ZmSPLl過表達的轉(zhuǎn)基因玉米和Z肥NG-58玉米的穗部(spike)性狀。
[0064] 圖20比較ZmSPLl過表達的株系和Zhen58對照之間的穗長。
[00化]圖21比較ZmSPLl過表達的株系和Zhen58對照之間的穗寬。
[0066] 圖22比較ZmSPLl過表達的株系和Zhen58對照之間的穗長。
[0067] 圖23比較ZmSPLl過表達的株系和Zhen58對照之間的穗寬。
[0068] 圖24比較ZmSPLl過表達的株系和Zhen58對照之間的穗部中的粒行數(shù)。
[0069] 圖25比較ZmSPLl過表達的株系和Zhen58對照之間的行中的粒數(shù)。
[0070] 圖26比較ZmSPLl過表達的株系和Zhen58對照之間的粒徑。
[0071] 圖27比較ZmSPLl過表達的株系和Zhen58對照之間的100-粒重量。
[0072] 圖28比較ZmSPkOX水稻和對照之間的粒長。
[0073] 圖29比較ZmSPkOX水稻和對照之間的粒寬。
[0074] 圖30顯示平均粒長的比較。
[0075] 圖31顯示平均粒寬的比較。
[0076] 圖32比較ZmSPLl和ZmSPL2轉(zhuǎn)基因水稻和對照之間的巧粒表型。
[0077] 圖33比較ZmSPLl和ZmSPL2轉(zhuǎn)基因水稻和對照之間的粒長。
[007引圖34比較ZmSPLl和ZmSPL2轉(zhuǎn)基因水稻和對照之間的粒寬。
[0079] 圖35比較ZmSPkOX水稻和對照之間的粒長。
[0080] 圖36比較ZmSPkOX水稻和對照之間的粒寬。
[0081 ]圖37顯示平均粒長的比較。
[0082] 圖38顯示平均粒寬的比較。
[0083] 圖39比較ZmSPLl和ZmSPL2過表達的轉(zhuǎn)基因水稻和對照之間的1000-粒重量。
[0084] 發(fā)明詳述
[0085] 提供W下定義和方法W更好地定義本發(fā)明并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員W實施本 發(fā)明。除非特別指出，術(shù)語應(yīng)當(dāng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解。
[0086] 如本文所使用，"植物"包括完整植物、轉(zhuǎn)基因植物、分生組織、枝條器官/結(jié)構(gòu)（例 如，葉、莖和塊莖）、根、花和花器官/結(jié)構(gòu)(例如，巷、專片、花瓣、雄蕊、屯、皮、花藥和胚珠）、種 子(包括胚、胚乳和種皮)和果實(成熟子房）、植物組織(例如，維管組織、基本組織等)和細 胞(例如，保衛(wèi)細胞、卵細胞、花粉、葉肉細胞等)及其后代?？蒞用于本公開方法中的植物種 類通常與可用于轉(zhuǎn)化和育種技術(shù)處理的高等和低等植物的種類一樣廣泛，其包括被子植物 (單子葉和雙子葉植物）、裸子植物、藤類植物、木賊類植物、裸藤植物、石松類植物、苔薛植 物和多細胞藻類。
[0087] 如本文所使用，"轉(zhuǎn)基因植物"意指其基因組已經(jīng)通過重組DNA的穩(wěn)定整合而改變 的植物。轉(zhuǎn)基因植物包括從最初轉(zhuǎn)化的植物細胞再生的植物和來自轉(zhuǎn)基因植物的后續(xù)生成 或雜交的后代轉(zhuǎn)基因植物。
[008引如本文所使用，"對照植物"意指不含賦予增強性狀的重組DNA的植物。對照植物用 于鑒定和選擇具有增強性狀的轉(zhuǎn)基因植物。合適的對照植物可W是用于生成轉(zhuǎn)基因植物的 親本系的非轉(zhuǎn)基因植物，例如，缺乏重組DNA的野生型植物。合適的對照植物也可W是含有 賦予其它性狀的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物，例如，具有增強的除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因植物。在 一些情況下，合適的對照植物可W是被稱為陰性分離子或陰性等值線（isoline)的不含重 組DNA的半合子轉(zhuǎn)基因植物系的后代。
[0089]如本文所使用，"轉(zhuǎn)基因植物細胞"意指用穩(wěn)定整合的重組DNA轉(zhuǎn)化(例如通過農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或通過使用W重組DNA包被的微粒轟擊或通過其它手段)的植物細胞。本公開 的植物細胞可W是最初轉(zhuǎn)化的植物細胞，其作為微生物或作為子代植物細胞存在，其再生 為分化的組織，例如具有穩(wěn)定整合的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物，或衍生自子代轉(zhuǎn)基因植物的種 子或花粉。
[0090] 如本文所使用，"性狀"是植物或特定植物材料或細胞的生理、形態(tài)、生化或物理特 征。在一些情況下，該特征是人眼可見的，諸如種子或植物尺寸，或者可W通過生化技術(shù)(諸 如檢測蛋白、淀粉、某些代謝物或種子或葉的油含量)或通過觀察代謝或生理過程(例如通 過測量對水剝奪或特定鹽或糖濃度的耐受性)或通過測量一種或多種基因的表達水平(通 過利用Nodhern分析、RT-PCR、微陣列基因表達測定法或報道基因表達系統(tǒng))或通過農(nóng)業(yè)觀 察(諸如高滲脅迫耐受性和產(chǎn)量)來測量。然而，任何技術(shù)都可用于測量轉(zhuǎn)基因植物中的任 何選擇的化學(xué)化合物或大分子的量、比較水平或差異。
[0091] 如本文所使用，"增強性狀"意指由于轉(zhuǎn)基因植物中的重組DNA的穩(wěn)定整合和表達 而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因植物的特性。運種性狀包括，但不限于，增強的農(nóng)藝性狀，其特征在于增強 的植物形態(tài)、生理、生長和發(fā)育、產(chǎn)量、營養(yǎng)增強、疾病或害蟲耐受性或環(huán)境或化學(xué)耐受性。
[0092] 如本文所使用，術(shù)語"分離的"是指將分子與其在其天然或自然狀態(tài)下通常相關(guān)的 其它分子至少部分分離。在一個實施方案中，術(shù)語"分離的基卸'或"分離的DNA分子"是指與 在其天然或自然狀態(tài)下通常側(cè)接基因或DNA分子的核酸至少部分分離的基因或DNA分子。因 此，通過例如重組技術(shù)，融合至通常與其無關(guān)的調(diào)控或編碼序列的基因或DNA分子在本文中 被認為是分離的。運種分子被認為是分離的，甚至當(dāng)整合入宿主細胞的染色體中或與其它 DNA分子一起存在于核酸溶液中時。
[0093] 如本文所使用，術(shù)語"嚴格條件"是Sambrook等人，1989和化ymes等人，于:Nucleic Acid Hybridization,A Practical A卵roach,IRL Press,Washington,DC(1985)描述的那 些。促進DNA雜交的適當(dāng)?shù)膰栏駰l件，例如，6.0 X氯化鋼/巧樣酸鋼(SSC)，約45°C，隨后在50 °C用2.0XSSC洗涂，是本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，或可見于Current Protocols in Molecular Biology John Wiley&Sons，N.Y. (1989) ,6.3.1-6.3.6。例如，洗涂步驟中的鹽 濃度可W選自在50°C的約2.0 X SSC的低嚴格度，至在50°C的約0.2 X SSC的高嚴格度。此外， 洗涂步驟中的溫度可W從室溫、約22°C的低嚴格條件增加至約65°C的高嚴格條件。溫度和 鹽兩者均可W變化，或者溫度或鹽濃度保持不變，而另一變量改變。例如，中度嚴格條件是 在約2.0XSSC和約65°C。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因具有SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3中所示的核酸序列。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的基因與SEQ ID N0:1或SEQ ID ^:3中所示的核酸序列共享80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%和99.5%序列同一性。在 本發(fā)明的進一步方面，本發(fā)明的基因與SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3中所示的核酸序列共享 95%96%、97%、98%、98.5%、99%和99.5%序列同一性。
[0094] 本發(fā)明的基因還包含經(jīng)由缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核巧酸而衍生自 SEQ ID NO: 1或3中所示的序列的變體序列?；蛲蛔兪侵富蚪MDNA分子的突然且可遺傳 的變異。在分子水平，基因突變意指堿基對組成或結(jié)構(gòu)的排列序列的變化?；蛲蛔兊纳?可W是自發(fā)的或誘導(dǎo)的。用于人工誘導(dǎo)基因突變的方法包括物理因素(諸如丫射線、X射線、 UV、中子束等），化學(xué)因素(諸如烷基化劑、堿基類似物、抗生素等)和生物因素(諸如某些病 毒、細菌等）。此外，可W使用重組DNA技術(shù)在DNA分子中的指定位點引入特定變異，W便進行 定點誘變。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W使用任何運些眾所周知的誘變方法，W獲得包含一個或多 個核巧酸的缺失、取代、插入和/或添加的SEQ ID NO: 1或3中所示的序列的變體序列。
[00M]如本文所使用，術(shù)語"重組體"是指自然界中通常不存在且因此通過人為干預(yù)生成 的DM和/或蛋白和/或生物體的形式。運種人為干預(yù)可W產(chǎn)生重組DM分子和/或重組植物。 如本文所使用，"重組DNA分子"是包含非天然一起存在并且是人為干預(yù)的結(jié)果的DNA分子的 組合的DNA分子，例如，包含W下的組合的DNA分子:至少兩種彼此異源的DNA分子，和/或人 工合成且包含源自自然界中通常存在的多核巧酸序列的多核巧酸序列的DNA分子，和/或包 含人工引入宿主細胞的基因組DNA的轉(zhuǎn)基因和宿主細胞基因組的相關(guān)側(cè)接DNA的DNA分子。 重組DNA分子的實例是本文描述的源自將轉(zhuǎn)基因插入擬南芥、玉米或水稻基因組、其可W最 終導(dǎo)致重組RNA和/或蛋白分子在該生物體中表達的DNA分子。
[0096] 如本文所使用，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"是指人工引入宿主細胞的基因組中的多核巧酸分 子。運種轉(zhuǎn)基因可W是與宿主細胞異源的。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因植物"是指包含運種轉(zhuǎn)基因的植物。
[0097] 如本文所使用，"基因"或"基因序列"是指基因的部分或完全編碼序列，其互補序 列，和其5'和/或3'非翻譯區(qū)?；蛞彩沁z傳的功能單元，并且在物理方面是參與產(chǎn)生多膚 鏈的沿著DNA(或RNA，在RNA病毒的情況下）的分子的核巧酸的特定區(qū)段或序列。后者可W經(jīng) 歷后續(xù)處理，諸如化學(xué)修飾或折疊 W獲得功能性蛋白或多膚。通過實例的方式，轉(zhuǎn)錄調(diào)芐基 因編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多膚，其可W是功能性的或需要加工W充當(dāng)轉(zhuǎn)錄的引發(fā)劑。
[0098] 如本文所使用，術(shù)語"DNA序列"、"核巧酸序列"和"多核巧酸序列"是指DNA分子的 核巧酸序列，通常從5'（上游)端至3'（下游)端呈現(xiàn)。
[0099] 本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的任何數(shù)量的方法都可W用于分離和操縱本發(fā)明中公 開的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)可用于擴增特定起始DNA分子和/ 或產(chǎn)生原始分子的變體。DNA分子或其片段也可W通過其它技術(shù)來獲得，諸如通過經(jīng)由化學(xué) 方法直接合成片段，諸如使用自動化寡核巧酸合成儀。
[0100] 如本文所使用，術(shù)語"啟動子"通常是指參與RNA聚合酶II和其它蛋白（反式作用轉(zhuǎn) 錄因子）的識別和結(jié)合W起始轉(zhuǎn)錄的DNA分子。啟動子可W最初分離自基因的基因組拷貝的 5'非翻譯區(qū)（5'UTR)?；蛘撸瑔幼涌蒞是合成產(chǎn)生或操縱的DNA分子。啟動子也可W是嵌合 的，即通過兩個或更多個異源DNA分子的融合產(chǎn)生的啟動子。植物啟動子包括獲得自植物、 植物病毒、真菌和細菌諸如農(nóng)桿菌和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)細菌的啟動子DNA。
[0101] 在植物的所有或大多數(shù)組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子被稱為"組成型"啟動子。在發(fā)育 的特定時段或階段過程中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子被稱為"發(fā)育型"啟動子。其表達在植物的特定 組織中相對于其它植物組織增強的啟動子被稱為"組織增強的"或"組織優(yōu)選的"啟動子。在 植物的特定組織內(nèi)表達、且在其它植物組織中很少或沒有表達的啟動子被稱為"組織特異 性"啟動子。在植物的特定細胞類型、例如小抱子母細胞中表達的啟動子被稱為"細胞類型 特異性"啟動子。"誘導(dǎo)型"啟動子是響應(yīng)于環(huán)境刺激諸如寒冷、干旱或光;或其它刺激諸如 創(chuàng)傷或化學(xué)應(yīng)用而起始轉(zhuǎn)錄的啟動子。植物中的許多生理和生化過程表現(xiàn)出具有約24小時 的周期的內(nèi)源性節(jié)律。"晝夜啟動子"是在晝夜振蕩器的控制下表現(xiàn)出改變的表達概況的啟 動子。晝夜調(diào)節(jié)經(jīng)受環(huán)境輸入諸如光和溫度W及生物鐘的協(xié)調(diào)。
[0102] 如本文所使用，"多膚"包含多個連續(xù)的聚合氨基酸殘基，例如，至少約15個連續(xù)聚 合的氨基酸殘基。在許多情況下，多膚包含一系列的聚合的氨基酸殘基，其為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑或 其結(jié)構(gòu)域或部分或片段。此外，所述多膚可W包含：（i)定位結(jié)構(gòu)域；（ii)活化結(jié)構(gòu)域；（iii) 抑制結(jié)構(gòu)域；（iv)寡聚化結(jié)構(gòu)域；（V)蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域；（vi)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域;或其 他。所述多膚任選地包含經(jīng)修飾的氨基酸殘基、不由密碼子編碼的天然存在的氨基酸殘基、 非天然存在的氨基酸殘基。
[010引如本文所使用，"蛋白"是指一系列氨基酸、寡膚、膚、多膚或其部分，無論是天然存 在的還是合成的。
[0104] 重組DNA構(gòu)建體使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法組裝并通常包含可操作連接 至DNA(其表達提供增強的農(nóng)藝性狀）的啟動子。其它構(gòu)建體組分可W包括額外的調(diào)節(jié)元件， 諸如用于增強轉(zhuǎn)錄的5'前導(dǎo)序列和內(nèi)含子，3'非編碼區(qū)（諸如多腺巧酸化信號和位點），和 用于轉(zhuǎn)換或祀向或信號膚的DNA。
[0105] "分離的多膚"，無論是天然存在還是重組的多膚，在細胞中（或細胞外）比在野生 型細胞中的其天然狀態(tài)的多膚更富集，例如，富集超過約5%，富集超過約10%，或富集超過 約20%，或超過約50%，或更多，即，可替代地表示為:相對于W100%均一化的野生型富集 105% ,110% ,120% ,150%，或更多。運種富集不是野生型植物的自然反應(yīng)的結(jié)果?？商娲?地，或額外地，將分離的多膚與其它通常締合的其它細胞組分分離，例如，通過任何各種蛋 白純化方法。
[0106] 同一性百分比描述多核巧酸或蛋白區(qū)段在序列（例如核巧酸序列或氨基酸序列） 的比對中不變的程度。序列的比對通過W下生成:手動比對兩個序列，例如作為參考的如本 文提供的所示序列和另一序列，W產(chǎn)生最高數(shù)目的匹配要素，例如個別核巧酸或氨基酸，同 時允許將缺口引入任一序列。與參考序列比對的序列的"同一性分數(shù)"是匹配要素的數(shù)目， 除W參考序列的全長，不包括由比對過程引入?yún)⒖夹蛄械娜笨?。如本文所使用?百分比同 一性"（"％同一性"）是同一性分數(shù)乘W100。
[0107] 對于天然序列內(nèi)的氨基酸的保守取代可W選自天然存在的氨基酸所屬類別的其 它成員。運些各種類別內(nèi)的代表性氨基酸包括，但不限于：（1)酸性(帶負電荷)氨基酸，諸如 天冬氨酸和谷氨酸；（2)堿性(帶正電荷)氨基酸，諸如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；（3)中性極 性氨基酸，諸如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半脫氨酸、酪氨酸、天冬酷胺和谷氨酷胺;和(4)中 性非極性(疏水)氨基酸，諸如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、鄉(xiāng)氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸 和甲硫氨酸。對于天然蛋白或多膚內(nèi)的氨基酸的保守取代可W選自天然存在的氨基酸所屬 組群的其它成員。例如，具有脂族側(cè)鏈的氨基酸組群是甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸和異 亮氨酸;具有脂族-徑基側(cè)鏈的氨基酸組群是絲氨酸和蘇氨酸;具有含酷胺側(cè)鏈的氨基酸組 群是天冬酷胺和谷氨酷胺;具有芳族側(cè)鏈的氨基酸組群是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;具有 堿性側(cè)鏈的氨基酸組群是賴氨酸、精氨酸和組氨酸;和具有含硫側(cè)鏈的氨基酸組群是半脫 氨酸和甲硫氨酸。天然保守氨基酸取代組群是:鄉(xiāng)氨酸-亮氨酸、鄉(xiāng)氨酸-異亮氨酸、苯丙氨 酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸鄉(xiāng)氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酷胺-谷氨酷胺。本公 開的一個進一步方面包括，由于天然序列中的一個或多個氨基酸的缺失或插入導(dǎo)致與所述 蛋白序列的氨基酸相差一個或多個氨基酸的蛋白。
[0108] 具有特別經(jīng)濟利益的性狀是增加的產(chǎn)量。產(chǎn)量通常被定義為來自作物的經(jīng)濟價值 的可測量的產(chǎn)生。運可W在數(shù)量和/或質(zhì)量方面進行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個因素，例如， 器官的數(shù)目和大小、植物構(gòu)造(例如，分枝的數(shù)目）、種子產(chǎn)生、葉衰老等。根發(fā)育、營養(yǎng)物攝 取、脅迫耐受性等也可W是決定產(chǎn)量的重要因素。
[0109] 種子產(chǎn)量是特別重要的性狀，因為許多植物的種子對于人類和動物營養(yǎng)是重要 的。作物諸如玉米、水稻、小麥、油菜和大豆占人類總熱量攝入的超過一半，無論是通過種子 本身的直接消耗還是通過由加工的種子飼養(yǎng)的肉類產(chǎn)品的消耗。它們也是工業(yè)過程中使用 的糖、油和多種代謝物的來源。種子的發(fā)育設(shè)及許多基因，并且需要代謝物從根、葉和莖轉(zhuǎn) 移入正在生長的種子。
[0110] 增加的植物生物量涵蓋飼料作物如首猜、青膽玉米和干草的產(chǎn)量。巧粒作物中已 經(jīng)使用產(chǎn)量的許多代用物(proxies)。運些中主要是植物或植物器官大小的估計值。植物大 小可W根據(jù)物種和發(fā)育階段W許多方式進行測量，但包括植物總干重、地上干重、地上鮮 重、巧粒大小、巧粒數(shù)目、100-或1000-粒重、葉片面積、莖體積、植物高度、蓮座直徑、葉長、 根長、根質(zhì)量和葉數(shù)。許多物種在給定發(fā)育階段維持植物的不同部分的大小之間的保守比 率。運些異速生長(allometric)關(guān)系用于從運些大小度量中的一種外推至另一種（例如， Tittonell等人2005 Ag;ricEcosys&Envi;ronl05:213)。在早期發(fā)育階段的植物大小將通 常與發(fā)育晚期的植物大小相關(guān)。具有較大葉面積的較大植物通?？蒞比較小植物吸收更多 的光和二氧化碳，因此，在相同時段期間將可能獲得更大的重量(化soula&Tollenaar 2005 Maydica 50:39)。除了微環(huán)境或遺傳優(yōu)勢的潛在延續(xù)W外，運是植物最初必須達到較大大 小。存在植物大小和生長速率的強遺傳組分（例如，ter Steege等人2005 Plant 化ysiology 139:1078)，并且因此對于一定范圍的多種基因型，在一種環(huán)境條件下的植物 大小可能與在另一環(huán)境條件下的大小相關(guān)化ittalmani等人2003 Theoretical Applied Genetics 107:679)。
[0111] 就作物諸如玉米、水稻等而言，產(chǎn)量意指收獲巧粒的量，并且粒徑和粒重性狀在確 定產(chǎn)量中是關(guān)鍵的。因此，增加粒徑和粒重對于增加增加作物的產(chǎn)量是重要的。
[0112] 控制器官大小，例如控制種子大小，特別是控制主要作物的種子大小，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè) 中具有顯著的重要性。器官大小是重要的產(chǎn)量性狀。因此，關(guān)于植物種子大小和器官大小的 研究為作物的遺傳修飾中的高產(chǎn)量培育提供了理論基礎(chǔ)和新穎基因來源。本發(fā)明人基于使 用S細技術(shù)的玉米雜交種和親本植物的表型差異首次發(fā)現(xiàn)新穎的玉米ZmSPLl和ZmSPL2基 因，并且它們可用于控制玉米和其它植物(諸如擬南芥）的種子或其它器官的大小和水稻種 子的大小。在本發(fā)明中，控制器官大小意指增加植物器官(例如種子、根、葉等)的大小，并且 植物器官的大小增加約1 % -120 %、約10 % -110 %、約20 % -100 %、約30 % -90 %、約40 % - 80%或約50%-70%，例如，植物器官的大小增加約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、100%、110%、120%或上述范圍內(nèi)的任何值。
[0113] SSH是用于快速確定兩個不同的生物材料之間的差異表達的分子生物學(xué)技術(shù)，并 且它是用于快速篩選差異表達的基因的有效方法，并且它是尋找新基因的重要方式?？蒞 通過經(jīng)由SSH構(gòu)建、文庫評估和篩選(反向斑點雜交)獲得陽性克隆、對陽性克隆測序和進行 生物信息學(xué)分析來確定差異基因的狀況。此外，全長cDNA序列可W使用RACE技術(shù)獲得，并使 用Nc化them印跡或?qū)崟rPCR進行評估。通過對玉米Zong31 xP 138雜交胚的SSH文庫分析，本發(fā) 明人發(fā)現(xiàn)雜交種和親本植物之間的玉米ZmSPLl的表達是不同的，運提示ZmSPLl在胚胎發(fā)育 中發(fā)揮作用。ZmSPLl恰巧與擬南芥序列中的最長類的AtS化具有高相似性。本發(fā)明人針對擬 南芥AtSI^L蛋白序列用捜索玉米基因組網(wǎng)站中的玉米DNA數(shù)據(jù)庫（http:// www.maizesequence.org,ht1:p://www.maizeg化.org)，并使用獲得的基因組序列W便用 BLASTx捜索玉米EST數(shù)據(jù)庫，因此推導(dǎo)并獲得玉米基因組序列的外顯子區(qū)域。通過人工剪接 運些序列而獲得最長的cDNA序列（SEQ ID NO: 1)。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可W使用諸如 RACE等技術(shù)獲得根據(jù)本發(fā)明的ZmSPLl基因的cDNA序列。
[0114] 擬南芥是一種小型開花植物，其被廣泛用作植物生物學(xué)(包括遺傳和植物發(fā)育研 究）中的模式生物體。擬南芥在植物學(xué)中具有與小鼠在醫(yī)學(xué)中和果蛹在遺傳學(xué)研究中相同 的作用。擬南芥具有W下優(yōu)點：小植物(可能在一個杯中種植幾株），生命周期短(從發(fā)芽到 種子成熟不超過6周），高種子產(chǎn)量(個別植物可W產(chǎn)生許多種子），和強活力(可W在普通培 養(yǎng)基上獲得人工培養(yǎng)物）。擬南芥具有目前已知最小的植物基因組。每個單倍體染色體組(n =5)具有總共7千萬個堿基對長度，也就是說，僅為小麥基因組的1/80。因此，由其克隆相關(guān) 基因相對容易。此外，已經(jīng)在2000年測序了擬南芥的整個基因組，運是進行測序分析的首個 植物基因組。擬南芥是一種自花授粉植物，并且其基因高度純合。并且當(dāng)用理化因子處理 時，其顯示高突變率，并且可W容易獲得各種代謝功能缺陷的植物。例如，當(dāng)用包含除草劑 的培養(yǎng)基篩選時，通常獲得1/100000的抗除草劑突變率。由于上述優(yōu)點，擬南芥是用于遺傳 研究的較好材料。
[0115] 除了植物形態(tài)研究中的經(jīng)典AB對莫型W外，在最近十年中，一些植物學(xué)家使用擬南 芥模型系統(tǒng)類似地研究不同的植物組織和器官的發(fā)育。通過分析大量擬南芥突變體，科學(xué) 家們廣泛研究了植物根、莖、葉、花、胚和種子的發(fā)育，植物中的抗病性和脅迫抗性的機制和 參與各種生命活動的激素、光和環(huán)境因素誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，等等。運些極大延伸了我們關(guān)于 植物中的生命活動的內(nèi)在機制的知識。
[0116] 為了確定由推定基因編碼的蛋白的大小W及起始密碼子和終止密碼子的位置，本 發(fā)明人實施W下步驟:使用來自NCBI的0RF Finder軟件化ttp://www.ncbi .nlm.nih.gov/ gorf/goW. html)對玉米ZmSPLl基因的推定cDNA序列進行開放閱讀框（0RF)分析，并用 BLASTx確定正確的閱讀框?；讷@得的基因 0RF序列和相應(yīng)的基因組序列，使用基因結(jié)構(gòu)分 析軟件Gene Shucture Display ServerAttp://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對獲得的玉米 ZmSPL 1基因進行結(jié)構(gòu)分析。
[0117] 用玉米B73基因組圖譜（Schnable，等人，2009)，本發(fā)明人將獲得的序列定位于染 色體上，并在基因組中捜索上游序列。具體地，本發(fā)明人實施W下步驟：1)進行基因組BLAST 捜索；2)經(jīng)由"基因組視圖（Genome view)"觀察基因組結(jié)構(gòu);和3)點擊相應(yīng)的染色體區(qū)域W 便通過相應(yīng)區(qū)域的上游和下游基因定位基因的位置。
[0118] 本發(fā)明人進一步對獲得的ZmSPLl基因進行多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)生分析。為了分 析玉米ZmSPLl基因和擬南芥中的同源基因序列之間的差異，本發(fā)明人首先使用具有軟件的 默認參數(shù)的ClusterW(Thompson,等人，1994)構(gòu)建SPL序列的多重序列比對構(gòu)型。本發(fā)明人 將多重序列比對結(jié)果引入GeneDoc化t1:p: //www. cris. com-Ketchup/genedoc. shtml)，并且 基于蛋白的多重序列比對結(jié)果，使用MEGA4.UKumar，等人，2004)進行系統(tǒng)發(fā)生樹校正，W 經(jīng)由鄰接法生成擬南芥和玉米的SHJC族成員的無根系統(tǒng)發(fā)生樹。
[0119] 本發(fā)明人通過實時巧光定量PCR研究不同植物部分中的ZmSPLl基因表達，并且發(fā) 現(xiàn)ZmSPLl在不同的組織或器官之間顯示表達水平的顯著變化。ZmSPLl基因在未成熟的玉米 果穗和雄穗中具有最高的表達水平，并且在正在發(fā)育的胚、胚乳、種皮、根和花絲中具有非 常低的表達水平。
[0120] 本發(fā)明人進一步研究ZmSPLl基因的功能和用途?？蒞通過各種常用的植物轉(zhuǎn)基因 方法將根據(jù)本發(fā)明的ZmSPLl基因引入植物。例如，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法、基因槍方法、PEG介導(dǎo) 的方法、超聲波法、子房注射法、花粉管途徑法等。農(nóng)桿菌是±壤中常見的革蘭氏陰性菌，并 且可W在自然條件下趨化感染大多數(shù)雙子葉植物的損傷部位W誘導(dǎo)冠瘦(crown gall)和 軟根(faiiT root)的生成。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的細胞 包含分別具有T-DNA區(qū)段的Ti質(zhì)粒和化質(zhì)粒。在通過感染植物傷口進入植物細胞之后，農(nóng)桿 菌可W將T-DNA插入植物基因組。因此，農(nóng)桿菌代表天然植物遺傳轉(zhuǎn)化體系?？蒞將祀基因 插入修飾的T-DNA區(qū)，并經(jīng)由農(nóng)桿菌感染實現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)移和引入植物細胞，然后通過細胞 和組織培養(yǎng)技術(shù)再生為轉(zhuǎn)基因植物。最初，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化僅用于雙子葉植物中。近年 來，它也廣泛地用于一些單子葉植物(特別是水稻）中?；驑尳閷?dǎo)的轉(zhuǎn)化方法使用火藥爆 炸或高壓氣體來加速(該加速裝置被稱為基因槍)微射彈，由此將用祀基因包被的高速微射 彈遞送入完整植物組織和細胞，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)再生轉(zhuǎn)基因植物。篩選出轉(zhuǎn) 基因陽性植物，即轉(zhuǎn)基因植物。與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化相比，基因槍轉(zhuǎn)化的一個主要優(yōu)點是， 其不受受體植物的范圍的限制。并且其載體質(zhì)粒的構(gòu)建是相對簡單的。因此，基因槍轉(zhuǎn)化是 轉(zhuǎn)基因研究中廣泛使用的方法之一。在花粉管途徑法中，將含有祀基因的DNA溶液注入子 房，W便經(jīng)由在植物的開花和受精期間形成的花粉管途徑將外源DNA引入生殖細胞，并且進 一步將外源DNA引入受體細胞的基因組，并且隨著生殖細胞的發(fā)育生長出新的個體植物。該 方法的最大優(yōu)點是其不依賴于組織培養(yǎng)和人工再生技術(shù)，因此該技術(shù)是簡單的，不需要設(shè) 備齊全的實驗室，并且容易由普通培育人員操作。本發(fā)明的W下實施例采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化方法。具體地，轉(zhuǎn)化包括葉盤方法、真空滲入方法和原生質(zhì)體方法等。
[0121]在引入前，有必要構(gòu)建表達重組載體。對于根據(jù)本發(fā)明引入植物的重組載體沒有 限制。根據(jù)引入和轉(zhuǎn)化技術(shù)，例如，各種質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒，人工染色體，植物病毒，包括RNA病毒， 單株DNA病毒等，可W用作本發(fā)明的載體。許多常見的載體構(gòu)建技術(shù)是現(xiàn)在可用的，例如，通 過DNA質(zhì)粒的酶促切割的常規(guī)載體構(gòu)建技術(shù)。即，通過限制性酶切割DNA質(zhì)粒，然后用連接酶 連接祀基因，W形成表達載體。該技術(shù)具有W下缺陷：其需要構(gòu)建多種中間體，因此具有低 效率。此外，由Invitrogen Inc.開發(fā)的Gateway技術(shù)不需要限制酶和連接酶。其首先構(gòu)建進 入載體，然后將祀基因重復(fù)引入不同的目的載體而用于表達。該方法具有簡單、快速、高克 隆效率和高特異性(保持閱讀框的位置和基因不改變)的特征。此外，由于抗生素選擇標(biāo)記 基因是在當(dāng)前轉(zhuǎn)基因植物中的隱患，本領(lǐng)域技術(shù)人員開發(fā)了一些不具有選擇標(biāo)記的重組載 體及其轉(zhuǎn)化方法，例如，包含兩個或S個T-DNA的二元或S元表達載體的共轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的 W下實施例采用Gateway技術(shù)。為了將ZmSPLl基因引入植物，本發(fā)明人使用Gateway技術(shù)構(gòu) 建ZmSPLl基因的過表達載體。該載體根據(jù)W下程序構(gòu)建:將gateway BP反應(yīng)接頭并至引物 的5'末端，通過PCR擴增獲得具有接頭序列的祀基因片段，經(jīng)由瓊脂糖凝膠回收產(chǎn)物，W特 定比率混合回收的產(chǎn)物與載體PD0NR221，并且在BP Clonase?酶的催化下，將祀基因取代入 PD0NR221載體。構(gòu)建的載體是進入載體。本發(fā)明人W特定比率混合構(gòu)建的含有祀基因的進 入載體與目的載體，并且在LR Clonase?酶的催化下，將進入載體中含有的祀基因取代入目 標(biāo)載體，從而獲得含有祀基因的表達載體。為了將祀基因 ZmSPLl引入植物諸如擬南芥，本發(fā) 明人使用構(gòu)建的過表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。所使用的農(nóng)桿菌可W是根癌農(nóng)桿菌GV3101 (Ectopic overexpression of wheat TaSrg6 gene confers water stress tolerance in Arabidopsis.Tong SM，Ni ZF,Peng 皿，Dong GQ,Sun QX.2007,172(6):1079-1086,可 公開地得自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）。然后本發(fā)明人用能態(tài)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化Columbia野生型擬南芥 (col-0,Yao Y,Ni Z,Du J,Han Z,Chen Y,Zhang Q,Sun Q.Ectopic overexpression of wheat adenosine diphosphate-ribosylation factor,TaARF,increases growth rate in Arabidopsis.J Integr Plant Biol.2009,51(1):35-44,可公開地得自中國農(nóng)業(yè)大 學(xué))。
[0122] 本發(fā)明還進行具有引入的ZmSPLl基因的擬南芥的表型研究(包括根系、葉和種子 的發(fā)育和重量）。結(jié)果顯示，ZmSPLl-過表達的擬南芥具有增加的植物器官(特別是種子）。具 體地，本發(fā)明人進行ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的表型研究，其中，首先，本發(fā)明人用顯微鏡 觀察授粉后擬南芥種子的形態(tài)，并且用野生型擬南芥(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物作 為對照進行統(tǒng)計分析。從結(jié)果可見，與野生型擬南芥種子相比，ZmS化1轉(zhuǎn)基因擬南芥 (ZmSPLl-OX)更大。運主要體現(xiàn)為巧粒長度。同時，野生型擬南芥(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南 芥植物之間沒有顯著差異。此外，本發(fā)明人研究了種子的發(fā)育和重量。在研究中發(fā)現(xiàn)，成熟 的擬南芥種子主要由胚組成，并且隨著種子發(fā)育，胚乳逐漸降解至消失。因此，在從ZmSPLl 轉(zhuǎn)基因擬南芥植物(ZmS化1-0X)、空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥植物和野生型擬南芥植物(WT)授粉 之后5-9天，本發(fā)明人進一步通過TB0染色（用上述中相同的程序)動態(tài)觀察種子的胚。授粉 后胚的顯微鏡觀察顯示，在授粉后第5天，當(dāng)野生型種子在早屯、階段時，轉(zhuǎn)基因種子仍在球 狀階段;并且在授粉后第9天，野生型種子可幾乎完全填充于種皮內(nèi)，但轉(zhuǎn)基因種子中的胚 具有很大的發(fā)育空間。運些結(jié)果表明，隨著ZmSPLl基因的過表達，擬南芥種子的發(fā)育顯示延 遲，由此導(dǎo)致更大的儲存容量。同時，野生型擬南芥(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥植物之間沒 有顯著差異?？蒞看到，ZmSPLl的過表達可改善重量。其次，本發(fā)明人研究了擬南芥的根系 的發(fā)育，其中對來自ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥植物(ZmSPLl-OX)的兩個植物株系、空載體轉(zhuǎn)化的 擬南芥植物和野生型擬南芥植物(WT)的種子進行發(fā)芽測試(在20°C溫度和16小時光照/8小 時黑暗的光周期）。表型結(jié)果顯示，來自ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的兩個植物株系的種子比 野生型擬南芥種子發(fā)芽更快，并且比野生型擬南芥具有全根系的更高生長速率。第=，本發(fā) 明人研究了擬南芥的葉片大小，其中播種ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥(ZmSPLl-〇X)的種子、空載體 轉(zhuǎn)化的擬南芥的種子和野生型擬南芥種子(WT)(在20°C的溫度和16小時光照/8小時黑暗的 光周期），并且在第25天用顯微鏡觀察葉細胞。在第25天，觀察地上植物部分的表型。結(jié)果顯 示，ZmSPLl過表達的植物的地上部分比野生型植物的地上部分更大。同時，野生型擬南芥植 物(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥植物之間沒有顯著差異。通過進一步研究，發(fā)現(xiàn)地上部分的 擴大主要呈現(xiàn)為蓮座葉面積的增加。從葉表皮細胞的顯微鏡觀察，表明該葉主要由于細胞 數(shù)增加、而不是細胞體積增加而擴大。
[0123] 因此，本發(fā)明人認為本發(fā)明的ZmSPLl基因在控制擬南芥的器官包括種子、根系和 葉中發(fā)揮作用。ZmSPLl基因的過表達可引起上述器官重量增加。在本發(fā)明中，植物器官的大 小可 W 增加約 1%-120%、約10%-110%、約 20%-100%、約 30%-90%、約40%-80%或約 50%-70%，例女曰，植物器官的大小增加約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、 110%、120%或上述范圍內(nèi)的任何值，諸如115%、88%、30%、24%或13%等。
[0124] 為了進一步研究ZmSPLl基因的功能和用途，本發(fā)明人將ZmSPLl基因引入單子葉植 物水稻和玉米并研究它們的表型。類似地，結(jié)果顯示，ZmSPLl基因的過表達增加水稻和玉米 種子的種子大小。
[0125] 對于ZmSPLl基因用相同的技術(shù)和程序，本發(fā)明人從玉米發(fā)現(xiàn)用于控制玉米植物 (諸如擬南芥、玉米和水稻）的另一種ZmSPL2基因，并通過將該基因引入擬南芥、玉米和水稻 表明該基因的過表達也在控制植物器官(尤其是種子大?。┲邪l(fā)揮作用。
[0126] 本發(fā)明中的宿主細胞包括，但不限于，用于介導(dǎo)植物的基因轉(zhuǎn)化的細菌細胞，諸如 根癌農(nóng)桿菌細胞，和用基因轉(zhuǎn)化的植物細胞。
[0127] 根據(jù)本發(fā)明的植物包括，但不限于，單子葉植物和雙子葉植物，包括作物植物(諸 如玉米（Zea mays)、蕓苔屬（Brassica)物種（例如，卷屯、菜型油菜（B.napus)、憲菁 (B.rapa)、芥菜(B. juncea))，特別是可用作巧油的來源的那些蕓苔屬物種，首猜(Medicago sativa)、水稻（0;ryza sativa)、黑麥（Secale cereale)、高梁（Sor曲um bicoloriSor曲um vulgare)、粟（例如珍珠粟（Pennisetum glaucum)、黃米（Panicum miliaceum)、谷子 (Setaria italica)、龍爪稷（Eleusine coracana))、向日葵（Helianthus annuus)、紅花 (Carthamus t inctor ius)、小麥（Tr i t i cum aestivum)、大豆（Glycine max)、煙草 (Nicotiana tabacum)、馬鈴馨（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花（海 島棉（Gossypium barbadense)、陸地棉（Gossypium hirsutum))、甘馨（Ipomoea batatus)、 木馨（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp.)、挪子（Cocos nucifera)、渡蘿（Ananas comosus)、相橘屬果樹（Citrus spp.)、可可仙eobroma cacao)、茶（Came Ilia sinensis)、 香蕉（Musa spp.)、鱷梨（Persea americana)、無花果（Ficus casica)、番石惱（Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、橄攬（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果 (Anacardium occidentale)、澳洲堅果（Macadamia integrifolia)、扁桃樹（Primus amygdalus)、糖用甜菜（Beta vulgaris)、甘薦（Saccharum spp.)、燕麥、草替、藍替、大麥、 蔬菜（諸如番茄化 ycopersicon esculentum)、窩宦（例如 Lactuca sativa)、青豆 (Phaseolus vulgaris)、利馬豆（Phaseolus limensis)、豆宛豆（Lathyrus spp.)和黃瓜屬 (Qicumis)的成員諸如黃瓜(C. sativus)、香瓜（C. cantalupensis)和甜瓜（C.melo)，觀賞植 物（諸如杜酷（Rhododen化on spp.)、八仙花（Macro地ylla hy化angea)、朱穫化ibiscus rosasanensis)、玫瑰（Rosa spp.)、郁金香（Tulipa spp.)、水仙（化rcissus spp.)、矮牽牛 (Petuni曰 hybrid曰）、康乃馨（Di曰nthus c曰ryophyllus)、一品紅（Euphorbi曰 pulcherrim曰） 和菊花(chrysanthemum))。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的植物是作物植物(例如，玉米、 首猜、向日葵、蕓苔屬、大豆、棉花、紅花、花生、高梁、小麥、粟、煙草等）。在一些實施方案中， 優(yōu)選擬南芥、水稻或玉米。
[0128] 包括W下實施例W表明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案的實例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，實施例中公開的技術(shù)是本發(fā)明的最佳模式。然而，鑒于本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)當(dāng)理解，可W對本發(fā)明中公開的具體實施方案進行許多改變，并且在不偏離本發(fā)明的精 神和范圍的情況下仍然可W獲得相像或類似的結(jié)果。
[0129] 除非另有說明，否則W下實施例中使用的實驗方法是本領(lǐng)域中的常規(guī)方法。
[0130] 除非另有說明，否則W下實施例中使用的材料、試劑是商業(yè)可得的。 實施例
[0131] 實施例1.玉米ZmSPLl基因的獲取
[0132] 1.玉米ZmSPLl基因的發(fā)現(xiàn)
[0133] (1)發(fā)現(xiàn)玉米ZmSPLl基因
[0134] 通過對玉米Zong31xP138雜交胚的S甜文庫分析，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雜交種和親本植物 之間的玉米ZmSPLl的表達是不同的，運提示ZmSPLl在胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用。ZmSPLl恰巧與 擬南芥序列中的最長類的AtSPL具有高相似性。本發(fā)明人針對擬南芥AtS化蛋白序列用 tI3LASTn捜索玉米基因組網(wǎng)站中的玉米DNA數(shù)據(jù)庫化ttp : //www.maizesequence . org, http: //www.maizegdb. org)，并使用獲得的基因組序列W用BLASTx捜索玉米EST數(shù)據(jù)庫，并 推導(dǎo)玉米基因組序列的外顯子區(qū)域。通過人工剪接運些序列而獲得最長的cDNA序列（SEQ ID N0:l)〇
[0135] (2)基因的結(jié)構(gòu)分析和染色體定位
[0136] 為了確定由推定基因編碼的蛋白的大小W及起始密碼子和終止密碼子的位置，本 發(fā)明人如下操作：使用來自NCBI的ORE Finder軟件化ttp://www.ncbi .nlm.nih. gov/gorf/ go;rf .html)對玉米ZmSPLl基因的推定cDNA序列進行開放閱讀框(ORE)分析，并用BLASTx確 定正確的閱讀框?；讷@得的基因0RF序列和相應(yīng)的基因組序列，使用基因結(jié)構(gòu)分析軟件 Gene Structure Display Server(http://gsds.cbi .pku.edu.cn/)對獲得的玉米ZmSPLl 基因進行結(jié)構(gòu)分析。
[0137] 用玉米B73基因組圖譜（Schnable，等人，2009)，本發(fā)明人將獲得的序列定位于染 色體上，并在基因組中捜索上游序列。具體地，1)進行基因組BLAST捜索；2)經(jīng)由"基因組視 圖"觀察基因組結(jié)構(gòu)；和3)點擊相應(yīng)的染色體區(qū)域W便通過相應(yīng)區(qū)域的上游和下游基因定 位基因的位置。
[0138] (3)多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)生分析
[0139] 為了分析玉米ZmSPLl基因和擬南芥中的同源基因序列之間的差異，本發(fā)明人首先 使用具有軟件的默認參數(shù)的ClusterW(Thompson，等人，1994)構(gòu)建S化序列的多重序列比對 構(gòu)型。然后，本發(fā)明人將多重序列比對結(jié)果引入GeneDoc化t1:p://www. cris. com-Ketchup/ genedoc. shtml)，并且基于蛋白的多重序列比對結(jié)果，使用MEGA4. UKumar,等人,2004)進 行系統(tǒng)發(fā)生樹校正，W經(jīng)由鄰接法生成擬南芥和玉米的族成員的無根系統(tǒng)發(fā)生樹。
[0140] 2.獲得玉米ZmSPLl基因
[0141 ]從玉米自交系zong31 的根材料（Yang X,Yan J,Shah T.Warburton ML,Li Q,Li L,Gao Y,Chai Y,Fu Z,Zhou Y,Xu S,Bai G,Meng Y,Zheng Y,Li J.Genetic analysis and characterization of a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection.Theor Appl Genet. 2010; 121(3) :417-31,可公開 地得自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)），用化izol試劑總RNA提取試劑盒(DP405-01，TIANGEN)提取RNA:進行 W下步驟:在含有研磨樣品的各管中添加 ImL提取溶液并均勻混合;在室溫下（25°C)5分鐘 之后，添加2(K)化氯仿，均勻混合，并離屯、(4°C，12000rpm) 15分鐘;將等體積的異丙醇加入上 清液并在室溫下放置沉淀30分鐘；離屯、(4°C，12000巧m) 10分鐘之后，棄去上清液，用75%乙 醇洗涂沉淀，然后溶解于100此DEPC處理的雙蒸水中。用R化無 RNase的DNase(M6101， Promega)純化粗RNA:將R化反應(yīng)溶液（lOOmM Tris-肥l，25mM MgS〇4和2.5mM CaCl2，DNAase lOU)加入RNA;在37°C浴中放置30分鐘之后，用等體積的苯酪/氯仿提取;將兩倍體積的無水 乙醇加入上清液，用于沉淀；離屯、(4°C，12000巧m)10分鐘之后，棄去上清液，用75%乙醇洗 涂沉淀，然后溶解于40iil DEPC處理的雙蒸水，由此獲得總RNA。
[0142] 用于cDNA合成的總反應(yīng)體系為20化（含有化g總RNA，50mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，75mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，50皿ol/L dNTPs，50pmol錯定引物 T15: TTTTTTTTTTTTTTT(TAKARA，D510)，20U RNase抑制劑（TAKARA，D2313A)，200U M-MLV逆 轉(zhuǎn)錄酶。'〇111日旨日，11701))。在37°(：下解育2小時之后獲得。0魁。1化。0魁與^下？0?引物用 于PCR反應(yīng)中：L: ATGGAGGCCGCCAGGTTC，R: TTACATGGGTCCACGCTC。
[0143] 參考圖1中顯示的PCR結(jié)果，通過擴增獲得單一 PCR產(chǎn)物，其具有特定3000bp條帶。 通過測序，用于編碼所得PCR產(chǎn)物的基因具有SEQ ID N0:1中所示的核巧酸序列，其中從5' 末端至3'末端具有位置1-2919的核巧酸的編碼區(qū)。該基因被指定為ZmSPLl，并且由該基因 編碼的蛋白被指定為ZmSPLl，其具有如SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列。
[0144] 對特定條帶測序(SEQ ID NO: 1)并確定其染色體定位，發(fā)現(xiàn)所述基因在染色體1上 的l.llBin區(qū)域內(nèi)。接下來，對ZmSPLl-編碼的蛋白的氨基酸序列進行分析，并且在該序列的 N-末端處存在SBP-盒結(jié)構(gòu)域。此外，用MEGA4.1軟件中的N-J方法對玉米和擬南芥S化蛋白進 行同源性評估分析。
[0145] 結(jié)果顯示于圖2中，其顯示ZmSPLl與擬南芥中編碼最長氨基酸序列的一類SPL (AtS化1，AtSPL12)高度相似。
[0146] 3.通過實時巧光定量PCR測量不同植物位點中的ZmSPLl基因表達
[0147] 在Bio-Rad CI 000循環(huán)儀實時PCR系統(tǒng)上進行實時巧光定量PCR測定，并且10化的 反應(yīng)體系含有化L cDNA、0.化M實時定量引物和扣L SYBR Premix Ex hq^RROAlD)。實時 定量引物具有 W 下序列：S化 1 -L: CTGCTCTGGCCCTATTTCTG; SPLl-R: GCATCGCTCCTCAAGGTCT。 來自不同發(fā)育階段的玉米自交系Zong31的11種組織或器官的cDNA用作模板，即，來自播種 階段(8天）的植物的根和葉；來自60天生長的植物的莖、節(jié)間、巷葉、花絲、不成熟的玉米果 穗和雄穗，W及來自授粉后15天的植物的種皮、胚和胚乳。PCR方案如下:在94°C變性5分鐘； 然后在94°C變性10秒，在60°C退火20秒，和在72°C延伸30秒，35個循環(huán);在72°C最終延伸7分 鐘。在65°C-98°C繪制烙解曲線。然后，使用具有手動設(shè)定巧光闊值的比較闊值方法對實時 定量PCR結(jié)果進行定量分析，確定在運種闊值下的特定循環(huán)數(shù)，Ct值，并且基于Ct值計算各 組織或器官的C值，其中C = 2-AGt且A Ct = Ct鵬H-Ct械瞭隹。用雙尾等方差t檢驗(P<0.05)進行 顯著性檢驗。本實驗包括3個生物學(xué)重復(fù)。
[0148] W玉米 18S rRNA基因作為對照，引物序列是LACATGCGCCTAAGGAGAAATAG;R: ACCTCCATGCTCACTGGTACTT 〇
[0149] 根據(jù)如圖3中所示的結(jié)果，ZmSPLl顯示在不同的組織或器官之間的表達水平的顯 著變化。ZmS化1基因在未成熟的玉米果穗和雄穗中具有最高的表達水平，并且在正在發(fā)育 的胚、胚乳、種皮、根和花絲中具有非常低的表達水平。
[0150] 實施例2. ZmSPLl基因的使用
[0151 ] 通過Gateway技術(shù)，構(gòu)建玉米ZmSPLl基因的過表達載體。大腸桿菌菌株是D冊a且農(nóng) 桿菌菌株是GV3101。
[0152] 1.過表達載體的構(gòu)建
[0153]通過Gateway技術(shù)，根據(jù)W下程序構(gòu)建載體:將gateway BP反應(yīng)接頭并至引物的5' 末端，通過PCR擴增獲得具有接頭序列的祀基因片段，經(jīng)由瓊脂糖凝膠回收產(chǎn)物，W特定比 率混合回收的產(chǎn)物與載體PD0NR221，并且在BP Clonase?酶的催化下，將祀基因取代入 PD0NR221載體。構(gòu)建的載體是進入載體。然后，采取W下步驟：W特定比率混合構(gòu)建的含有 祀基因的進入載體與目的載體，并且在LR Clonase?酶的催化下，將進入載體中含有的祀基 因取代入目標(biāo)載體，從而獲得含有祀基因的表達載體。
[0154] (1)BP 反應(yīng)
[0155] BP反應(yīng)體系：
[0156]
[0157] 將反應(yīng)在25。(：浴中溫?zé)?6小時。
[0158] BP反應(yīng)祀基因克隆的篩選和鑒定
[0159] a.用化1 BP反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a的感受態(tài)細胞，并在37°C顛倒培養(yǎng)16小時 (在kan抗性培養(yǎng)基中）；
[0160] b.挑取單一克隆，并在37°C在振蕩下W20化pm培養(yǎng)(添加50ug/m化an);
[0161] C.提取質(zhì)粒，并用基因特異性引物（L:ATGGAGGCCGCCAGGTTC和R: TTACATGGGTCCACGCTC)擴增W獲得擴增產(chǎn)物；
[0162] d.對擴增產(chǎn)物測序，并與原始序列進行比較。其擴增產(chǎn)物具有SEQ ID NO: 1的序列 的質(zhì)粒是進入載體BP質(zhì)粒。
[0163] (2)LR 反應(yīng)
[0164] 使用獲得的玉米ZmSPLl基因的進入載體進行LR反應(yīng)，其中反應(yīng)體系如下：
[01 化]
[0166]
[0167] 在25°C浴中溫?zé)?6小時。
[0168] LR反應(yīng)祀基因克隆的篩選和鑒定
[0169] (1)用化1 LR反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a的感受態(tài)細胞，并在37°C顛倒培養(yǎng)12-16 小時(在壯觀霉素抗性培養(yǎng)基中）；
[0170] (2)挑取單一克隆，并在37°C在振蕩下W180-20化pm培養(yǎng)（添加50ug/ml壯觀霉 素)；
[0171] ( 3 )提取質(zhì)粒，并用基因特異性引物（L : ATGGAGGCCGCCAGGTTC和R : TTACATGGGTCCACGCTC)擴增W獲得擴增產(chǎn)物。
[0172] 對擴增產(chǎn)物測序。具有SEQ ID NO: 1的序列的質(zhì)粒是通過用Gateway?技術(shù)將SEQ ID NO: 1的序列插入地2GW7質(zhì)粒而獲得的過表達載體。該質(zhì)粒被指定為地2GW7-ZmSPLl。
[0173] 2. ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥的制備
[0174] (1)農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備
[01巧]a .將根癌農(nóng)桿菌GV3101 的單一菌落化ctopic overexpression of wheat TaSrg6gene confers water stress tolerance in Arabidopsis.Tong SM,Ni ZF,Peng HR, Dong GQ, Sun QX.2007,172(6): 1079-1086,可公開地得自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）挑取至3ml Y邸液體培養(yǎng)基(含有相應(yīng)的抗生素，lOOiig/ml Rif)中，并在28°C振蕩培養(yǎng)過夜；
[0176] b.將50化1過夜培養(yǎng)的細菌液體接種于50ml Y邸液體培養(yǎng)基(含有相應(yīng)的抗生素） 中，并在28 °C振蕩培養(yǎng)，直至達到0.5的OD600 ;
[0177] C. W5000巧m離屯、5分鐘；
[017引 d.添加10ml 0.15mmol/L NaClW懸浮農(nóng)桿菌細胞，并W5000巧m離屯、5分鐘；
[0179] e.將細胞懸浮于1ml預(yù)冷的20mmol/L化Cl2中，并儲存于冰浴中，直至在24小時內(nèi) 使用，或細分成20化1/管;在液氮中快速冷凍1分鐘，并在-80°C下儲存，直至使用。
[0180] (2)陽性農(nóng)桿菌克隆的制備和鑒定。
[0181 ] a.將20化1感受態(tài)細胞在冰上緩慢解凍30分鐘；
[0182] b.添加化g構(gòu)建的質(zhì)粒地2GW7-ZmSPLl，并置于冰上30分鐘；
[01削 C.在液氮中快速冷凍2分鐘，在37 °C水浴中放置5分鐘，并在冰上放置2分鐘；
[0184] d.然后加入1ml Y邸培養(yǎng)基，并在28°C緩慢振蕩培養(yǎng)4小時；
[01化]e. W4000巧m離屯、5分鐘，并棄去上清液90化1;
[01化]f.將剩余液體鋪于含有50iig/ml壯觀霉素和10化g/ml Rif的Y邸板，并在28°C培養(yǎng) 2天；
[0187] g.挑取在該板上生長的單一菌落，Wl:50的比率接種于Y邸液體培養(yǎng)基(含有50y g/ml壯觀霉素和10化g/ml Rif)中，并在28°C振蕩培養(yǎng)過夜。
[0188] 從重組細菌提取質(zhì)粒，并用基因特異性引物化：ATGGAGGCCGCCAGGTTC和R: TTACATGGGTCCACGCTC)擴增W獲得3000bp產(chǎn)物，其為陽性重組細菌，且其被指定為GV3101 / pB2GW7-ZmSPLl。
[0189] (3)擬南芥的轉(zhuǎn)化
[0190] a.將Columbia野生型擬南芥（col-0,Yao Y，Ni Z,Du J,Han Z,化en Y,Zhang Q, Sun Q.Ectopic overexpression of wheat adenosine diphosphate-ribosylation factor,TaARF, increases growth rate in Arabidopsis.J Integr Plant Biol.2009,51 (1):35-44,可公開地得自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）（W下稱為野生型擬南芥)在4°C春化處理72小時， 播種于MS培養(yǎng)基中并在20°C在60%濕度的培養(yǎng)室中W16小時光照/8小時黑暗光周期進行 培養(yǎng);生長至具有兩個真葉之后，將幼苗移植于含有相等比率的營養(yǎng)±和賠石的混合物的 種植盆中。
[0191] b.開花之后，切割樹枝的尖端W促進側(cè)枝的發(fā)育。修剪之后6天內(nèi)，準(zhǔn)備植物用于 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；
[0192] C.將農(nóng)桿菌GV3101/pB2GW7-ZmSPLl接種于含有5ml YEB+100μg/ml SP+100μg/ml 利福平的培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜，并在第二天轉(zhuǎn)移至500ml Y邸液體培養(yǎng)基中，用于在28 °C培養(yǎng)，直至0〇6日日約為0.8;
[0193] d.通過離屯、收集菌體，并將農(nóng)桿菌細菌懸浮于轉(zhuǎn)化緩沖液中。修剪之后4天，將植 物顛倒浸潰于轉(zhuǎn)化緩沖液中；
[0194] e.取種植板，并用填充空氣的黑色塑料袋包裹，水平放置;在2(TC在黑暗中培養(yǎng)24 小時之后，移除塑料袋，并使種植盆直立。在正常光照和溫度條件下培養(yǎng)植物，直至播種。收 獲ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥的成熟To種子。
[01M] (4)篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性幼苗
[0196] 制備MS板，無菌處理ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥的To種子，然后用無菌水洗涂6次；將種 子鋪于選擇性MS培養(yǎng)基（125iil/L Basta)上，在4°C春化處理3天之后，轉(zhuǎn)移至20°C和16小時 光照/8小時黑暗光周期的溫室，并在7天培養(yǎng)之后選擇陽性植物。陽性植物具有W下特征： 深綠色的健康真葉和伸展入培養(yǎng)基中的根。
[0197] 從通過上述初始篩選獲得的陽性植物提取基因組DNA，用基因特異性引物化： ATGGAGGCCGCCAGGTTC和 R:TTACATGGGTCCACGCTC)擴增 W 獲得 3000bp 產(chǎn)物，運意味著其為 ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性To植物?？偣搏@得90個ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性To植物。
[0198] 將上述ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性To植物轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)基，10天之后移植入± 壤，并在50天生長之后收獲Ti種子。W相同方法培養(yǎng)和篩選Ti種子，移植并W3:l的分離比從 各植物收獲T2種子。每種植物株系培養(yǎng)10個植物并W相同的方式篩選W獲得未分離的純株 系，由此獲得ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物。
[0199] 類似地，將空載體PB2GW7轉(zhuǎn)化入野生型擬南芥，W獲得空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥To植 物。提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，并用基因特異性引物化:ATGGAGGCCGCCAGGTTC和R: TTACATGGGTCCACGCTC)擴增。沒有獲得祀片段，運意味著其為陽性空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥。類 似地，收獲和播種之后，最終獲得空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物。
[0200] 3. ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型研究
[0201] 1)種子研究
[0202] (1)對授粉后的擬南芥種子的形態(tài)學(xué)的顯微觀察。
[0203] a.將授粉后7天的ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥(ZmSPLl-OX)的T2種子置于50%FAA固定液 中，直至使用。
[0204] b.從FAA固定液移取種子，并連續(xù)置于70 %、85 %和95 %乙醇中，各自持續(xù)30分鐘， 然后轉(zhuǎn)移至100%乙醇中脫水3次，每次1小時，并且最后一次過夜。
[0205] C.第二天，將所述種子置于100%乙醇和冬青油的混合物（1:1)中1小時，然后轉(zhuǎn)移 至冬青油用于澄清3次，每次1小時，并且最后一次超過1天。
[0206] d.甲苯胺藍染色:在甲苯胺藍工作液中染色3分鐘，在95%乙醇中分離顏色1分鐘， 兩次，在100%乙醇中脫水并在冬青油中澄清。
[0207] e.用加拿大樹脂固定，并且干燥之后，在Nikon Ti微分干設(shè)相差顯微鏡上觀察漿 片的形狀和輪廓W及中央細胞結(jié)構(gòu)并拍照。
[0208] 野生型擬南芥(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物用作對照，每種植物株系評估30 個種子，該實驗重復(fù)=次，并將結(jié)果平均化。
[0209] 結(jié)果顯示于圖4a中。可W看到，與野生型擬南芥種子相比，ZmS化1轉(zhuǎn)基因擬南芥 (ZmSPLl-〇X)的T2種子更大。運主要體現(xiàn)于粒長(在顯微鏡的11.5的放大率下）。
[0210] 統(tǒng)計學(xué)定量粒長和粒寬。根據(jù)圖4b中所示的結(jié)果，ZmS化1轉(zhuǎn)基因擬南芥的T2種子 (ZmSPLl-〇X)和野生型擬南芥種子(WT)分別具有0.809和0.645mm的粒長，和0.4103和 0.352mm的粒寬。
[0211] 野生型擬南芥(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物之間沒有顯著差異。
[0212] (2)種子發(fā)育和種子重量
[0213] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)成熟的擬南芥種子主要由胚組成，并且隨著種子發(fā)育，胚乳逐漸降解至 消失。因此，在從ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmSPLl-OX)、空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物和野 生型擬南芥植物(WT)授粉之后5-9天，本發(fā)明人進一步通過TB0染色（用上述步驟(1)中相同 的程序)動態(tài)觀察種子的胚。
[0214] 授粉后胚的形態(tài)觀察結(jié)果顯示于圖5a中。在授粉后第5天，當(dāng)野生型種子在早屯、階 段時，轉(zhuǎn)基因種子仍在球狀階段;并且在授粉后第9天，野生型種子幾乎完全填充于種皮內(nèi)， 但轉(zhuǎn)基因種子中的胚仍具有很大的發(fā)育空間。運些結(jié)果表明，隨著ZmSPLl基因的過表達，擬 南芥種子的發(fā)育顯示延遲，因此種子中存在更大的儲存容量。
[0215] 圖化顯示產(chǎn)量的統(tǒng)計結(jié)果(每種植物株系3個植物），并將實驗重復(fù)3次。將結(jié)果進 行平均化。
[0216] 結(jié)果顯示：
[0217] 對于ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，每個植 物的總產(chǎn)量分別為0.1256g和0.0669g;
[0218] 對于ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，每芙的 種子數(shù)分別為68.67和55.5;
[0219] 對于ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，每個植 物的芙數(shù)分別為209.857和167.3;
[0220] 對于ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，每芙的 粒重分別為0. 〇〇1467g和0.001125邑。
[0221] 野生型擬南芥植物(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物之間沒有顯著差異。
[02剖所W，可W看到，ZmSPLl的過表達可增加重量。
[02剖 2)根系的發(fā)育
[0224] 對來自ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmSPLl-〇X)的兩個植物株系ZmSPLl-OX-1和 ZmSPLl-OX-2、空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物和野生型擬南芥植物(WT)的種子進行發(fā)芽測試 (在20°C溫度和16小時光照/8小時黑暗的光周期）。
[0225] 表型結(jié)果顯示于圖6a，其中圖中的S行代表在播種后第2天、第7天和第14天獲得 的結(jié)果?？蒞看到，ZmSPLl-OX-巧日ZmSPLl-OX-2種子比野生型擬南芥種子發(fā)芽更快，比野生 型擬南芥具有全根系的更高生長速率。
[0226] 統(tǒng)計學(xué)定量主根長度、側(cè)根數(shù)和根鮮重。每種植物株系3個植物，并重復(fù)實驗3次。 將結(jié)果進行平均化。
[0227] 結(jié)果顯示于圖化中（第14天的主根長度未顯示）。
[0228] 在第 1-9 天，ZmS 化 1-0X-1 具有分別 0.168125、0.675833、0.950833、1.258889、 1.53125、1.705、2.041667、2.329167 和 2.9cm 的主根長度；
[0229] 在第 1-9 天，ZmS 化 1-0X-2 具有分別0.145、0.68、1.01、1.16667、1.525、1.6667、 2.125、2.65和3.2畑1的主根長度；
[0230] 在第 1-9 天，WT 具有分別0、0.305、0.620833、0.866667、1.016667、1.155556、 1.544、1.7和1.85cm的主根長度；
[0231] 在第14天，ZmSPLl-OX-1和WT具有分別4.15和3.09cm的主根長度；
[0232] 在第14天，ZmSPLl-OX-1和WT具有分別0.0477和0.0415g的總根鮮重；
[0233] 在第14天，21115?1^-0乂-巧抓1'具有分別15.33和12.17的側(cè)根數(shù)。
[0234] 野生型擬南芥植物(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物之間沒有顯著差異。
[02對所W，可W看到，ZmSPLl的過表達增加主根長度、側(cè)根數(shù)和根鮮重。
[0236] 3)葉
[0237] 播種ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥(ZmSPLl-OX)的T2種子、空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥的T2種子和 野生型擬南芥種子(WT)(在20°C的溫度和16小時光照/8小時黑暗的光周期）。
[0238] 同時，根據(jù)W下具體程序在第25天顯微鏡觀察葉細胞：
[0239] a)在水中煮沸擬南芥的鮮葉W殺死細胞，然后倒出具有溶解顏料的水；
[0240] b)將材料轉(zhuǎn)入95%乙醇，并煮沸，直至組織完全稱色(約1小時）；
[0241] C)將仍然溫?zé)?、稱色的材料置于預(yù)熱至96°C的85%乳酸中，并在8分鐘之后獲得透 明的組織材料；
[0242] d)在室溫將透明材料轉(zhuǎn)入85%乳酸中，并儲存，直至用于固定；
[0243] e)固定和觀察：取透明處理的擬南芥葉并用吸水紙吸干過量的乳酸，然后用乙二 醇固定，并在顯微鏡下觀察。
[0244] 在第25天，研究地上植物部分的表型。結(jié)果顯示于圖7a中，其中第一、第二和第S 行代表在第25天的野生型和ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥的地上部分、蓮座葉和葉細胞。可W看到， ZmSPLl過表達的植物的地上部分比野生型植物的地上部分更大。
[0245] 統(tǒng)計學(xué)定量第25天的蓮座葉的葉面積、葉數(shù)和葉細胞數(shù)。葉面積的測量可W通過 本領(lǐng)域中已知的任何常規(guī)方法(如網(wǎng)格點法、方格紙法和紙稱重法)來進行，或者葉面積可 W用葉面積儀諸如來自LI-C0R的LAI-3100面積儀來測量。一些葉面積預(yù)測模型也可用于測 量葉面積（參見，例如Sezer I,Oner F,Mut Z.,Non-destructive leaf area measurement in maize(Zea mays L.),J Environ Biol.2009 Sep;30(5Suppl):785-90)。葉數(shù)目可通過 直接計數(shù)來確定，或者可W根據(jù)單面葉脈數(shù)來估計。葉細胞數(shù)可W通過本領(lǐng)域中眾所周知 的流式細胞術(shù)來測量。每種植物株系測量3個植物，并重復(fù)實驗3次。將結(jié)果進行平均化。
[0246] 結(jié)果顯示于圖7b中。
[0247] 對于ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，蓮座葉 的葉面積分別為5.338和2.558cm2;
[0248] 對于ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，蓮座葉 的細胞數(shù)/每面積單位分別為8.98和9.23;
[0249] 對于ZmSPLl轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化1-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，蓮座葉 的葉細胞數(shù)分別為47.94xl03和23.61xl03。
[0250] 野生型擬南芥植物(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物之間沒有顯著差異。
[0251] 通過進一步研究，發(fā)現(xiàn)地上部分的擴大主要由于蓮座葉面積的增加引起。通過葉 表皮細胞的顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)該葉主要由于細胞數(shù)增加、而不是細胞體積增加而擴大。
[0252] 實施例3.玉米ZmSPL2基因的獲取
[0253] 1.玉米ZmSPL2基因的發(fā)現(xiàn)
[0254] (1)發(fā)現(xiàn)玉米ZmSPL2基因
[0巧日]通過對玉米Zong31xP138雜交胚的S甜文庫分析，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雜交種和親本植物 之間的玉米ZmSPL2的表達存在差異，運提示ZmSPL2在胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用。ZmSPL2恰巧與 擬南芥序列中的最長類的AtSPL具有高相似性。采取W下步驟:針對擬南芥AtSPL蛋白序列 用tBLASTn捜索玉米基因組網(wǎng)站中的玉米DNA數(shù)據(jù)庫化ttp : //ww.maizesequence . org, http://www.maizeg化.o巧），并使用獲得的基因組序列W便用BLASTx捜索玉米EST數(shù)據(jù)庫， 并推導(dǎo)玉米基因組序列的外顯子區(qū)域。通過人工剪接運些序列而獲得最長的cDNA序列（SEQ ID N0:3)〇
[0256] (2)基因的結(jié)構(gòu)分析和染色體定位
[0257] 為了確定推定基因編碼的蛋白的大小W及起始密碼子和終止密碼子的位置，使用 來自 NCBI 的0RF Finder軟件化ttp: //ww. ncbi . nlm. n;Lh. gov/gorf/go;rf. html)對玉米 ZmSPL2基因的推定cDNA序列進行開放閱讀框(ORF)分析，并用BLASTx確定正確的閱讀框?；?于獲得的基因0RF序列和相應(yīng)的基因組序列，使用基因結(jié)構(gòu)分析軟件Gene Structure Display Se;rveHht1:p: //gsds . cbi .pku. edu. cn/)對獲得的玉米ZmSPL2基因進行結(jié)構(gòu)分 析。
[0258] 用玉米B73基因組圖譜，將獲得的序列定位于染色體上，并捜索基因組中的上游序 列。具體地，采取W下步驟：1)進行基因組化AST捜索；2)經(jīng)由"基因組視圖"觀察基因組結(jié) 構(gòu);和3)點擊相應(yīng)的染色體區(qū)域W便通過相應(yīng)區(qū)域的上游和下游基因定位基因的位置。
[0259] (3)多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)生分析
[0260] 為了分析玉米ZmSPL2基因和擬南芥中的同源基因序列之間的差異，本發(fā)明人首先 使用具有軟件的默認參數(shù)的ClusterW(Thompson，等人，1994)構(gòu)建S化序列的多重序列比對 構(gòu)型。然后，采取W下步驟：將多重序列比對結(jié)果引入6日11日0〇(3(111：19://冊￥.(31'13.(3〇111- Ketchup/genedoc. shtml)，并且基于蛋白的多重序列比對結(jié)果，使用MEGA4. UKumar,等人， 2004)進行系統(tǒng)發(fā)生樹校正，W經(jīng)由鄰接法生成擬南芥和玉米的族成員的無根系統(tǒng)發(fā) 生樹。
[0%1] 2.獲得玉米ZmSPL2基因
[0262]從玉米自交系zong31 的根材料（Yang X,Yan J,Shah T.Warburton ML,Li Q,Li L,Gao Y,Chai Y,Fu Z,Zhou Y,Xu S,Bai G,Meng Y,Zheng Y,Li J.Genetic analysis and characterization of a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection.Theor Appl Genet. 2010; 121(3) :417-31,可公開 得自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)），用化izol試劑總RNA提取試劑盒化P405-01，TIANGEN)提取RNA:并且采 取W下步驟:在含有研磨樣品的各管中添加 ImL提取溶液并均勻混合;在室溫下（25°C)5分 鐘之后，添加20化1氯仿，均勻混合，并離屯、(4°C，12000巧m) 15分鐘;將等體積的異丙醇加入 上清液并在室溫下放置沉淀30分鐘；離屯、(4°C，12000巧m) 10分鐘之后，棄去上清液，用75% 乙醇洗涂沉淀，然后溶解于lOOyl DEPC處理的雙蒸水中。用R化無 RNase的DNase(M6101， Promega)純化粗RNA:將R化反應(yīng)溶液（lOOmM Tris-肥l，25mM MgS〇4和2.5mM CaCl2，DNAase lOU)加入RNA;在37°C浴中放置30分鐘之后，用等體積的苯酪/氯仿提取;將兩倍體積的無水 乙醇加入上清液，用于沉淀；離屯、(4°C，12000巧m)10分鐘之后，棄去上清液，用75%乙醇洗 涂沉淀，然后溶解于40iil DEPC處理的雙蒸水，由此獲得總RNA。 惦創(chuàng)用于cDNA合成的總反應(yīng)體系為20化（含有化g總RNA，50mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，75mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，50皿日I/L dNTPs，50pmol錯定引物 T15: TTTTTTTTTTTTTTT(TAKARA，D510)，20U RNase抑制劑（TAKARA，D2313A)，200U M-MLV逆 轉(zhuǎn)錄酶（Pr〇mega，M1701))。在37°C下解育2小時之后獲得cDNAJ化cDNA與PCR引物化： ATGCAGAGGGAGGTGGGC; R: TTATATTGTACCGTAATCCAGC)用于 PCR 反應(yīng)中。
[0264] 根據(jù)圖8中顯示的PCR結(jié)果，通過擴增獲得單一 PCR產(chǎn)物，其具有特定3000bp條帶。 通過測序，用于編碼所得PCR產(chǎn)物的基因具有SEQ ID N0:3中所示的核巧酸序列，其中從5' 末端至3'末端具有位置1-3339的核巧酸的編碼區(qū)。該基因被指定為ZmSPL2,并且由該基因 編碼的蛋白被指定為ZmSPL2,其具有如SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列。
[0265] 對特定條帶測序（SEQ ID N0:3)并確定其染色體定位，發(fā)現(xiàn)其在染色體4上的 4.08Bin區(qū)域內(nèi)。接下來，對ZmSPL2-編碼的蛋白的氨基酸序列進行分析，并且結(jié)果是在該序 列的N-末端處存在SBP-盒結(jié)構(gòu)域。此外，用MEGA4.1軟件中的N-J方法對玉米和擬南芥S化蛋 白進行同源性評估分析。
[0266] 結(jié)果顯示于圖9中，其顯示ZmSPL2與擬南芥中編碼最長氨基酸序列的一類SPL (AtSPLA，AtS化16)高度相似。
[0%7] 3.通過實時巧光定量PCR測量不同植物位點中的ZmSPL2基因表達
[0268] 在Bio-Rad CI 000循環(huán)儀實時PCR系統(tǒng)上進行實時巧光定量PCR測定，并且10化的 反應(yīng)體系含有化L cDNA、0.化M實時定量引物和扣L SYBR Premix Ex hq^RROAlD)。實時 定量引物具有 W 下序列：S化2-L: CTGCTCTGGCCCTATTTCTG SPL2-R: GCATCGCTCCTCAAGGTCT。 來自不同發(fā)育階段的玉米自交系Zong31的11種組織或器官的cDNA用作模板，即，來自播種 階段(8天）的植物的根和葉；來自60天生長的植物的莖、節(jié)間、巷葉、花絲、不成熟的玉米果 穗和雄穗，W及來自授粉后15天的植物的種皮、胚和胚乳。PCR方案如下:在94°C變性5分鐘； 然后在94°C變性10秒，在60°C退火20秒，和在72°C延伸30秒，35個循環(huán);在72°C最終延伸7分 鐘。在65°C-98°C繪制烙解曲線。然后，使用具有手動設(shè)定巧光闊值的比較闊值方法對實時 定量PCR結(jié)果進行定量分析，確定在運種闊值下的特定循環(huán)數(shù)，Ct值，并且基于Ct值計算各 組織或器官的C值，其中C = 2^a且Act = Ct鵬H-Ct械瞭隹，用用雙尾等方差t檢驗(P<0.05)進 行顯著性檢驗。本實驗包括3個生物學(xué)重復(fù)。
[0269] 玉米 18S rRNA基因用作對照，引物序列是L:ACATGCGCCTAAGGAGAAATAG;R:ACCTCC ATGCTCACTGGTACTTo
[0270] 根據(jù)圖10中所示的結(jié)果，ZmSPL2顯示在不同的組織或器官之間的表達水平的顯著 變化。ZmSPL2基因在未成熟的玉米果穗和雄穗中具有最高的表達水平，并且在正在發(fā)育的 胚、胚乳、種皮、根和花絲中具有非常低的表達水平。
[0271] 實施例4.ZmSPL2基因的使用
[0272] 通過Gateway技術(shù)，構(gòu)建玉米ZmSPL2基因的過表達載體。大腸桿菌菌株是D冊a且農(nóng) 桿菌菌株是GV3101。
[0273] 1.過表達載體的構(gòu)建
[0274] 通過Gateway技術(shù)，根據(jù)W下程序構(gòu)建載體:將gateway BP反應(yīng)接頭并至引物的5' 末端，通過PCR擴增獲得具有接頭序列的祀基因片段，經(jīng)由瓊脂糖凝膠回收產(chǎn)物，W特定比 率混合回收的產(chǎn)物與載體PD0NR221，并且在BP Clonase?酶的催化下，將祀基因取代入 PD0NR221載體。構(gòu)建的載體是進入載體。然后，本發(fā)明人如下操作特定比率混合構(gòu)建的 含有祀基因的進入載體與目的載體，并且在LR Clonase?酶的催化下，將進入載體中含有的 祀基因取代入目標(biāo)載體，從而獲得含有祀基因的表達載體。
[0275] (1)BP 反應(yīng)
[0276] BP反應(yīng)體系：
[0277]
[027引將反應(yīng)在25°C浴中溫?zé)?6小時。
[0279] BP反應(yīng)祀基因克隆的篩選和鑒定
[0280] a.用化1 BP反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a的感受態(tài)細胞，并在37°C顛倒培養(yǎng)16小時 (在kan抗性培養(yǎng)基中）；
[0281 ] b.挑取單一克隆，并在37°C在振蕩下W200巧m培養(yǎng)(添加50ug/ml Kan);
[0282] c.提取質(zhì)粒，并用基因特異性引物（L:ATGCAGAGGGAGGTGGGC和R: TTATATTGTACCGTAATCCAGC)擴增 W 獲得擴增產(chǎn)物；
[0283] d.對擴增產(chǎn)物測序，并與原始序列進行比較。其擴增產(chǎn)物具有SEQ ID N0:3的序列 的質(zhì)粒是進入載體BP質(zhì)粒。
[0284] (2)LR 反應(yīng)
[0285] 使用獲得的玉米ZmSPL2基因的進入載體進行LR反應(yīng)，其中反應(yīng)體系如下：
[0286]
[0287] 在25°C浴中溫?zé)?6小時。
[0288] LR反應(yīng)祀基因克隆的篩選和鑒定
[0289] (1)用化1 LR反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a的感受態(tài)細胞，并在37°C顛倒培養(yǎng)12-16 小時(在壯觀霉素抗性培養(yǎng)基中）；
[0290] (2)挑取單一克隆，并在37°C在振蕩下W180-20化pm培養(yǎng)（添加50ug/ml壯觀霉 素)；
[0291] (3)提取質(zhì)粒，并用基因特異性引物化：416〔4646664661666(：和尺： TTATATTGTACCGTAATCCAGC)擴增 W 獲得擴增產(chǎn)物。
[0292] 對擴增產(chǎn)物測序。具有SEQ ID NO: 3的序列的質(zhì)粒是通過用Gateway?技術(shù)將SEQ ID ^:3的序列插入地26￥7質(zhì)粒而獲得的過表達載體。該質(zhì)粒被指定為地26￥7-21115口1^2。
[0巧3] 2.ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥的制備
[0294] (1)農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備
[02巧]a .將根癌農(nóng)桿菌GV3101 的單一菌落化ctopic overexpression of wheat TaSrg6gene confers water stress tolerance in Arabidopsis.Tong SM,Ni ZF,Peng HR, Dong GQ, Sun QX.2007,172(6): 1079-1086,可公開地得自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）挑取至3ml Y邸液體培養(yǎng)基(含有相應(yīng)的抗生素，lOOiig/ml Rif)中，并在28°C振蕩培養(yǎng)過夜；
[0296] b.將50化1過夜培養(yǎng)的細菌液體接種于50ml Y邸液體培養(yǎng)基(含有相應(yīng)的抗生素） 中，并在28 °C振蕩培養(yǎng)，直至達到0.5的OD600 ;
[0297] C. W5000巧m離屯、5分鐘；
[0巧引 d.添加10ml 0.15mmol/L NaClW懸浮農(nóng)桿菌細胞，并W5000巧m離屯、5分鐘；
[0299] e.將細胞懸浮于1ml預(yù)冷的20mmol/L化Cl2中，并儲存于冰浴中，直至在24小時內(nèi) 使用，或細分成20化1/管;快速冷凍于液氮中，持續(xù)1分鐘，并在-80°C下儲存，直至使用。
[0300] (2)陽性農(nóng)桿菌克隆的制備和鑒定。
[0301 ] a.將20化1感受態(tài)細胞在冰上緩慢解凍30分鐘；
[0302] b.添加化g構(gòu)建的質(zhì)粒地2GW7-ZmSPL2，并置于冰上30分鐘；
[0303] C.在液氮中快速冷凍2分鐘，在37 °C水浴中放置5分鐘，并在冰上放置2分鐘；
[0304] d.然后加入1ml YEB培養(yǎng)基，并在28C緩慢振蕩培養(yǎng)4小時；
[03化]e. W4000巧m離屯、5分鐘，并棄去上清液90化1;
[0306] f.將剩余液體鋪于含有50iig/ml壯觀霉素和10化g/ml Rif的Y邸板，并在28°C培養(yǎng) 2天；
[0307] g.挑取在該板上生長的單一菌落，Wl:50的比率接種于Y邸液體培養(yǎng)基(含有50y g/ml壯觀霉素和10化g/ml Rif)中，并在28°C振蕩培養(yǎng)過夜。
[030引從重組細菌提取質(zhì)粒，并用基因特異性引物化：ATGCAGAGGGAGGTGGGC和R: TTATATTGTACCGTAATCCAGC)擴增 W獲得3000bp產(chǎn)物，其代表被指定為GV3101/pB2GW7- ZmSPL2的陽性重組細菌。
[0309] (3)擬南芥的轉(zhuǎn)化
[0310] a.將Columbia野生型擬南芥（col-0,Yao Y，Ni Z,Du J,Han Z,化en Y,Zhang Q, Sun Q.Ectopic overexpression of wheat adenosine diphosphate-ribosylation factor,TaARF, increases growth rate in Arabidopsis.J Integr Plant Biol.2009,51 (1):35-44,可公開地得自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）（W下稱為野生型擬南芥)在4°C春化處理72小時， 播種于MS培養(yǎng)基中并在20°C在60%濕度的培養(yǎng)室中W16小時光照/8小時黑暗光周期進行 培養(yǎng);生長至具有兩個真葉之后，將幼苗移植于含有相等比率的營養(yǎng)±和賠石的混合物的 種植盆中。
[0311] b.開花之后，切割樹枝的尖端W促進側(cè)枝的發(fā)育。修剪之后6天內(nèi)，準(zhǔn)備植物用于 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；
[0312] C.將農(nóng)桿菌GV3101/pB2GW7-ZmSPL2接種于含有5ml YEB+100μg/ml SP+100μg/ml 利福平的培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜，并在第二天轉(zhuǎn)移至500ml Y邸液體培養(yǎng)基中，用于在28 °C培養(yǎng)，直至0〇6日日為約0.8;
[0313] d.通過離屯、收集菌體，并將農(nóng)桿菌細菌懸浮于轉(zhuǎn)化緩沖液中。修剪之后4天，將植 物顛倒浸潰于轉(zhuǎn)化緩沖液中；
[0314] e.取種植板，并用填充空氣的黑色塑料袋包裹，水平放置;在2(TC在黑暗中培養(yǎng)24 小時之后，移除塑料袋，并使種植盆直立。在正常光線和溫度條件下培養(yǎng)植物，直至播種。收 獲ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥的成熟To種子。
[0315] (4)篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性幼苗
[0316]制備MS板，無菌處理ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥的T刷子，然后用無菌水洗涂6次；將種 子鋪于選擇性MS培養(yǎng)基（125iil/L Basta)上，在4°C春化處理3天之后，轉(zhuǎn)移至20°C和16小時 光線/8小時黑暗光周期的溫室，并在7天培養(yǎng)之后選擇陽性植物。陽性植物具有W下特征： 深綠色的健康真葉和伸展入培養(yǎng)基中的根。
[0317] 從通過上述初始篩選獲得的陽性植物提取基因組DNA，用基因特異性引物化： ATGCAGAGGGAGGTGGGC 和 R:TTATATTGTACCGTAATCCAGC)擴增 W 獲得 3000bp 產(chǎn)物，運表明其為 ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性To植物。總共獲得100個ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性To植物。
[0318] 將上述ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性To植物轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)基，10天之后移植入± 壤，并在50天生長之后收獲Ti種子。W相同方法培養(yǎng)和篩選Ti種子，移植并W3:l的分離比從 各植物收獲T2種子。每種植物株系培養(yǎng)10個植物并W相同的方式篩選W獲得未分離的純株 系，由此獲得ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物。
[0319] 使用相同程序，將空載體PB2GW7轉(zhuǎn)化入野生型擬南芥，W獲得空載體轉(zhuǎn)化的擬南 芥To植物。提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，并用基因特異性引物化:ATGCAGAGGGAGGTGGGC和 R: TTATATTGTACCGTAATCCAGC)擴增。沒有獲得祀片段，運表明其為陽性空載體轉(zhuǎn)化的擬南 芥。類似地，收獲和播種之后，最終獲得空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物。
[0320] 3.ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型研究
[0321] 1)種子研究
[0322] (1)對授粉后的擬南芥種子的形態(tài)學(xué)的顯微觀察。
[0323] a.將授粉后7天的ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥(ZmSPL2-0X)的T2種子置于50%FAA固定液 中，直至使用。
[0324] b.從FAA固定液移取種子，并連續(xù)置于70 %、85 %和95 %乙醇中，各自持續(xù)30分鐘， 然后轉(zhuǎn)移至100%乙醇中脫水3次，每次1小時，并且最后一次過夜。
[0325] C.第二天，將所述種子置于100%乙醇和冬青油的混合物（1:1)中1小時，然后轉(zhuǎn)移 至冬青油用于澄清3次，每次1小時，并且最后一次超過1天。
[03%] d.甲苯胺藍染色:在甲苯胺藍工作液中染色3分鐘，在95%乙醇中分離顏色1分鐘， 兩次，在100%乙醇中脫水并在冬青油中澄清。
[0327] e.最終，用加拿大樹脂固定，并且干燥之后，在Nikon Ti微分干設(shè)相差顯微鏡上觀 察漿片的形狀和輪廓W及中央細胞結(jié)構(gòu)并拍照。
[0328] 野生型擬南芥(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物用作對照，每種植物株系評估30 個種子，該實驗重復(fù)=次，并將結(jié)果取平均值。
[0329] 結(jié)果顯示于圖11a中。可W看到，與野生型擬南芥種子相比，ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥 (ZmSPL2-0X)的T2種子更大。運主要體現(xiàn)于粒長(在顯微鏡的11.5的放大率下）。
[0330] 統(tǒng)計學(xué)定量粒長和粒寬。根據(jù)圖11b中所示的結(jié)果，ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥的T2種子 (ZmSPL2-0X)和野生型擬南芥種子（WT)分別具有0.86和0.645mm的粒長，和0.4211和 0.352mm的粒寬。
[0331] 野生型擬南芥(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物之間沒有顯著差異。
[0332] (2)種子發(fā)育和種子重量
[0333] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)成熟的擬南芥種子主要由胚組成，并且隨著種子發(fā)育，胚乳逐漸降解至 消失。因此，在從ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmSPL2-0X)、空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物和野 生型擬南芥植物(WT)授粉之后5-9天，進一步通過TB0染色（用上述步驟（1)中相同的程序） 動態(tài)觀察種子的胚。
[0334] 授粉后胚的形態(tài)觀察結(jié)果顯示于圖12a中。在授粉后第5天，當(dāng)野生型種子在早屯、 階段時，轉(zhuǎn)基因種子仍在球狀階段;并且在授粉后第9天，野生型種子幾乎完全填充于種皮 內(nèi)，但轉(zhuǎn)基因種子中的胚具有很大的發(fā)育空間。運些結(jié)果表明，隨著ZmSPL2基因的過表達， 擬南芥種子的發(fā)育顯示延遲，因此種子中存在更大的儲存容量。
[0335] 圖12b顯示產(chǎn)量的統(tǒng)計結(jié)果(每種植物株系3個植物），并將實驗重復(fù)3次。將結(jié)果進 行平均化。
[0336] 從該結(jié)果可見：
[0337] 對于ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，每個植 物的總產(chǎn)量分別為0.144：3g和0.0669g;
[0338] 對于ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，每芙的 種子數(shù)分別為68和55.5;
[0339] 對于ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，每個植 物的芙數(shù)分別為225和167.3;
[0340] 對于ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，每芙的 粒重分別為0.0017g和0.001125g。
[0%1]野生型擬南芥植物(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物之間沒有顯著差異。
[0342] 所W，可W看到，ZmSPL2的過表達可增加重量。
[0343] 2)根系的發(fā)育
[0344] 對來自ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmSPL2-0X)的兩個植物株系ZmSPL2-0X-l和 ZmSPL2-0X-2、空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物和野生型擬南芥植物(WT)的種子進行發(fā)芽測試 (在20°C溫度和16小時光照/8小時黑暗的光周期）。
[0345] 表型結(jié)果顯示于圖13曰，其中圖中的=行代表在播種后第2天、第7天和第14天獲得 的結(jié)果?？蒞看到，ZmSPL2-0X-巧日ZmSPL2-0X-2種子比野生型擬南芥種子發(fā)芽更快，比野生 型擬南芥具有全根系的更高生長速率。
[0346] 統(tǒng)計學(xué)定量主根長度、側(cè)根數(shù)和根鮮重。每種植物株系3個植物，并重復(fù)實驗3次。 將結(jié)果進行平均化。
[0347] 結(jié)果顯示于圖13b中（第14天的主根長度未顯示）。
[cm 引 在第 1-9 天，ZmS 化 2-0X-1 具有分別0.176667、0.727917、1.005208、1.28125、 1.597917、1.77125、2.095833、2.2125 和 2.266667 的主根長度；
[0349]在第 1-9 天，ZmS 化 2-0X-2 具有分別0.19、0.716667、1.125、1.3125、1.625、1.85、 2.06667、2.23333和2.4cm的主根長度；
[0；350]在第 1-9 天，WT 具有分別0、0.305、0.620833、0.866667、1.016667、1.155556、 1.544、1.7和1.85cm的主根長度； 惦51 ] 在第14天，ZmSPL2-0X-l和WT具有分別4.88和3.09cm的主根長度；
[O%2] 在第14天，ZmSPL2-0X-l和WT具有分別0.051和0.0415g的總根鮮重；
[0巧3] 在第14天，ZmSPL2-0X-l和WT具有分別16.4和12.17的側(cè)根數(shù)。
[0354] 野生型擬南芥植物(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物之間沒有顯著差異。
[0355] 所W，可W看到，ZmSPL2的過表達增加主根長度、側(cè)根數(shù)和根鮮重。
[0；356] 3)葉
[0357] 播種ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥(ZmSPL2-0X)的T2種子、空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥的T2種子和 野生型擬南芥種子(WT)(在20°C的溫度和16小時光照/8小時黑暗的光周期）。
[0358] 同時，根據(jù)W下具體程序在第25天顯微鏡觀察葉細胞：
[0359] a)在水中煮沸擬南芥的鮮葉W殺死細胞，然后倒出具有溶解顏料的水；
[0360] b)將材料轉(zhuǎn)入95%乙醇，并煮沸，直至組織完全稱色(約1小時）；
[0361] C)將仍然溫?zé)?、稱色的材料置于預(yù)熱至96°C的85%乳酸中，并在8分鐘之后獲得透 明的組織材料；
[0362] d)在室溫將透明材料轉(zhuǎn)入85%乳酸中，并儲存，直至用于固定；
[0363] e)固定和觀察：取透明處理的擬南芥葉并用吸水紙吸干過量的乳酸，然后用乙二 醇固定，并在顯微鏡下觀察。
[0364] 在第25天，研究地上植物部分的表型。結(jié)果顯示于圖14a中，其中第一、第二和第= 行代表在第25天的野生型和ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥的地上部分、蓮座葉和葉細胞?？蒞看到， ZmSPL2過表達的植物的地上部分比野生型植物的地上部分更大。
[0365] 統(tǒng)計學(xué)定量第25天的蓮座葉的葉面積、葉數(shù)和葉細胞數(shù)。葉面積的測量可W通過 本領(lǐng)域中已知的任何常規(guī)方法(如網(wǎng)格點法、方格紙法和紙稱重法)來進行，或者葉面積可 W用葉面積儀諸如來自LI-C0R的LAI-3100面積儀來測量。一些葉面積預(yù)測模型也可用于測 量葉面積（參見，例如Sezer I,Oner F,Mut Z.,Non-destructive leaf area measurement in maize(Zea mays L.),J Elnviron Biol.2009Sep;30(5Suppl):785-90)。葉數(shù)目可通過 直接計數(shù)來確定，或者可W根據(jù)單面葉脈數(shù)來估計。葉細胞數(shù)可W通過本領(lǐng)域中眾所周知 的流式細胞術(shù)來測量。每種植物株系測量3個植物，并重復(fù)實驗3次。將結(jié)果進行平均化。
[0366] 結(jié)果顯示于圖14b中。
[0367] 對于ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，蓮座葉 的葉面積分別為5.427和2.558cm2;
[0368] 對于ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，蓮座葉 的細胞數(shù)/每面積單位分別為9.48和9.23;
[0369] 對于ZmSPL2轉(zhuǎn)基因擬南芥T2植物(ZmS化2-0X)和野生型擬南芥植物(WT)，蓮座葉 的葉細胞數(shù)分別為51.45xl03和23.61xl03。
[0370] 野生型擬南芥植物(WT)和空載體轉(zhuǎn)化的擬南芥T2植物之間沒有顯著差異。
[0371] 通過進一步研究，發(fā)現(xiàn)地上部分的擴大主要呈現(xiàn)為蓮座葉面積的增加。從葉表皮 細胞的顯微鏡觀察，表明該葉主要由于細胞數(shù)增加、而不是細胞體積增加而擴大。
[0372] 實施例S.ZmSPLl和ZmSPL2過表達的水稻的生物學(xué)功能的鑒定
[0373] 為了研究ZmS化基因的生物學(xué)功能，構(gòu)建ZmSPLl和ZmSPL2基因的過表達載體，并經(jīng) 由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻Kitaake，W獲得14個ZmSPLl過表達的植物和10個ZmSPL2過表達 的植物。
[0374] 首先，分析轉(zhuǎn)基因和對照水稻的粒徑。結(jié)果顯示，與對照相比，ZmS化1和ZmSPL2過 表達的植物具有更大的巧粒。根據(jù)粒長和粒寬的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果，轉(zhuǎn)基因水稻具有較大的粒長， 但粒寬沒有顯著變化。具體地，轉(zhuǎn)基因植物株系ZmSPL 1-0X-1、ZmSPL 1-0X-5、ZmSPL 1-0X-18、 ZmSPL2-0X-8和ZmSPL2-0X-12與對照相比具有顯著增加的粒徑，具有分別7.71mm、7.36mm、 7.75mm、7.72mm和7.47mm的平均粒長，并且當(dāng)與對照的7.21mm的平均粒長相比時，分別增加 6.93%、2.08%、7.49%、7.07%和3.61 % (參見圖 15和 16)。
[0375] 還分析轉(zhuǎn)基因和對照水稻的1000-粒重量。結(jié)果表明，大多數(shù)ZmSPLl和ZmSPL2過表 達的植物具有增加的1000-粒重量，其中顯著增加的植物株系ZmSPLl-0X-6、ZmSPLl-0X-15、 ZmSPLl-0X-l、ZmSPL2-0X-6、ZmSPL2-0X-8 和 ZmSPL2-0X-7 分別具有 27.42±1.10g、26.16± 1.50邑、26.00±3.30邑、27.67±1.28邑、25.32±1.00邑和25.09±2.19邑的1000-粒重量，與對 照相比分別增加 21.49 %、15.91 %、15.20 %、22.60 %、12.18% 和11.17 % (具有 22.57 ± 1.02g的1000-粒重量）（參見圖17)。
[0376] 實施例6. ZmSPLl過表達的玉米的生物學(xué)功能的鑒定
[0377] 為了研究ZmSPLl基因的生物學(xué)功能，構(gòu)建ZmSPLl基因的過表達載體，并且通過用 農(nóng)桿菌LBA4404感染玉米枝芽而轉(zhuǎn)化玉米自交系Zhen58W獲得轉(zhuǎn)基因植物，并通過PCR鑒定 26個陽性植物株系。圖18顯示一些陽性植物的PCR鑒定。
[0378] 當(dāng)與Zhen58相比時，發(fā)現(xiàn)大部分ZmSPLl過表達的植物具有增加100-粒重量。統(tǒng)計 學(xué)結(jié)果表明，顯著增加的植物株系 ZmSPLl-0X-2、ZmSPLl-0X-21、ZmSPLl-0X-25、ZmSPLl-0X- l 和 ZmSPLl-OX-15 分別具有 24.6±1.67邑、24.0±1.86邑、24.0±2.09邑、23.8±1.25邑和23.5 ±0.14g的 100-粒重量，與對照Zhen58相比分別增加22.39%、19.40%、19.40%、18.41 %和 16.92% (具有20.1 ±1.87g的100-粒重量）（參見圖19)。運表明，ZmSPLl可W增加玉米的粒 徑和重量。
[0379] 實施例7. ZmSPLl-OX玉米的田間實驗的結(jié)果
[0380] 為了進一步研究ZmSPLl基因的生物學(xué)功能，我們進行ZmSPLl過表達的玉米的田間 實驗。10個具有明顯表型的轉(zhuǎn)基因 T3株系和對照Zhen58用于實驗中，即ZmSPLl-OX-2-lO、 ZmSPL1-0X-10-1、ZmSPL1-0X-21-10、ZmSPL1-0X-26-6、ZmSPLl-0X-21-11、ZmSPL1-0X-25-3、 ZmSPLl-OX-1-6、ZmSPLl-OX-15-8、ZmSPLl-OX-16-7、ZmSPLl-OX-22-3和Zhen58。它們中所有 都在北京化angzhuang實驗站生長，一塊田每排5行，一行15株植物。使用自然授粉。并且研 究后代的穗部和巧粒性狀。
[0381] 在穗部性狀方面，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照Zhen58相比，ZmSPLl過表達的玉米株系表現(xiàn) 出增加的穗長和穗寬（圖20和21)，其中Zhen58具有16.35±0.95cm的穗長，而株系ZmSPLl- 0X-25-3顯示18.04±0.50cm的更加不同的穗長，比對照增加10.34% (圖22);并且Zhen58具 有4.03 ±0.14cm的穗寬，而株系ZmSPLl-OX-25-3顯示4.62±0.27cm的更加不同的穗寬，比 對照增加14.64% (圖23)。然而，轉(zhuǎn)基因株系和對照之間的粒行數(shù)目和巧粒數(shù)目沒有顯著差 異（圖24和25)。
[0382] 在對于轉(zhuǎn)基因玉米株系的粒徑的進一步研究中，我們發(fā)現(xiàn)，與對照Zhen58相比， ZmSPLl過表達的玉米株系具有較大巧粒和增加的100-粒重量（圖26)。對照Zhen58具有 31.30±1.94邑的100-粒重，而株系21115口11-0乂-22-3、21115化1-0乂-15-8、21115口1^1-0乂-25-3、 ZmS 化 1-0X-1-6 和 ZmSPLl-OX-21-ll 分別具有：M.12±2.16g、34.32±1.91g、34.42±2.13g、 36.27 ± 2.30g和36.48 ± 2.48g的更高的100-粒重量，分別比對照增加9.01 %、9.65 %、 9.97%、15.88%和 16.49% (圖27)。
[0383] 實施例8. ZmSPLl-OX水稻的田間實驗的結(jié)果
[0384] 我們還進行ZmS化過表達水稻的田間實驗。實驗中使用具有明顯表型的6種ZmSPLl T2株系和4種ZmSPL2 T2株系 W及對照Kitaake，即21115?1^-(^-1、21115?1^-(^-5、21115?1^-0乂- 6、ZmSPLl-0X-15、ZmSPL1-0X-17、ZmSPL1-0X-18、ZmSPL2-0X-6、ZmSPL2-0X-7、ZmSPL2-0X-8、 ZmSPL2-0X-l巧日對照。它們中所有都在北京化angzhuang實驗站生長，一塊田每排2行，一行 11株植物。研究后代的巧粒性狀。
[0385] 與對照相比，所述轉(zhuǎn)基因株系具有增加的粒長，但粒寬變化是不顯著的（圖28和 29)。對照具有0.67 ± 0.04cm的平均粒長，而ZmSPLl-0X和ZmSPL2-0X分別具有0.71 ± 0.04cm 和0.72 ±0.04cm的平均粒長，比對照增加5.97%和7.46% (圖30和31)。
[0386] 與對照比較各轉(zhuǎn)基因株系的粒徑，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系ZmSPLl-0X-17、ZmS化1- 0X-18、ZmS化2-0X-7和ZmSPL2-0X-ll具有更大的粒徑，并且它們的粒長分別為0.73± 0.06畑1、0.73±0.04畑1、0.73±0.04畑1和0. 73±0.03畑1，所有都比對照增力日13.43%(圖 3巧口 33)。然而，它們的粒寬與對照沒有顯著不同（圖32和34)。
[0387] 除去巧粒外殼之后，我們比較內(nèi)部巧粒的大小，結(jié)果顯示，ZmSPLl-〇X和ZmSPL2-0X 兩者均具有比對照增加的粒長（圖35)，但未顯著不同的粒寬（圖36和圖38)。對照具有0.46 ± 0.03cm的平均粒長，而ZmS化1-0X和ZmS化2-0X分別具有0.52 ± 0.02cm和0.51 ± 0.03cm的 平均粒長，比對照分別增加13.04%和10.87% (圖37)。
[0388] 我們還分析轉(zhuǎn)基因水稻和對照的1000-粒重量，結(jié)果顯示，ZmSPLl和ZmSPL2過表達 株系具有增加的 1000-粒重量，其中株系ZmSPLl-0X-6、ZmSPLl-0X-l、ZmSPLl-0X-18、 ZmSPL2-0X-8、ZmSPL2-0X-7和ZmSPL2-0X-6分別具有26. ：34 ± 1.12g、27.29 ± 0.68g、28.13 ± 0.88g、26.10 ±0.33g、26.50 ±0.41g 和 27.85 ±0.34g 的 1000-粒重量，比對照分別增加 10.62%、14.62%、18.14%、9.62% %、11.30%和 16.97% (具有 23.81 ±0.17g 的1000-粒重 量）（圖39)。
【主權(quán)項】
1. 一種分離的核酸分子，其包含定位以提供多核苷酸的表達的在植物細胞中有功能的 啟動子，所述多核苷酸具有以下核苷酸序列： (1) SEQ ID N0:1或3中所示的序列，或其互補序列； (2) 在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 1或3中所示的序列雜交的序列； (3) 與SEQ ID N0:1 或3中所示的序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%序列同一性的序列，其編碼具有控制植物器 官大小的功能的蛋白；或 (4) 由通過缺失、取代、插入或增加一個或多個核苷酸而衍生化SEQ ID NO: 1或3中所示 的序列獲得的序列。2. -種分離的核酸分子，其包含定位以提供多核苷酸的表達的在植物細胞中有功能的 啟動子，所述多核苷酸具有以下核苷酸序列： (1) 序列，其編碼SEQ ID NO:2或4中所示的多肽； (2) 序列，其編碼與SEQ ID N0:2或4中所示的序列具有至少85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%序列同一性的多肽;或 (3) 序列，其編碼由通過缺失、取代、插入或增加一個或多個氨基酸而衍生化SEQ ID N0:2或4中所示的序列獲得的多肽。3. -種重組DNA構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的核酸分子。4. 一種分離的多肽，其選自： (1) 具有SEQ ID N0:2或4中所示的氨基酸序列的多肽;和 (2) 衍生自（1)的多肽，其包含SEQ ID N0:2或4中所示的氨基酸序列中取代、缺失或添 加一個或多個氨基酸殘基，并且表現(xiàn)出控制植物器官大小的功能。5. -種植物細胞，其包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的核酸分子。6. -種轉(zhuǎn)化植物，其包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的核酸分子。7. 根據(jù)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物與未轉(zhuǎn)化植物或野生型植物相比具有改 變的性狀，其中所述改變的性狀選自增加的種子大小、增加的種子數(shù)目、增加的種子重量、 增加的籽粒大小、增加的籽粒數(shù)目、增加的籽粒重量、增加的葉片大小、增加的葉片面積、增 加的葉片數(shù)目、增加的葉片細胞數(shù)目、增加的主根長、增加的側(cè)根數(shù)、增加的根鮮重和增加 的產(chǎn)量。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選作 物植物。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自玉米（Zea mays)、蕓苔屬 (Brassica)物種（例如，卷心菜型油菜(B.napus)、憲菁(B.rapa)、芥菜(Β· juncea))、苜蓿 (Medicago sativa)、水稻（Oryza sativa)、黑麥（Secale cereale)、高粱（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Pennisetum glaucum)、黃米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龍爪稷（Eleusine coracana))、向日葵（Helianthus annuus)、紅花（Carthamus tinctorius)、小麥（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 煙草（Nicotiana tabacum)、馬鈴薯（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海島棉（Gossypium barbadense)、陸地棉（Gossypium hirsutum))、甘薯（Ipomoea batatus)、木薯（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp·)、挪子（Cocos nucifera)、菠蘿 (Ananas comosus)、柑橘屬果樹（Citrus spp ·)、可可（Theobroma cacao)、荼（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp·)、鱷梨（Persea americana)、無花果（Ficus casica)、番石植 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、撤欖（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲堅果（Macadamia integrifolia)、扁桃樹 (Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘庶（Saccharum spp·)、燕麥、草莓、藍 莓和大麥。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物是擬南芥、水稻或玉米。11. 一種產(chǎn)生具有改變的性狀的轉(zhuǎn)化植物的方法，其中所述方法包括用權(quán)利要求3的重 組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物且獲得轉(zhuǎn)化植物，與未轉(zhuǎn)化植物或野生型植物相比，所述轉(zhuǎn)化植物顯 示選自以下的改變的性狀:增加的種子大小、增加的種子數(shù)目、增加的種子重量、增加的籽 粒大小、增加的籽粒數(shù)目、增加的籽粒重量、增加的葉片大小、增加的葉片面積、增加的葉片 數(shù)目、增加的葉片細胞數(shù)目、增加的主根長、增加的側(cè)根數(shù)、增加的根鮮重和增加的產(chǎn)量。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選作物 植物。13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物選自玉米（Zea mays)、蕓苔屬 (Brassica)物種（例如，卷心菜型油菜(B.napus)、完菁(B.rapa)、芥菜(B. juncea))、苜蓿 (Medicago sativa)、水稻（Oryza sativa)、黑麥（Secale cereale)、高粱（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Pennise turn glaucum)、黃米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龍爪稷（Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、紅花（Carthamus tinctorius)、小麥（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海島棉（Gossypium barbadense)、陸地棉（Gossypium hirsutum))、甘薯（Ipomoea batatus)、木薯（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp·)、挪子（Cocos nucifera)、菠蘿 (Ananas comosus)、柑橘屬果樹（Citrus spp ·)、可可（Theobroma cacao)、荼（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp·)、鱷梨（Persea americana)、無花果（Ficus casica)、番石植 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、撤欖（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲堅果（Macadamia integrifolia)、扁桃樹 (Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘庶（Saccharum spp·)、燕麥、草莓、藍 莓和大麥。14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物是擬南芥、水稻或玉米。15. -種用于增加植物的產(chǎn)量的方法，其中所述方法包括用權(quán)利要求3的重組DNA構(gòu)建 體轉(zhuǎn)化植物且獲得與未轉(zhuǎn)化植物或野生型植物相比顯示增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)化植物。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選作物 植物。17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述植物選自玉米（Zea mays)、蕓苔屬 (Brassica)物種（例如，卷心菜型油菜(B.napus)、完菁(B.rapa)、芥菜(B. juncea))、苜蓿 (Medicago sativa)、水稻（Oryza sativa)、黑麥（Secale cereale)、高粱（Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟（例如珍珠粟（Penniseturn glaucum)、黃米（Panicum miliaceum)、谷子（Setaria italica)、龍爪稷（Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、紅花（Carthamus tinctorius)、小麥（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、 煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯（Solanum tuberosum)、花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海島棉（Gossypium barbadense)、陸地棉（Gossypium hirsutum))、甘薯（Ipomoea batatus)、木薯（Manihot esculenta)、咖啡（Coffea spp·)、挪子（Cocos nucifera)、菠蘿 (Ananas comosus)、柑橘屬果樹（Citrus spp ·)、可可（Theobroma cacao)、荼（Camellia sinensis)、香蕉（Musa spp·)、鱷梨（Persea americana)、無花果（Ficus casica)、番石植 (Psidium guajava)、芒果（Mangifera indica)、撤欖（Olea europaea)、木瓜（Carica papaya)、腰果（Anacardium occidentale)、澳洲堅果（Macadamia integrifolia)、扁桃樹 (Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘庶（Saccharum spp·)、燕麥、草莓、藍 莓和大麥。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是擬南芥、水稻或玉米。
【文檔編號】A01H5/00GK106062195SQ201380082005
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2013年11月29日
【發(fā)明人】倪中福, 孫其信, 王成, 王波, 姚穎垠, 彭惠茹, 張義榮, 胡兆榮
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學(xué)