腺相關(guān)病毒載體的制作方法
【專利摘要】本文公開了重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含：(a)變體AAV2衣殼蛋白，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV2衣殼蛋白包含至少4個氨基酸取代；其中，所述至少4個氨基酸取代存在于AAV2衣殼蛋白序列的下列位置上：457，492，499和533；和(b)異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核苷酸序列。
【專利說明】腺相關(guān)病毒載體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及重組病毒載體的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明設(shè)及適合用于治療基因的體內(nèi) 遞送的重組病毒載體。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 迄今為止，腺相關(guān)病毒仍是用于治療基因的遞送的最有前景的載體之一。顯著數(shù) 量的臨床前和臨床研究已經(jīng)牢固確立，運(yùn)種方法適合用于開發(fā)可達(dá)到市場認(rèn)可的基于基因 的藥物。
[0004] 自20世紀(jì)80年代開始開發(fā)AAV2用作用于基因治療的載體W來，在優(yōu)化該平臺用于 多種應(yīng)用和祀組織上已取得了很多進(jìn)展。在運(yùn)些發(fā)展中，可能最重要的是發(fā)現(xiàn)了廣泛多樣 的血清型，其中10至12種現(xiàn)在已被普遍研究。運(yùn)些不同血清型的最突出的特征之一是它們 各自的相對組織嗜性和(在某些情況下）神經(jīng)元逆向運(yùn)輸?shù)哪芰ΑＴ谶\(yùn)些血清型中，AAV1-10 被廣泛用于臨床前和臨床目的。
[0005] 已開發(fā)了設(shè)及允許祀向和脫祀向患者的特定組織和細(xì)胞亞型的過程的較新的平 臺。運(yùn)些方法的核屯、技術(shù)是基于現(xiàn)有的AAV變體(血清型）的試錯評估和隨機(jī)引入的AAV衣殼 突變體的體內(nèi)選擇。運(yùn)兩個有前景的方法一起提供了數(shù)十種(如果不是數(shù)百種)具有不同轉(zhuǎn) 導(dǎo)行為的潛在載體。
[0006] AAV血清型的最吸引人的方面是它們有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)動物模型和人中的特定組織的能 力。迄今，對于組織嗜性的基本機(jī)制的全面分子認(rèn)識尚待提出并且因此一般認(rèn)為針對每個 血清型的可用的組織特異性受體在各種血清型的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮中屯、作用。
[0007] 因此仍然需要額外的AAV載體，其具有在體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)和組織特異性方面的改 善的特性。特別地，運(yùn)樣的載體具有提供用于基因遞送至人中的各種祀組織的極大增強(qiáng)的 益處的潛力。
[000引發(fā)明概述
[0009] 在一個方面，本發(fā)明提供了重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含：（a)變體AAV2衣殼 蛋白，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV2衣殼蛋白包含至少4個氨基酸取代;其 中，所述至少4個氨基酸取代存在于AAV2衣殼蛋白序列的下列位置上:457，492，499和533; 和(b)異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0010] 在一個實(shí)施方案中，變體AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:2的序列，或與其具有至少 95%的序列同一性的序列。在另一個實(shí)施方案中，野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1的 序列。
[0011] 在一個實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列殘基:M457，A492， D499和Y533。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV2衣殼蛋白包含一 個或多個下列氨基酸取代:Q457M，S492A，E499D和巧33Y。
[0012]在一個實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV衣殼蛋白還在AAV2衣殼 蛋白序列的下列位置上包含一個或多個氨基酸取代：125,151，162和205。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，變體AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列殘基：1125,4151，5162和5205。在另一個優(yōu)選 的實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸 取代:￥1251，￥1514,41625和12055。
[OOU]在一個實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV衣殼蛋白還在AAV2衣殼 蛋白序列的下列位置上包含一個或多個氨基酸取代:585和588。優(yōu)選地，變體AAV2衣殼蛋白 包含一個或多個下列殘基:S585和巧88。更優(yōu)選地，變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV2衣 殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代:R585S和R588T。
[0014]在一個實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV衣殼蛋白還在AAV2衣殼 蛋白序列的下列位置上包含一個或多個氨基酸取代:546，548和593。優(yōu)選地，變體AAV2衣殼 蛋白包含一個或多個下列殘基:D546，G548，和S593。更優(yōu)選地，變體AAV2衣殼蛋白相對于野 生型AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代:G54抓，E548G和A593S。
[001引在一個實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白包含殘基N312,即存在于野生型AAV2衣殼 蛋白中的位置312上的殘基。在此實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白相較于野生型AAV2衣殼蛋 白序列在位置312上不是突變的。
[0016]在另一個方面，本發(fā)明提供了重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含：（a)變體AAV8衣 殼蛋白，其中所述變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣殼蛋白在AAV8衣殼蛋白序列的位 置315上包含氨基酸取代;和(b)異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0017]在一個實(shí)施方案中，變體AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO:6具有至少95%的序列同 一性的序列。在另一個實(shí)施方案中，野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:6的序列。
[0018] 在一個實(shí)施方案中，變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣殼蛋白包含氨基酸取 代S315N。優(yōu)選地，AAV8衣殼蛋白序列包含存在于一個或多個下列位置上的一個或多個氨基 酸取代：125，151，163，206，460，495，502，536，549，551，588，591 和/或 596。
[0019] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣殼蛋白包含一個或 多個下列氨基酸取代：（a)V125I，Q151A，K163S，A206S，T460M，T495A，N502D，F(xiàn)536Y，N549D, A551G，Q588S和/或G596S;和/或(b)T591R。
[0020] 在另一個方面，本發(fā)明提供了重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含：（a)變體AAV3B 衣殼蛋白，其中所述變體AAV3B衣殼蛋白相對于野生型AAV3B衣殼蛋白在AAV3B衣殼蛋白序 列的位置312上包含氨基酸取代;和(b)異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0021] 在一個實(shí)施方案中，變體AAV3B衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 11具有至少95%的序 列同一性的序列。在另一個實(shí)施方案中，野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 11的序列。
[0022] 在一個實(shí)施方案中，變體AAV3B衣殼蛋白相對于野生型AAV3B衣殼蛋白包含氨基酸 取代S312N。
[0023] 在另一個方面，本發(fā)明提供了重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含：（a)變體AAV- LK03衣殼蛋白，其中所述變體AAV-LK03衣殼蛋白相對于如SEQ ID N0:12定義的AAV-LK03衣 殼蛋白序列在位置312上包含氨基酸取代;和(b)異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核巧酸 序列。
[0024] 在一個實(shí)施方案中，變體44￥寸1(03衣殼蛋白包含與569 10^:12具有至少95%的 序列同一性的序列。
[0025] 在另一個方面，本發(fā)明提供了重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含：（a)變體AAV衣 殼蛋白，其中所述變體AAV衣殼蛋白相對于野生型AAV衣殼蛋白在相應(yīng)于AAV2衣殼蛋白序列 的一個或多個下列位置的位置上包含至少一個氨基酸取代：125,151,162,205,312,457, 492，499，533，546，548，585，588和/或593;和(b)異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核巧酸 序列。
[0026] 在一個實(shí)施方案中，所述至少一個氨基酸取代存在于AAV2衣殼蛋白序列的一個或 多個下列位置上：125，151，162，205，312，457,492,499，533，546，548，585，588和/或 593;或 者存在于替代的AAV衣殼蛋白序列的一個或多個相應(yīng)的位置上。
[0027] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV2衣殼蛋白。在另一個實(shí)施方案中，變體AAV 衣殼蛋白包含SEQ ID N0:2的序列，或與其具有至少95%的序列同一性的序列。在另一個實(shí) 施方案中，野生型AAV衣殼蛋白來自AAV2。在另一個實(shí)施方案中，野生型AAV衣殼蛋白包含 SEQ ID N0:1 的序列。
[00%]在一個實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列殘基：1125，A151, S162，S205，S312，M457，A492，D499，Y533，D546，G548，S585，T588 和/或 S593。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代： V125I，V151A，A162S，T205S，N312S，Q457M，S492A，E499D，F(xiàn)533Y，G5^D，E548G，R585S，R588T 和/或A593S。
[0029] 在其它實(shí)施方案中，變體AAV衣殼蛋白來自
[0030] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV1衣殼蛋白。在另一個實(shí)施方案中，變體AAV 衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:3具有至少95%的序列同一性的序列。在另一個實(shí)施方案中，野 生型AAV衣殼蛋白來自AAV1。在另一個實(shí)施方案中，野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:3的 序列。
[0031 ]在一個實(shí)施方案中，至少一個氨基酸取代存在于AAV1衣殼蛋白序列中的一個或多 個下列位置上：125，151，162，205，313，458,493，500，5：34，547，549，586，589 和/或 594。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，變體AAV1衣殼蛋白相對于野生型AAV1衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基 酸取代：V125I，Q151A，T162S，N313S，N458M，K493A，N500D，F(xiàn)534Y，S547D和/或G594S。在替代 實(shí)施方案中，變體AAV1衣殼蛋白相對于野生型AAV1衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取 代的：S205T，G54犯，S586R和/或 I'SSgR。
[0032] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV5衣殼蛋白。在另一個實(shí)施方案中，變體AAV 衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:4具有至少95%的序列同一性的序列。在另一個實(shí)施方案中，野 生型AAV衣殼蛋白來自AAV5。在另一個實(shí)施方案中，野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:4的 序列。
[0033] 在一個實(shí)施方案中，至少一個氨基酸取代存在于AAV5衣殼蛋白序列的一個或多個 下列位置上：124，150，153，195，303，444，479，486，520，533，537，575，578 和/或 583。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，變體AAV5衣殼蛋白相對于野生型AAV5衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸 取代：￥1241，1(1504，1(1535,41955，1?035，1444]\1，54794，￥4860^520￥，口5330和/或65835。在 替代實(shí)施方案中，變體AAV5衣殼蛋白相對于野生型AAV5衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基 酸取代:G537E，S575R和/或 I'STSR。
[0034] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV6衣殼蛋白。在另一個實(shí)施方案中，變體AAV 衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:5具有至少95%的序列同一性的序列。在另一個實(shí)施方案中，野 生型AAV衣殼蛋白來自AAV6。在另一個實(shí)施方案中，野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:5的 序列。
[0035] 在一個實(shí)施方案中，至少一個氨基酸取代存在于AAV6衣殼蛋白序列的一個或多個 下列位置上：125，151，162，205，313,458，493，500，5：34，547，549，586，589 和/或 594。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，變體AAV6衣殼蛋白相對于野生型AAV6衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸 取代:V125I，Q151A，T162S，N313S，N458M，K493A，N500D，F(xiàn)534Y，S547D和/或G594S。在替代實(shí) 施方案中，變體AAV6衣殼蛋白相對于野生型AAV6的衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取 代：S205T，G54犯，S586R和/或 I'SSgR。
[0036] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV8衣殼蛋白。在另一個實(shí)施方案中，變體AAV 衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:6具有至少95%的序列同一性的序列。在另一個實(shí)施方案中，野 生型AAV衣殼蛋白來自AAV8。在另一個實(shí)施方案中，野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:6的 序列。
[0037] 在一個實(shí)施方案中，至少一個氨基酸取代存在于AAV8衣殼蛋白序列中的一個或多 個下列位置上：125，151，163，206，315，460,495，502，536，549，551，588，591 和/或 596。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基 酸取代：乂1251，91514，1(1635,42065^4601^4954，服020，尸536￥，服490,45516,95885和/或 G596S。在替代實(shí)施方案中，變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣殼蛋白包含一個或多個 下列氨基酸取代:S315N和/或巧91R。
[0038] 在一個實(shí)施方案中，載體包含AAV9衣殼蛋白。在另一個實(shí)施方案中，變體AAV衣殼 蛋白包含與SEQ ID N0:7具有至少95%的序列同一性的序列。在另一個實(shí)施方案中，野生型 AAV衣殼蛋白來自AAV9。在另一個實(shí)施方案中，野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:7的序 列。
[0039] 在一個實(shí)施方案中，至少一個氨基酸取代存在于AAV9衣殼蛋白序列中的一個或多 個下列位置上：125，151，162，205，314，458,493，500，5：34，547，549，586，589 和/或 594。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，變體AAV9衣殼蛋白相對于野生型AAV9衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基 酸取代：L125I，Q151A，N314S，Q458M，V493A，E500D，F(xiàn)534Y，G547D，A589T和/或G594S。在替代 實(shí)施方案中，變體AAV9衣殼蛋白相對于野生型AAV9衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取 代：S162A，S205T，G54 犯和 / 或 S586R。
[0040] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV10衣殼蛋白。在另一個實(shí)施方案中，變體AAV 衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:8具有至少95%的序列同一性的序列。在另一個實(shí)施方案中，野 生型AAV衣殼蛋白來自AAV10。在另一個實(shí)施方案中，野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:8 的序列。
[0041 ]在一個實(shí)施方案中，至少一個氨基酸取代存在于AAV10衣殼蛋白序列中的一個或 多個下列位置上：125,151,163,206,315,460,495,502,536,549,551,588,591 和/或 596。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體AAV10衣殼蛋白相對于野生型AAV10衣殼蛋白包含一個或多個下列 氨基酸取代：V125I，Q151A，K163S，A206S，N315S，T460M，L495A，N502D，F(xiàn)536Y，G549D，Q588S, A59IT和/或G596S。在替代實(shí)施方案中，變體AAV10衣殼蛋白相對于野生型AAV10衣殼蛋白包 含下列氨基酸取代:G55化。
[0042]在一個實(shí)施方案中，重組AAV載體相較于包含相應(yīng)的野生型AAV衣殼蛋白的AAV載 體表現(xiàn)出神經(jīng)元或視網(wǎng)膜組織的增加的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0043] 在另一個實(shí)施方案中，重組AAV載體相較于相應(yīng)的野生型AAV衣殼蛋白表現(xiàn)出肝臟 組織的增加的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0044] 在一個實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物包括干擾RNA或適體。在另一個實(shí)施方案中，基因產(chǎn) 物包括多膚。優(yōu)選地，基因產(chǎn)物包括神經(jīng)保護(hù)多膚，抗血管生成多膚，或增強(qiáng)神經(jīng)元或視網(wǎng) 膜細(xì)胞的功能的多膚。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物包括膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，成纖維 細(xì)胞生長因子，神經(jīng)生長因子，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，視紫紅質(zhì)，retinoschisin，RPE65或外 周蛋白。
[0045] 在另一個方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含：（a)根據(jù)前述任一權(quán)利要求的 重組AAV載體;和(b)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0046] 在另一個方面，本發(fā)明提供了用于將基因產(chǎn)物遞送至受試者的組織的方法，所述 方法包括向受試者施用如上文定義的重組AAV載體或藥物組合物。
[0047] 在一些實(shí)施方案中，組織選自血液，骨髓，肌肉組織，神經(jīng)元組織，視網(wǎng)膜組織，膜 腺組織，肝臟組織，腎組織，肺組織，腸組織或屯、臟組織。優(yōu)選地，組織是神經(jīng)元、視網(wǎng)膜或肝 臟組織。
[0048] 在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療受試者的病癥的方法，所述方法包括向受 試者施用如上文定義的重組AAV載體或藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述病癥是神經(jīng)、 眼部或肝臟病癥。
[0049] 在另一個方面，本發(fā)明提供了如上文定義的重組AAV載體或藥物組合物，其用于治 療受試者的病癥。在一些實(shí)施方案中，所述病癥是神經(jīng)、眼部或肝臟病癥。優(yōu)選地，神經(jīng)病癥 是神經(jīng)變性疾病。在替代實(shí)施方案中，眼部病癥是青光眼，色素性視網(wǎng)膜炎，黃斑變性，視網(wǎng) 膜劈裂或糖尿病性視網(wǎng)膜病。
[0050] 在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的變體AAV衣殼蛋白，其中所述變體AAV衣殼蛋 白相對于野生型的AAV衣殼蛋白包含至少一個氨基酸取代;其中所述至少一個氨基酸取代 存在于AAV2衣殼蛋白序列的一個或多個下列位置上：125，151，162，205，312，457，492，499， 533，546，548，585，588和/或593;或者存在于替代的AAV衣殼蛋白序列的一個或多個相應(yīng)的 位置上。
[0051] 在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其包含編碼如上文定義的變體AAV衣殼 蛋白的核巧酸序列。
[0052] 在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的宿主細(xì)胞，其包含如上文定義的核酸。
[0化3] 附圖簡述
[0054] 圖1顯示了野生型腺相關(guān)病毒2衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（SEQ ID N0:1;NCBI參 考序列：NC_001401)。殘基 V125，V151，A162，T205，N312，Q457，S492，E499，F(xiàn)533，G546，E548, R585，R588和A593被突出顯示。
[0055] 圖2顯示了真實(shí)型腺相關(guān)病毒2(ttAAV2)衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)。殘基1125,4151，5162,5205,5312，]?457,4492,0499，￥533,0546,6548,5585^588,5593 相比野生型AAV2VPUSEQ ID N0:1)不同并被突出顯示。
[0056] 圖3顯示了野生型腺相關(guān)病毒1衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（SEQ ID N0:3;NCBI參 考序列:NC_002077)。突出顯示的殘基：S205(與ttAAV2(沈Q ID ^:2)中的5205對齊)-6549 (與ttAAV2中的G548對齊)-S586(與ttAAV2中的S585對齊)-T589(與ttAAV2中的巧88對齊）。
[0057] 圖4顯示了野生型腺相關(guān)病毒5衣殼蛋白VPl的氨基酸序列（SEQ ID N0:4;NCBI參 考序列:AF085716)。突出顯示的殘基:G537(與ttAAV2中的G548對齊)-S575(與ttAAV2中的 S585對齊)-巧78(與ttAAV2中的巧88對齊）。
[005引圖5顯示了野生型腺相關(guān)病毒6衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（SEQ ID N0:5;NCBI參 考序列:AF028704)。突出顯示的殘基:S205(與ttAAV2中的S205對齊)-G549(與ttAAV2中的 G548對齊)-S586(與ttAAV2中的S585對齊)-T589(與ttAAV2中的巧88對齊）。
[0059] 圖6顯示了野生型腺相關(guān)病毒8衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（SEQ ID N0:6;NCBI參 考序列:NC_006261)。突出顯示的殘基:S315(與ttAAV2中的S312對齊)-T591(與ttAAV2中的 巧88對齊）。
[0060] 圖7顯示了野生型腺相關(guān)病毒9衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（SEQ ID N0:7;NCBI參 考序列:AY530579)。突出顯示的殘基:S162(與ttAAV2中的S1621)-S205(與ttAAV2中的S205 對齊)-G549(與ttAAV2中的G548對齊)-S586(與ttAAV2中的S585對齊）。
[0061] 圖8顯示了野生型腺相關(guān)病毒10衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（SEQ ID N0:8)。突出 顯示的殘基:G551 (與ttAAV2中的G548對齊）。
[0062] 圖9顯示了 AAV衣殼蛋白VP1氨基酸序列的比對。
[0063] 圖10:用于產(chǎn)生AAV2載體的質(zhì)粒是包裝質(zhì)粒pDG。上圖：具有野生型AAV2基因的 pDG。下圖：具有真實(shí)型AAV2基因的pDG-ttAAV2，突出顯示的是位置585和588上的乙酷肝素 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的兩個關(guān)鍵突變。MMTV:驅(qū)動AAV rep表達(dá)的啟動子，E2a、E40RF6和VA是表達(dá) 腺病毒輔助因子的基因。
[0064] 圖11:用于體內(nèi)注射的rAAV2真實(shí)型（TT)和野生型(WT)的病毒滴度通過顯示針對 分離的蛋白的氯染色的SDS-PAGE定量，并用紅外線-巧光掃描儀（Odyssey Imaging systems)掃描。4:10山的44￥2病毒顆粒和62.511旨-50011旨的654在含508的12%分離膠上分離 并用氯蛋白染料染色。將圖像轉(zhuǎn)換為灰度圖。衣殼基因蛋白VP1、VP2、VP3標(biāo)注在左側(cè)。B:顯 示來自qPCR(載體基因組[vg/ml ])和SDS-Page (衣殼滴度[衣殼/ml ])的滴度的表。
[0065] 圖12A:顯示了用GFP特異性抗體染色的大鼠腦切片的代表性例子。將載體注射入 如箭頭所示的紋狀體中。B:顯示了至黑質(zhì)中的注射的代表性例子。
[0066] 圖13:顯示了使用ttAAV2和wtAAV2的眼睛的GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)。A:顯示了ttAAV2(上圖）和 wtAAV2(下圖）載體施用后的橫切面中的視網(wǎng)膜。B:顯示了 A中的虛線框的放大圖。
[0067] 圖14:新生小鼠載體注射后的小鼠腦的轉(zhuǎn)導(dǎo)。i.v.:靜脈內(nèi)載體施用；i.c.:煩內(nèi)注 射;AAV-2，wt AAV2; AAV-TT，11AAV2。
[0068] 圖15:AAV2衣殼的S維圖示。突出顯示的殘基相應(yīng)于ttAAV2和野生型顆粒之間的 氨基酸變化，根據(jù)它們的位置通過顏色進(jìn)行分組。
[0069] 圖16:AAV2衣殼上的S倍峰的圖示。突出顯示的殘基相應(yīng)于真實(shí)型和野生型顆粒 之間的氨基酸變化。肝素結(jié)合位點(diǎn)殘基突出顯示為綠色。
[0070] 圖17:AAV2衣殼的內(nèi)側(cè)的圖示。淡藍(lán)色的突出顯示的殘基相應(yīng)于ttAAV2中的位于 衣殼的內(nèi)側(cè)上的單氨基酸改變。
[0071] 圖18:AAV2衣殼上的S倍峰的圖示。淺褐色的突出顯示的殘基相應(yīng)于真實(shí)型載體 中空間上緊密的并且位于AAV衣殼上的兩個=倍-近端峰之間的溝中的兩個氨基酸改變。
[0072] 圖19:AAV2衣殼上的S倍峰的圖示。棟色的突出顯示的殘基相應(yīng)于真實(shí)型載體中 位于=倍-近端峰之間的溝中的單個分離的氨基酸改變(S593)。
[0073] 圖20:AAV2衣殼上的S倍峰的圖示。W粉色突出顯示的四個氨基酸參與受體結(jié)合 并且緊密地位于=倍峰上。
[0074] 圖21:來自AAV2的VP1衣殼單體(淺藍(lán)色)和來自AAV1的VP1單體(澄色)之間的比對 的S維圖示。在圖的中央偏左處突出顯示的殘基相應(yīng)于AAV1中的G549(澄色球體)和AAV2中 的E548(青色球體）。在圖的右上方處突出顯示的殘基相應(yīng)于AAV1中的S586和T589(澄色球 體)和AAV2中的R585和R588(青色球體）。
[00對圖22:來自AAV2的VP1衣殼單體(淺藍(lán)色)和來自AAV5的VP1單體(紫色)之間的比對 的S維圖示。在圖的中間突出顯示的殘基相應(yīng)于AAV5中的G537 (紫色球體)和AAV2中的E548 (青色球體）。在圖的右上方處突出顯示的殘基相應(yīng)于AAV5中的S575和T578(紫色球體）和 AAV2中的R585和R588 (青色球體）。
[0076] 圖23:來自AAV2的VP1衣殼單體(淺藍(lán)色)和來自AAV6的VP1單體(黃色)之間的比對 的S維圖示。在圖的底部突出顯示的殘基相應(yīng)于AAV6中的G549(澄色球體)和AAV2中的E548 (青色球體）。在圖的右上方處突出顯示的殘基相應(yīng)于AAV6中的S586和T589(澄色球體）和 AAV2中的R585和R588 (青色球體）。
[0077] 圖24:來自AAV2的VP1衣殼單體(淺藍(lán)色)和來自AAV8的VP1單體(粉紅色)之間的比 對的S維圖示。在圖的左上方突出顯示的殘基相應(yīng)于AAV8中的S315 (紅色球體)和AAV2中的 N312(青色球體）。在圖的右下方突出顯示的殘基相應(yīng)于AAV8中的巧91(紅色球體)和AAV2中 的R588(青色球體）。
[007引圖25:來自AAV2的VP1衣殼單體(淺藍(lán)色)和來自AAV9的VP1單體(綠色)之間的比對 的S維圖示。在圖的中間突出顯示的殘基相應(yīng)于AAV9中的G549(黃色球體)和AAV2中的E548 (青色球體）。在圖的左下方突出顯示的殘基相應(yīng)于AAV9中的S586(黃色球體)和AAV2中的 R585(青色球體）。
[0079] 圖26:在大鼠腦紋狀體注射后束旁核中rAAV2TT和WT表達(dá)的分析。A:顯示左側(cè)的吻 端和右側(cè)的尾端的大鼠腦切片的代表性圖像。指示了紋狀體中注射的部位，并且顯示了在B 和C中觀察到的下丘腦中的突出物區(qū)域(束旁核，pf)。B和C:在rAAV2WT(B)或TT(C)的紋狀體 注射后束旁核(pf)中檢測到的GFP表達(dá)的高倍率圖像。
[0080] 圖27 :新生小鼠中rAAV2TT和WT的煩內(nèi)注射的概覽。顯示了用GFP特異性抗體染色 的新生小鼠腦切片的代表性例子。5xl〇i%g的rAAV2TT(上圖）或rAAV2WT(中圖）被注射入新 生小鼠大腦的側(cè)腦室。同時染色的來自新生小鼠的未注射的腦被表示為陰性對照(N T，非 轉(zhuǎn)導(dǎo)的）。
[0081] 圖28:在rAAV2TT或WT的煩內(nèi)注射后新生小鼠腦切片的高倍率照片。顯示了用GFP 特異性抗體染色的新生小鼠腦切片。5xl〇iDvg的rAAV2TT (左圖）或rAAV2WT (右圖）被注射入 新生小鼠大腦的側(cè)腦室。S1BF:桶狀區(qū)初級體感皮層。
[0082] 圖29:新生小鼠的rAAV2TT和WT在全身注射后的大腦傳導(dǎo)的概覽。顯示了用GFP特 異性抗體染色的新生小鼠腦切片的代表性例子。2xl〇iiyg的rAAV2TT(上圖）或rAAV2WT(下 圖）被注射入新生小鼠的頸靜脈。
[0083] 圖30:在rAAV2TT或WT的全身注射后新生小鼠腦切片的高倍率照片。顯示了用GFP 特異性抗體染色的新生小鼠腦切片。2xl〇iiyg的rAAV2TT (左圖）或rAAV2WT (右圖）被注射入 新生小鼠的頸靜脈。SIBF:桶狀區(qū)初級體感皮層。
[0084] 圖31:在rAAV2TT或WT的全身注射后新生小鼠組織切片的高倍率照片。2xl〇iiyg的 rAAV2TT或rAAV2WT被注射入新生小鼠的頸靜脈。未注射的小鼠器官用作為陰性對照。
[0085] 圖32:在rAAV2TT、WT和皿null的紋狀體注射后成年大鼠腦切片的高倍率圖像。顯 示了用GFP特異性抗體染色的大鼠腦切片的代表性例子。3.5x 109vg的rAAV2WT (左圖）、TT (右圖）或AAV2-HBnu 11 (中圖）被注射入成年大鼠腦的紋狀體中并獲取丘腦或黑質(zhì)(SN)中的 代表性照片。
[0086] 圖33:新生小鼠中完全AAV-TT的煩內(nèi)注射相較于各種TT突變體的概覽。顯示了用 GFP特異性抗體染色的新生小鼠腦切片的代表性例子。5xl〇i\g的rAAV2TT、TT-S312N、TT- S593A或TT-D546G/G548E (TT-DG)被注射入新生小鼠腦的側(cè)腦室。同時染色的來自新生小鼠 的未注射的腦被表示為陰性對照(NT)。
[0087] 圖34:在各種TT突變載體的煩內(nèi)注射后新生小鼠腦切片的高倍率照片。顯示了用 GFP特異性抗體染色的新生小鼠腦切片。5x 1 〇i%g的載體被注射入新生小鼠腦的側(cè)腦室。TT- DG:TT-D546G/G548E。
[0088] 圖35:完全AAV-TT的新生小鼠煩內(nèi)注射相較于TT-S312N突變體和含10個突變的潛 在最終TT載體的概覽。顯示了用GFP特異性抗體染色的新生小鼠腦切片的代表性例子。 5xlO〇9vg的rAAV2TT、TT-S312N、TT或TT-S312N-D546G/G548E-S593A(TT-S312N-DG-S593A)被 注射入新生小鼠腦的側(cè)腦室。同時染色的來自新生小鼠的未注射的腦被表示為陰性對照 (NT)。
[0089] 圖36:在各種TT突變載體的煩內(nèi)注射后新生小鼠腦切片的高倍率照片。顯示了用 GFP特異性抗體染色的新生小鼠腦切片。5xlO?Vg的載體被注射入新生小鼠腦的側(cè)腦室。
[0090] 圖37:用完全AAV-TT、TT-S312N突變體或TT-S312N-DG-S593A注射的新生小鼠大腦 中的GFP蛋白的化ISA定量。5xl〇Wvg的載體被注射入新生小鼠腦的側(cè)腦室并從整個收獲的 腦中提取總蛋白。GFP特異性抗體被用來檢測各腦樣品中的GFP表達(dá)，并將標(biāo)準(zhǔn)GFP蛋白用于 定量。N=5只動物/條件。誤差棒代表平均值±SEM。
[0091] 圖38:AAV3B的VP1衣殼蛋白的氨基酸序列。突出顯示的殘基表示與AAV-tt中相應(yīng) 位置上的殘基相同的殘基。位置312上的內(nèi)部絲氨酸殘基加 W下劃線。
[0092] 圖39:AAV-LK03的VP1衣殼蛋白的氨基酸序列。
[0093] 序列列表
[0094] SEQ ID NO: 1是野生型腺相關(guān)病毒2衣殼蛋白VP 1的氨基酸序列(參見圖1)。
[00M] SEQ ID N0:2是真實(shí)型腺相關(guān)病毒2(ttAAV2)衣殼蛋白的氨基酸序列(參見圖2)。
[0096] SEQ ID N0:3是野生型腺相關(guān)病毒1衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（參見圖3)。
[0097] SEQ ID N0:4是野生型腺相關(guān)病毒5衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（參見圖4)。
[009引SEQ ID N0:5是野生型腺相關(guān)病毒6衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（參見圖5)。
[0099] SEQ ID N0:6是野生型腺相關(guān)病毒8衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（參見圖6)。
[0100] SEQ ID N0:7是野生型腺相關(guān)病毒9衣殼蛋白VP1的氨基酸序列(參見圖7)。
[0101] SEQ ID N0:8是野生型腺相關(guān)病毒10化enn衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（參見圖8)。
[0102] SEQ ID N0:9是野生型腺相關(guān)病毒10日本衣殼蛋白VP1的氨基酸序列（參見圖9)。
[0103] SEQ ID NO: 10是圖9中所示的腺相關(guān)病毒的共有氨基酸序列。
[0104] SEQ ID NO: 11是野生型腺相關(guān)病毒3B衣殼蛋白VPl的氨基酸序列（參見圖38)。
[0105] SEQ ID ^:12是腺相關(guān)病毒〇(-03衣殼蛋白￥?1的氨基酸序列（參見圖39)。
[0106] 發(fā)明詳述
[0107] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體。rAAV載體通常包含相較于野 生型AAV衣殼蛋白不同的變體衣殼蛋白。變體衣殼蛋白可有利地賦予腦和/或眼中增強(qiáng)的載 體感染性，使得該載體特別適合于通過基因療法遞送治療劑至運(yùn)些組織中。
[010引重組AAV載體
[0109] 本公開內(nèi)容提供了重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體。"AAV"是腺相關(guān)病毒的縮寫，并且 可W用來指病毒本身或其衍生物。該術(shù)語涵蓋所有亞型和天然存在的和重組的形式，除非 另有要求?？s寫"rAAV"指的是重組腺相關(guān)病毒，也稱為重組AAV載體(或"rAAV載體"）。術(shù)語 "AAr包括，例如，AAV 1 型（AAV-1)，AAV 2型（AAV-2)，AAV 3型（AAV-3)，AAV 4型（AAV-4)， AAV 5型（AAV-5)，AAV6型（AAV-6)，AAV 7型（AAV-7)，AAV 8型（AAV-8)，AAV 9型（AAV-9)，AAV 10 型(AAV-10，包括AA化h 10 )，AAV 12 型（AAV-12 )，禽AAV，牛AAV，犬AAV，馬 AAV，靈長類動物 AAV，非靈長類動物AAV和羊AAV。"靈長類動物AAV"指的是感染靈長類動物的AAV，"非靈長類 動物AAV"指的是感染非靈長類哺乳動物的AAV，"牛AAV"指的是感染牛哺乳動物的AAV，等 等。
[0110] AAV的各種血清型的基因組序列W及天然末端重復(fù)序列（TR)、Rep蛋白和衣殼亞基 的序列在本領(lǐng)域中是公知的。運(yùn)樣的序列可W在文獻(xiàn)中或在公共數(shù)據(jù)庫如GenBank中找到。 參見，例如，GenBank登錄號NC-002077(AAV-l)，AF063497(AAV-l)，NC-001401(AAV-2)， AF043303(AAV-2),NC-〇01729(AAV-3),NC-〇01829(AAV-4),U89790(AAV-4),NC-〇06152 (AAV-5)，AF513851(AAV-7)，AF513852(AAV-8)，和NC-006261(AAV-8);其公開內(nèi)容通過引用 并入本文。也參見，例如，Srivistava等人（1983)J.Virology 45:555;Qiiorini等人（1998) J. Virology 71:6823;畑iorini等人（1999) J. Virology 73 :1309;Bantel-Schaal等人 (1999)J.Virology 73:939;Xiao等人（1999)J.Virology 73:3994;Muramatsu等人（1996) Virology 221:208; Shade 等人，（1986)J.Virol.58:921; Gao 等人（2002) Proc.化t. Acad. Sci . USA 99:11854 ;Moris等人（2004)Virology 33:375-383;國際專利申 請WO 00/28061，W0 99/61601，W0 98/11244;和美國專利號6,156,303。
[0111] 如本文所使用的"rAAV載體"是指包含不是AAV來源的多核巧酸序列（即，與AAV異 源的多核巧酸）的AAV載體，通常是用于細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化的目標(biāo)序列。在一些實(shí)施方案中，異 源多核巧酸可側(cè)接至少一個和一些時候兩個AAV反向末端重復(fù)序列（ITR)。術(shù)語rAAV載體包 括rAAV載體顆粒和rAAV載體質(zhì)粒。rAAV載體可W是單鏈的(ssAAV)或自身互補(bǔ)的(scAAV)。
[0112] "AAV病毒"或"AAV病毒顆粒"或"rAAV載體顆粒"指的是包含至少一個AAV衣殼蛋白 (通常野生型AAV的所有衣殼蛋白）和殼體化的多核巧酸rAAV載體的病毒顆粒。如果顆粒包 含異源多核巧酸（即除野生型AAV基因組W外的多核巧酸，例如待遞送到哺乳動物細(xì)胞中的 轉(zhuǎn)基因），它通常被稱為"rAAV載體顆粒"或簡稱為"rAAV載體"。因此，rAAV顆粒的產(chǎn)生必然 包括rAAV載體的產(chǎn)生，因為運(yùn)樣的載體包含在rAAV顆粒內(nèi)。
[0113] 如本文所用的"重組"是指載體、多核巧酸、多膚或細(xì)胞是克隆、限制性酶切或連接 步驟(例如設(shè)及包含在其中的多核巧酸或多膚)的產(chǎn)物和/或?qū)е屡c自然界中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)物不 同的構(gòu)建體的其它程序的各種組合的產(chǎn)物。重組病毒或載體是包含重組多核巧酸的病毒顆 粒。該術(shù)語分別包括原始多核巧酸構(gòu)建體的重復(fù)物和原始病毒構(gòu)建體的后代。
[0114] 變體AAV衣殼蛋白
[0115] 本文所描述的rAAV載體包含變體AAV衣殼蛋白/'變體"是指AAV衣殼蛋白與相同血 清型的相應(yīng)的野生型AAV衣殼蛋白不同。例如，變體AAV衣殼蛋白相對于相應(yīng)的野生型AAV衣 殼蛋白可W包含一個或多個氨基酸取代。在此上下文中，"相應(yīng)"是指相同血清型的衣殼蛋 白，即變體AAV1衣殼蛋白相對于相應(yīng)野生型AAV1衣殼蛋白包含一個或多個氨基酸取代，變 體AAV2衣殼蛋白相對于相應(yīng)野生型AAV2衣殼蛋白包含一個或多個氨基酸取代，等等。
[0116] 變體AAV衣殼蛋白相對于野生型AAV衣殼蛋白可W包含，例如1至50,1至30,1至20 或1至15個氨基酸取代。優(yōu)選地，變體AAV衣殼蛋白相對于相應(yīng)的野生型AAV衣殼蛋白包含1， 2,3,4,5,6,7,8,9，10，11，12，13或14個氨基酸取代。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體44￥衣殼蛋 白保留與野生型衣殼蛋白的至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少96 %，至少 97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
[0117] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，變體AAV衣殼蛋白相對于野生型AAV衣殼蛋白在相應(yīng)于 AAV2衣殼蛋白序列的一個或多個下列位置的位置上包含至少一個氨基酸取代：125,151, 162，205，312，457，492，499，533，546，548，585，588和/或593。在此上下文中，。相應(yīng)"是指任 何AAV衣殼蛋白序列中（例如，在AAV2蛋白質(zhì)序列或非AAV2衣殼蛋白序列中）的位置，其相應(yīng) 于AAV2衣殼蛋白的上述位置之一。在一個實(shí)施方案中，所述至少一個氨基酸取代存在于 AAV2衣殼蛋白序列的一個或多個下列位置上：125,151，162,205,312，457,492，499,533， 546，548，585，588和/或593;或者在替代的AAV衣殼蛋白序列的一個或多個相應(yīng)的位置上。 [011引通常地，AAV衣殼蛋白包括VP1、VP2和VP3。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，衣殼蛋白包括AAV 衣殼蛋白VP1。
[0119] 核酸和氨基酸序列和序列同一性
[0120] 術(shù)語"多核巧酸"是指任何長度的核巧酸的聚合形式，包括脫氧核糖核巧酸或核糖 核巧酸或其類似物。多核巧酸可W包含修飾的核巧酸，例如甲基化核巧酸和核巧酸類似物， 并且可W通過非核巧酸組分中斷。如果存在的話，核巧酸結(jié)構(gòu)的修飾可W在聚合物的組裝 之前或之后賦予。如本文所用的術(shù)語多核巧酸可互換地是指雙鏈和單鏈分子。除非另有指 出或要求，否則本文描述的其為多核巧酸的本發(fā)明的任何實(shí)施方案包括雙鏈形式和已知或 預(yù)測構(gòu)成雙鏈形式的兩個互補(bǔ)單鏈形式的每一個。
[0121] 術(shù)語"多膚"、"膚"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，其指任何長度的氨基酸的聚 合物。該術(shù)語還包括已被修飾的氨基酸聚合物;例如，二硫鍵形成，糖基化，脂質(zhì)化，憐酸化， 或與標(biāo)記組分綴合。多膚，例如抗血管生成多膚，神經(jīng)保護(hù)多膚等，當(dāng)在遞送基因產(chǎn)物至哺 乳動物受試者的上下文中討論時，和因此組合物，指的是各自完整多膚，或者其任何片段或 遺傳工程衍生物，其保留了完整蛋白的所需的生化功能。類似地，對編碼抗血管生成多膚的 核酸、編碼神經(jīng)保護(hù)多膚的核酸W及用于遞送基因產(chǎn)物至哺乳動物受試者的其它運(yùn)樣的核 酸(其可被稱為待遞送至受體細(xì)胞的"轉(zhuǎn)基因"）的提及包括編碼完整多膚或具有所需生化 功能的任何片段或基因工程衍生物的多核巧酸。
[0122] 多核巧酸或多膚與另一多核巧酸或多膚具有一定百分比"序列同一性"，意思是， 當(dāng)比對時，在比較兩個序列時該百分比的堿基或氨基酸是相同的。序列相似性可許多 不同的方式來測定。為了測定序列同一性，序列可W使用方法和計算機(jī)程序包括BLAST(可 在萬維網(wǎng)ncbi .nlm.nih. gov/BLAST/上獲得）來對齊。另一種比對算法是FASTA，可在來自 Madison,Wisconsin,USA,Oxford Molecular Group , Inc的全資子公司的Genetics Computing G;roup(GCG)程序包中獲得。用于比對的其它技術(shù)在Methods in Enzymology, vol.266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996), ed.Doolittle,Academic Press ,Inc.(Harcourt Brace&Co.,San Diego,California,USA 的一個部口）中描述。特別感興趣的是允許序列中的缺口的比對程序。Smith-Waterman是允 許序列比對中的缺口的一種類型的算法。參見Meth.Mol. Biol. 70:173-187(1997)。此外，使 用化edleman和Wunsch比對方法的GAP程序可W用于比對序列。參見J.Mol.Biol.48:443- 453(1970)。
[0123] 令人感興趣的是使用Smith和Wate;rman(Advances in Applied Mathematics 2: 482-489( 1981))的局部同源性算法來測定序列同一性的BestFit程序。缺口產(chǎn)生罰分一般 將在1至5的范圍內(nèi)，通常在2至4的范圍內(nèi)，并且在許多實(shí)施方案中將是3。缺口延伸罰分一 般將在約0.01至0.20的范圍內(nèi)，并且在許多情況下將是0.10。該程序具有由輸入W進(jìn)行比 較的序列確定的默認(rèn)參數(shù)。優(yōu)選地，序列同一性使用由程序確定的默認(rèn)參數(shù)來測定。該程序 也可獲自來自Madison,Wisconsin,USA的Genetics Computing G;roup(GCG)程序包。
[0124] 另一個感興趣的程序是hstOB算法。FastDB在Current Methods in Sequence Comparison and Analysis ,Macromolecule Sequencing and Synthesis , Selected Methods and A卵lications,卵.127-149,1988,Alan R.Liss,Inc中描述。百分比序列同一 性通過基于下列參數(shù)的化stDB計算：
[0125] 錯配罰分：1.00;
[0126] 缺口罰分:1.00;
[0127] 缺口大小罰分:0.33;和 [012引加入處罰：30.0。
[01巧]變體AAV2衣殼蛋白
[0130] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV2衣殼蛋白。在此實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼 蛋白在AAV2衣殼蛋白序列的一個或多個下列位置上包含至少一個氨基酸取代：125,151， 162，205，312，457，492，499，533，546，548，585，588和/或593。
[0131] 野生型AAV2衣殼蛋白VP1的序列是已知的，并在圖1中顯示(SEQ ID N0:1)。野生型 AAV2衣殼蛋白的序列也可獲自數(shù)據(jù)庫登錄號:NC-001401;化iProt P03135;NCBI參考序列： YP_680426.1;GenBank:AAC03780.1。
[0132] 優(yōu)選地，變體AAV2衣殼蛋白與沈Q ID NO: 1具有至少70%，至少80%，至少90%，至 少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %或至少99%的序列同一性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變 體AAV2衣殼蛋白包含沈Q ID NO:2的序列，或與其具有至少70%，至少80%，至少90%，至少 95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性的序列。
[0133] 在一個實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列殘基：1125，A151, S162，S205，S312，M457，A492，D499，Y533，D546，G548，S585，T588 和/或 S593。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代： V125I，V151A，A162S，T205S，N312S，Q457M，S492A，E499D，F(xiàn)533Y，G5^D，E548G，R585S，R588T 和/或A593S。
[0134] AAV2衣殼蛋白中的突變的組合
[0135] 變體AAV2衣殼蛋白可W包含上述氨基酸取代的任意組合。因此，在具體的實(shí)施方 案中，變體AAV2衣殼蛋白包含選自上述列表的1，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11，12，13或14個氨 基酸取代。在一個實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白包含上文公開的所有14個氨基酸取代，例 如變體AAV2衣殼蛋白包含SEQ ID ^:2的序列（即如本文所提及的《44￥2或44￥2-口')。
[0136] 在其它實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白可W包含上述14突變的子集。不受理論的 束縛，在個別實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白可W包含下列殘基(其在下文分為功能組）：
[0137] 1)S585和/或T588;運(yùn)些殘基可與降低的肝素結(jié)合和富含硫酸肝素蛋白聚糖的腦 組織中增加的病毒傳播相關(guān)；
[0138] 2)S312;此內(nèi)部絲氨酸殘基可能在衣殼-DNA相互作用中起作用；
[0139] 3)0546和/或G548;運(yùn)些殘基可能牽設(shè)與中和抗體的相互作用，從而有助于體內(nèi)的 轉(zhuǎn)導(dǎo)特性；
[0140] 4)S593;該殘基位于S倍近端峰之間的溝中；
[0141] 5)M457，A492，D499和/或Y533;運(yùn)四個氨基酸可能參與受體結(jié)合并且緊密地位于 =倍峰上；
[0142] 6)I125，A151，S162和/或S205中；運(yùn)些殘基可能與PLA 2活性和/或侵入的病毒的 運(yùn)輸相關(guān)。
[0143] 應(yīng)當(dāng)理解本文中還考慮了包含當(dāng)存在于其它AAV血清型(見下文）中的相應(yīng)位置上 時相應(yīng)于上述殘基的突變的相應(yīng)子集。
[0144] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白包含可與受體結(jié)合相關(guān)的上述位置上的 四個或多個突變，即殘基457，492，499和533。因此，特別優(yōu)選的是變體AAV2衣殼蛋白包含下 列殘基:M457，A492，D499 和 Y533。
[0145] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV2衣殼蛋白在位置 312上不是突變的，例如變體AAV2衣殼蛋白包含殘基N312(其存在于野生型AAV2衣殼蛋白 中）。因此，在一些實(shí)施方案中，變體AAV2衣殼蛋白可包含上述特定突變的1至13個，但不包 含突變N312S。
[0146] 來自其它血清型的變體AAV衣殼蛋白
[0147] 在其它實(shí)施方案中，變體AAV衣殼蛋白來自替代的AAV血清型，即除AAV2W外的AAV 血清型。例如，變體AAV衣殼蛋白可W來源于AAV1，AAV3B，AAV-LK03，AAV5，AAV6，AAV8，AAV9 或AAV10(例如AAVrhlO)衣殼蛋白。
[0148] 在運(yùn)些實(shí)施方案中，變體AAV衣殼蛋白在相應(yīng)于上文關(guān)于AAV2描述的位置的一個 或多個位置上包含至少一個氨基酸取代。換句話說，變體AAV衣殼蛋白在替代的（即非AAV2) AAV衣殼蛋白序列中相應(yīng)于AAV2衣殼蛋白序列的位置125、151、162、205、312、457、492、499、 533、546、548、585、588和/或593的位置上包含至少一個氨基酸取代。
[0149] 基于各種AAV血清型的衣殼蛋白的氨基酸序列的比較，本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道如 何鑒定來自替代的AAV血清型的衣殼蛋白中相應(yīng)于AAV2衣殼蛋白的位置125、151、162、205、 312、457、492、499、533、546、548、585、588和/或593的位置。特別地，運(yùn)樣的位置可^通過本 領(lǐng)域中已知的和本文中所描述的序列比對來容易地鑒定。例如，一個運(yùn)樣的序列比對在圖9 中提供。
[0150] 在此上下文中特別相關(guān)的是替代的AAV衣殼蛋白序列中在S維空間中相應(yīng)于AAV2 衣殼蛋白的位置 125、151、162、205、312、457、492、499、533、546、548、585、588和/或593的位 置。用于=維建模和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的比對的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且可W用于鑒 定非AAV2衣殼蛋白序列中的運(yùn)樣的相應(yīng)的位置。AAV2衣殼蛋白序列與替代的AAV血清型(例 如八4￥1，44￥5,44￥6,44￥8和44￥9)的衣殼蛋白序列的示例性30比對顯示于圖21至25中并在 下文進(jìn)行討論。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W進(jìn)行與來自其它血清型（例如AAV2，AAV3，AAV7，AAV10 和AAV 12)的衣殼蛋白的類似3D比對，并鑒定運(yùn)樣的序列中相應(yīng)于AAV2中上文定義的位置 的位置。
[0151] 變體AAV1衣殼蛋白
[0152] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV1衣殼蛋白。在此實(shí)施方案中，變體AAV1衣殼 蛋白在AAV1衣殼蛋白序列中的一個或多個下列位置上包含至少一個氨基酸取代:125,151, 162，205，313，458，493，500，5：34，547，549，586，589 和/或 594。AAV1 衣殼蛋白 VP1 中的運(yùn)些位 置相應(yīng)于上文關(guān)于AAV2所公開的那些。
[0153] 野生型AAV1衣殼蛋白VP1的序列是已知的，并在圖3中示出（SEQ ID N0:3)。野生型 AAV1衣殼蛋白序列還可獲自數(shù)據(jù)庫登錄號：NC-002077。優(yōu)選地，變體AAV1衣殼蛋白與SEQ ID NO:3具有至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至 少99 %的序列同一性。
[0154] 野生型AAV1衣殼蛋白VP1已在相應(yīng)于存在于上文公開的變體AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID N0:1)中的氨基酸殘基的位置上包含下列殘 基：S205(與ttAAV2 中的S205對齊）；G549(與ttAAV2中的G548對齊）；S586(與ttAAV2 中的 S585對齊）；和巧89(與ttAAV2中的巧88對齊）。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體AAV1衣殼蛋 白相對于野生型AAV1衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代：V125I，Q151A，T162S, N313S，M58M，K493A，N500D，F(xiàn)5：MY，S547D 和 / 或G594S。通常地，運(yùn)樣的變體AAV1 衣殼蛋白可 與變體AAV2衣殼蛋白（SEQ ID NO: 2，ttAAV2)共享一個或多個功能特性，例如可賦予相較于 野生型AAV1衣殼蛋白增加的神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0155] 在替代實(shí)施方案中，變體AAV1衣殼蛋白包含相應(yīng)于存在于ttAAV2中的突變轉(zhuǎn)換回 野生型AAV2序列的一個或多個氨基酸取代。例如，變體AAV1衣殼蛋白可W包含一個或多個 下列取代：S205T，G54犯，S586R和/或巧89R。通常地，運(yùn)樣的變體AAV1衣殼蛋白可與野生型 AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:1)共享一個或多個功能特性，例如可賦予相較于野生型AAV1衣 殼蛋白降低的神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0156] 變體AAV5衣殼蛋白
[0157] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV5衣殼蛋白。在此實(shí)施方案中，變體AAV5衣殼 蛋白在AAV5衣殼蛋白序列中的一個或多個下列位置上包含至少一個氨基酸取代:124，150， 153,195,303,444,479,486,520,533,537,575,578 和/或 583dAAV5衣殼蛋白 VP1 中的運(yùn)些位 置相應(yīng)于上文關(guān)于AAV2所公開的那些。
[0158] 野生型AAV5衣殼蛋白VP1的序列是已知的，并在圖4中示出（SEQ ID N0:4)。野生型 AAV5衣殼蛋白序列還可獲自數(shù)據(jù)庫登錄號:AF085716。優(yōu)選地，變體AAV5衣殼蛋白與SEQ ID NO:4具有至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少 99%的序列同一性。
[0159] 野生型AAV5衣殼蛋白VPl已在相應(yīng)于存在于上文公開的變體AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID N0:1)中的氨基酸殘基的位置上包含下列殘 基:G537(與 ttAAV2 中的 G548 對齊）；S575(與 ttAAV2 中的 S585 對齊）；T578(與 ttAAV2 中的 T588對齊）。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體AAV5衣殼蛋白相對于野生型AAV5衣殼蛋白包 含一個或多個下列氨基酸取代：V124I，K150A，K153S，A195S，R303S，T444M，S479A，V48 抓， T520Y，P533D和/或G583S。通常地，運(yùn)樣的變體AAV5衣殼蛋白可與變體AAV2衣殼蛋白（SEQ ID NO: 2，ttAAV2)共享一個或多個功能特性，例如可賦予相較于野生型AAV5衣殼蛋白增加 的神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0160] 在替代實(shí)施方案中，變體AAV5衣殼蛋白包含相應(yīng)于存在于ttAAV2中的突變轉(zhuǎn)換回 野生型AAV2序列的一個或多個氨基酸取代。例如，變體AAV5衣殼蛋白可W包含一個或多個 下列取代:G537E，S575R和/或巧78R。通常地，運(yùn)樣的變體AAV5衣殼蛋白可與野生型AAV2衣 殼蛋白（SEQ ID NO: 1)共享一個或多個功能特性，例如可賦予相較于野生型AAV5衣殼蛋白 降低的神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0161] 變體AAV6衣殼蛋白
[0162] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV6衣殼蛋白。在此實(shí)施方案中，變體AAV6衣殼 蛋白在AAV6衣殼蛋白序列中的一個或多個下列位置上包含至少一個氨基酸取代:125,151, 162，205，313，458，493，500，5：34，547，549，586，589 和/或 594。AAV6衣殼蛋白 VP1 中的運(yùn)些位 置相應(yīng)于上文關(guān)于AAV2所公開的那些。
[0163] 野生型AAV6衣殼蛋白VP1的序列是已知的，并在圖5中示出（SEQ ID N0:5)。野生型 AAV6衣殼蛋白序列還可獲自數(shù)據(jù)庫登錄號:AF028704。優(yōu)選地，變體AAV6衣殼蛋白與SEQ ID NO:5具有至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少 99%的序列同一性。
[0164] 野生型AAV6衣殼蛋白VP1已在相應(yīng)于存在于上文公開的變體AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID N0:1)中的氨基酸殘基的位置上包含下列殘 基：S205(與ttAAV2 中的S205對齊）；G549(與ttAAV2中的G548對齊）；S586(與ttAAV2 中的 S585對齊）；巧89(與ttAAV2中的巧88對齊）。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體AAV6衣殼蛋白 相對于野生型AAV6衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代:V125I，Q151A，T162S，N313S, M58M，K493A，N500D，F(xiàn)534Y，S547D和/或G594S。通常地，運(yùn)樣的變體AAV6衣殼蛋白可與變體 AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:2，ttAAV2)共享一個或多個功能特性，例如可賦予相較于野生型 AAV6衣殼蛋白增加的神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0165] 在替代實(shí)施方案中，變體AAV6衣殼蛋白包含相應(yīng)于存在于ttAAV2中的突變轉(zhuǎn)換回 野生型AAV2序列的一個或多個氨基酸取代。例如，變體AAV6衣殼蛋白可W包含一個或多個 下列取代：S205T，G54犯，S586R和/或巧89R。通常地，運(yùn)樣的變體AAV6衣殼蛋白可與野生型 AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:1)共享一個或多個功能特性，例如可賦予相較于野生型AAV6衣 殼蛋白降低的神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0166] 變體AAV8衣殼蛋白
[0167] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV8衣殼蛋白。在此實(shí)施方案中，變體AAV8衣殼 蛋白在AAV8衣殼蛋白序列中的一個或多個下列位置上包含至少一個氨基酸取代:125,151, 163,206,315,460,495,502,536,549,551,588,591 和/或 596dAAV8衣殼蛋白 VP1 中的運(yùn)些位 置相應(yīng)于上文關(guān)于AAV2所公開的那些。
[016引野生型AAV8衣殼蛋白VP1的序列是已知的，并在圖6中示出（SEQ ID N0:6)。野生型 AAV8衣殼蛋白序列還可獲自數(shù)據(jù)庫登錄號：NC_006261。優(yōu)選地，變體AAV8衣殼蛋白與SEQ ID NO:6具有至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至 少99 %的序列同一性。
[0169] 野生型AAV8衣殼蛋白VP1已在相應(yīng)于存在于上文公開的變體AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID N0:1)中的氨基酸殘基的位置上包含下列殘 基:S315(與ttAAV2中的S312對齊）；T591(與ttAAV2中的T588對齊）。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代： ￥1251，91514，1(1635,42065^4601^4954，服020，尸536￥，服490,45516,95885和/或65965。 通常地，運(yùn)樣的變體AAV8衣殼蛋白可與變體AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:2，ttAAV2)共享一個 或多個功能特性，例如可賦予相較于野生型AAV8衣殼蛋白增加的神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的 感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0170] 在替代實(shí)施方案中，變體AAV8衣殼蛋白包含相應(yīng)于存在于ttAAV2中的突變轉(zhuǎn)換回 野生型AAV2序列的一個或多個氨基酸取代。例如，變體AAV8衣殼蛋白可W包含一個或多個 下列取代：S315N和/或T591R。通常地，運(yùn)樣的變體AAV8衣殼蛋白可與野生型AAV2衣殼蛋白 (SEQ ID NO: 1)共享一個或多個功能特性，例如可賦予相較于野生型AAV8衣殼蛋白降低的 神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0171] 在一個實(shí)施方案中，變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣殼蛋白在AAV8衣殼蛋 白序列的位置315上包含氨基酸取代。例如，變體AAV8衣殼蛋白可包含殘基N315。因此，在一 個實(shí)施方案中，變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣殼蛋白包含氨基酸取代S315N。
[0172] 變體AAV9衣殼蛋白
[0173] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV9衣殼蛋白。在此實(shí)施方案中，變體AAV9衣殼 蛋白在AAV9衣殼蛋白序列中的一個或多個下列位置上包含至少一個氨基酸取代:125,151, 162，205，314，458，493，500，5：34，547，549，586，589 和/或 594。AAV9衣殼蛋白 VP1 中的運(yùn)些位 置相應(yīng)于上文關(guān)于AAV2所公開的那些。
[0174] 野生型AAV9衣殼蛋白VP1的序列是已知的，并在圖7中示出（SEQ ID N0:7)。野生型 AAV9衣殼蛋白序列還可獲自數(shù)據(jù)庫登錄號:AY530579。優(yōu)選地，變體AAV9衣殼蛋白與SEQ ID NO:7具有至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少 99%的序列同一性。
[0175] 野生型AAV9衣殼蛋白VP1已在相應(yīng)于存在于上文公開的變體AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID N0:1)中的氨基酸殘基的位置上包含下列殘 基：S162(與ttAAV2 中的S162對齊）；S205(與ttAAV2中的S205對齊）；G549(與ttAAV2 中的 G548對齊）；S586 (與ttAAV2中的S585對齊）。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體AAV9衣殼蛋白 相對于野生型AAV1衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代:L125I，Q151A，N314S，Q458M, V493A，E500D，F(xiàn)534Y，G547D，A589T和/或G594S。通常地，運(yùn)樣的變體AAV9衣殼蛋白可與變體 AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:2，ttAAV2)共享一個或多個功能特性，例如可賦予相較于野生型 AAV9衣殼蛋白增加的神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0176] 在替代實(shí)施方案中，變體AAV9衣殼蛋白包含相應(yīng)于存在于ttAAV2中的突變轉(zhuǎn)換回 野生型AAV2序列的一個或多個氨基酸取代。例如，變體AAV9衣殼蛋白可W包含一個或多個 下列取代：S162A，S205T，G54犯和/或巧89R。通常地，運(yùn)樣的變體AAV9衣殼蛋白可與野生型 AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:1)共享一個或多個功能特性，例如可賦予相較于野生型AAV9衣 殼蛋白降低的神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0177] 變體AAV10衣殼蛋白
[0178] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV10衣殼蛋白。如本文所使用，"AAV10"包括 AAVrhlO。在此實(shí)施方案中，變體AAV10(例如AAVrhlO)衣殼蛋白在AAV10衣殼蛋白序列中的 一個或多個下列位置上包含至少一個氨基酸取代：125,151，163,206,315，460,495,502， 536，549，551，588，591和/或596 dAAVIO衣殼蛋白VP1中的運(yùn)些位置相應(yīng)于上文關(guān)于AAV2所 公開的那些。
[0179] 野生型AAV10衣殼蛋白VP1的序列是已知的，并在圖8中示出（SEQ ID N0:8)。優(yōu)選 地，變體AAV10衣殼蛋白與沈Q ID NO:8具有至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少 96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
[0180] 野生型AAV10衣殼蛋白VP1已在相應(yīng)于存在于上文公開的變體AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID N0:1)中的氨基酸殘基的位置上包含下列殘 基:G55U與ttAAV2中的G548對齊）。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體AAV10衣殼蛋白相對于 野生型AAV10衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代：V125I，Q151A，K163S，A206S, N315S，T460M，L495A，N502D，F(xiàn)536Y，G549D，Q588S，A591T和/或G596S。通常地，運(yùn)樣的變體 AAV10衣殼蛋白可與變體AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:2，ttAAV2)共享一個或多個功能特性， 例如可賦予相較于野生型AAV10衣殼蛋白增加的神經(jīng)元的或視網(wǎng)膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn) 導(dǎo)。
[0181] 在替代實(shí)施方案中，變體AAV10衣殼蛋白包含相應(yīng)于存在于ttAAV2中的突變轉(zhuǎn)換 回野生型AAV2序列的一個或多個氨基酸取代。例如，變體AAV10衣殼蛋白可W包含下列取 代:G55化。通常地，運(yùn)樣的變體AAV10衣殼蛋白可與野生型AAV2衣殼蛋白（SEQ ID N0:1)共 享一個或多個功能特性，例如可賦予相較于野生型AAV10衣殼蛋白降低的神經(jīng)元的或視網(wǎng) 膜組織的感染性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0182] 變體AAV3B衣殼蛋白
[0183] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV3B衣殼蛋白。在此實(shí)施方案中，變體AAV3B衣 殼蛋白相對于野生型AAV3B衣殼蛋白可在位置312上包含氨基酸取代。例如，變體AAV3B衣殼 蛋白可包含殘基N312。因此，在一個實(shí)施方案中，變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣殼 蛋白包含氨基酸取代S312N。在其它實(shí)施方案中，變體AAV3B衣殼蛋白可在相應(yīng)于上文關(guān)于 AAV2所公開的那些的位置上包含一個或多個額外的突變。
[0184] 野生型AAV3B衣殼蛋白VP1的序列是已知的，并在圖38中示出（SEQ ID N0:11)。野 生型AAV3B衣殼蛋白序列還可獲自NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號:AF028705。優(yōu)選地，變體AAV3B衣殼蛋 白與SEQ ID NO: 11具有至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至 少98 %或至少99 %的序列同一性。
[0185] 變體AAV-LK03衣殼蛋白
[0186] 在一個實(shí)施方案中，載體包含變體AAV-LK03衣殼蛋白。在此實(shí)施方案中，變體AAV- LK03衣殼蛋白相對于如SEQ ID ^:12定義的44￥-〇(03衣殼蛋白序列可在位置312上包含氨 基酸取代。例如，變體AAV-LK03衣殼蛋白可包含殘基N312。因此，在一個實(shí)施方案中，變體 AAV-LK03衣殼蛋白相對于如SEQ ID顯：12定義的44￥-〇(03衣殼蛋白序列包含氨基酸取代 S312N。在其它實(shí)施方案中，變體AAV-LK03衣殼蛋白可在相應(yīng)于上文關(guān)于AAV2所公開的那些 的位置上包含一個或多個額外的突變。
[0187] 野生型AAV-LK03衣殼蛋白VP1的序列是已知的，并在圖39中示出（SEQ ID N0:12)。 野生型AAV-LK03衣殼蛋白序列還在WO 2013/029030中公開為其中的序列號31。優(yōu)選地，變 體AAV-LK03衣殼蛋白與沈Q ID NO: 12具有至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少 96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。
[018引基因產(chǎn)物
[0189] 在一個實(shí)施方案中，rAAV還包含異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核巧酸序列。 "基因"是指含有至少一個開放閱讀框的多核巧酸，所述開放閱讀框能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯后編 碼特定蛋白質(zhì)。"基因產(chǎn)物"是特定基因的表達(dá)產(chǎn)生的分子?；虍a(chǎn)物包括，例如，多膚、適 體、干擾RNA、mRNA等。
[0190] "異源"意指來源于與進(jìn)行比較的實(shí)體的其余部分基因型不同的實(shí)體。例如，通過 遺傳工程技術(shù)引入至來自不同物種的質(zhì)?；蜉d體的多核巧酸是異源多核巧酸。從其天然編 碼序列中移除和可操作地連接至與其不是天然發(fā)現(xiàn)連接的編碼序列的啟動子是異源啟動 子。因此，例如，包含編碼異源基因產(chǎn)物的異源核酸的rAAV是包含通常不包括在天然存在的 野生型AAV中的核酸的rAAV，并且所編碼的異源基因產(chǎn)物是通常不由天然存在的野生型AAV 編碼的基因產(chǎn)物。
[0191] 在一些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物是干擾RNA。在一些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物是適體。在 一些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物是多膚。
[0192] 干擾 RNA
[0193] 當(dāng)基因產(chǎn)物是干擾RNA(RNAi)時，合適的RNAi包括降低細(xì)胞中的調(diào)亡或血管生成 因子的水平的RNAi。例如，RNAi可W是減少誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞中的調(diào)亡的基因產(chǎn)物的水平的 shRNA或siRNA。其基因產(chǎn)物誘導(dǎo)或促進(jìn)調(diào)亡的基因在本文中稱為"促調(diào)亡基因"并且運(yùn)些基 因的產(chǎn)物(mRNA;蛋白質(zhì)）被稱為"促調(diào)亡基因產(chǎn)物"。促調(diào)亡基因產(chǎn)物包括，例如，Bax, Bid, Bak和Bad基因產(chǎn)物。參見，例如，美國專利號7,846,730。
[0194] 干擾RNA還可W針對血管生成產(chǎn)物，例如VEGF(例如，Cand5;參見，例如，美國專利 公開號 2011/0143400;美國專利公開號 2008/0188437;和 Reich 等人（2003)M〇1. Vis. 9: 210)，VEGFR1 (例女日，Sirna-027;參見，例女日，Kaiser 等人（2010)Am.J.0 地 thalmol.l50:33; 和aien等人（2006)Gene Ther.l3:225)，或VEGFR2化OU等人（2005)Biochem.44:15064))。還 參見，美國專利號6，649，596，6，399，586，5，661，135，5，639，872和5，639，736;和美國專利 號7,947,659和7,919,473。
[0195] "小干擾"或"短干擾RNA"或siRNA是祀向至目標(biāo)基因（"祀基因"）的核巧酸的RNA雙 鏈體。"RNA雙鏈體"是指通過RNA分子的兩個區(qū)域之間的互補(bǔ)配對形成的結(jié)構(gòu)。siRNA是"祀 向"至基因的，因為siRNA的雙鏈體部分的核巧酸序列與祀基因的核巧酸序列互補(bǔ)。在一些 實(shí)施方案中，SiRNA的雙鏈體的長度小于30個核巧酸。在一些實(shí)施方案中，雙鏈體的長度可 W 是 29,28,27,26,25,24,23,22,21，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11或10個核巧酸。在一 些實(shí)施方案中，雙鏈體的長度為19-25個核巧酸。SiRNA的RNA雙鏈體部分可W是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 一部分。除了雙鏈體部分外，發(fā)夾結(jié)構(gòu)還可包含位于形成雙鏈體的兩個序列之間的環(huán)部分。 環(huán)的長度可W變化。在一些實(shí)施方案中，環(huán)的長度為5,6,7,8,9,10,11，12或13個核巧酸。發(fā) 夾結(jié)構(gòu)還可W包含3'或5'突出部分。在一些實(shí)施方案中，突出端是長度為0、1、2、3、4或5的 3'或5'突出核巧酸。
[0196] "短發(fā)夾RNA"或shRNA是可W被產(chǎn)生W表達(dá)干擾RNA諸如siRNA的多核巧酸構(gòu)建體。
[0197] 適體
[0198] 當(dāng)基因產(chǎn)物是適體時，示例性目標(biāo)適體包括針對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的 適體。參見，例如，Ng等人（2006)化 t. Rev. Drug Discove巧 5:123;和 Lee 等人（2005) Proc.化tl. Acad. Sci . USA 102:18902。還適合使用的是PDGF特異性適體，例如，E10030;參 見，例如，Ni and Hui(2009)0phthalmologica 223:401;和Akiyama等人（2006)J.Cell Physiol.207:407)〇
[0199] 多膚
[0200] 在一個實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物是治療性蛋白質(zhì)。"治療性"膚或蛋白是可減輕或減 少細(xì)胞或受試者中由蛋白的缺失或缺陷造成的癥狀的膚或蛋白質(zhì)?；蛘撸?治療性"膚或蛋 白質(zhì)是在其它方面賦予受試者益處例如抗退化作用的膚或蛋白質(zhì)。
[0201] 當(dāng)基因產(chǎn)物是多膚時，多膚通常是增強(qiáng)細(xì)胞的功能的多膚，所述細(xì)胞例如為存在 于神經(jīng)元、視網(wǎng)膜或肝臟組織中的細(xì)胞，例如肝細(xì)胞，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，視桿或視錐感 光細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，米勒細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長突細(xì)胞，水平細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮 細(xì)胞。
[0202] 示例性多膚包括神經(jīng)保護(hù)多膚(例如，GDNF，CNTF，NT4，NGF，W及NTN);抗血管生成 多膚(例如，可溶性血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體;VEGF結(jié)合抗體;VEGF結(jié)合抗體片段(例 如，單鏈抗VEGF抗體）；內(nèi)皮抑素；腫瘤抑素；血管抑素；可溶性Fit多膚化ai等人（2005) Mol. llier. 12:659);包含可溶性Fit多膚的化融合蛋白（參見，例如，Pechan等人(2009)Gene 化er. 16:10);色素上皮源性因子(P邸F);可溶性Tie-2受體;等等）；金屬蛋白酶-3的組織抑 制劑（TIMP-3);光響應(yīng)視蛋白，例如視紫紅質(zhì)；抗細(xì)胞調(diào)亡多膚（例如，Be 1-2，Be 1 -XI);等 等。合適的多膚包括但不限于膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF);成纖維細(xì)胞生長因子2;神經(jīng) 生長因子(neudurinKNTN);睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF);神經(jīng)生長因子(NGF);神經(jīng)營養(yǎng)蛋 白-4(NT4);腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(抓NF);表皮生長因子;視紫紅質(zhì);X連鎖的調(diào)亡抑制劑;和 音獵因子(Sonic hedgehog)。合適的多膚公開于例如W0 2012/145601中。
[0203] 用于基因遞送至肝臟的示例性多膚包括例如，PBGD(膽色素原脫氨酶HDUA(艾杜 糖醒酸酶)化h(延胡索酷乙酷乙酸水解酶)A1 AT(a (1)-抗膜蛋白酶），1A1AUGT1A1)(尿巧二 憐酸葡糖醒酸基轉(zhuǎn)移酶），HCCS1(肝細(xì)胞癌抑制蛋白1)，CD(胞喀晚脫氨酶），S0CS3(細(xì)胞因 子信號傳導(dǎo)抑制蛋白3)，TNF(腫瘤壞死因子），胸巧激酶，化-24(白細(xì)胞介素24)，化-12(白 細(xì)胞介素-12)，和TRAIU腫瘤壞死因子相關(guān)的調(diào)亡誘導(dǎo)配體）。
[0204] 調(diào)控序列
[0205] 在一些實(shí)施方案中，編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物的核巧酸序列可操作地連接至組成型啟動 子。在其它實(shí)施方案中，編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物的核巧酸序列可操作地連接至誘導(dǎo)型啟動子。在 一些情況下，編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物的核巧酸序列可操作地連接至組織特異性或細(xì)胞類型特異 性調(diào)節(jié)元件。
[0206] 例如，在一些情況下，編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物的核巧酸序列可操作地連接至肝細(xì)胞特 異性、神經(jīng)元特異性或光感受器特異性的調(diào)控元件(例如，光感受器特異性啟動子），例如， 在神經(jīng)元或光感受器細(xì)胞中賦予可操作地連接的基因的選擇性表達(dá)的調(diào)控元件。合適的光 感受器特異性調(diào)控元件包括，例如，視紫紅質(zhì)啟動子；視紫紅質(zhì)激酶啟動子（Young等人 (2003 )0phthalmol. Vis. Sci. 44 :4076);師溝酸二醋酶基因啟動子（Nicoud 等人（2007) J.Gene Med.9:1015);色素性視網(wǎng)膜炎基因啟動子(Nicoud等人(2007)同上）；光感受器間 類維生素 A結(jié)合蛋白（IRBP)基因增強(qiáng)子（Nicoud等人（2007)同上）；IRBP基因啟動子 (Yokoyama等人（1992化邱Eye Res. 55:225)。合適的神經(jīng)元特異性啟動子包括神經(jīng)元特異 性締醇化酶(N沈）啟動子，Andersen等人Cell .Mol .Neurobiol .，13:503-15( 1993);神經(jīng)絲 輕鏈基因啟動子，？1。。1〇11等人，？'〇。.化11.4。日(1.5。1.1]54,88:561 1-5(1991);和神經(jīng)元 特異性vgf基因啟動子，Piccioli等人,Neuron, 15:373-84(1995);等等。合適的肝細(xì)胞特異 性啟動子包括白蛋白啟動子化eard等人，Mol Cell Biol 1987:7:2425)或al-抗膜蛋白酶 啟動子化afenrichter等人Blood 1994; 84，3394-404)。
[0207] "控制元件"或"控制序列"是參與有助于多核巧酸的功能調(diào)節(jié)(包括多核巧酸的復(fù) 審IJ，倍增，轉(zhuǎn)錄，剪接，翻譯，或降解)的分子的相互作用的核巧酸序列。調(diào)節(jié)可影響過程的頻 率、速度或特異性，并且在自然界中可W是增強(qiáng)性或抑制性的。本領(lǐng)域中已知的控制元件包 括例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，例如啟動子和增強(qiáng)子。啟動子是在某些條件下能夠結(jié)合RNA聚合酶 并啟動通常位于下游(3'方向）的編碼區(qū)從該啟動子的轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。
[0208] "可操作地連接"或"有效連接"指的是遺傳元件的并置，其中所述元件處于允許它 們W預(yù)期的方式操作的關(guān)系。例如，如果啟動子幫助啟動編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子可操作 地連接至編碼區(qū)。在啟動子和編碼區(qū)之間可存在插入殘基，只要該功能關(guān)系得到維持。
[0209] 如本文所用的術(shù)語"啟動子"可W指位于編碼重組產(chǎn)物的DNA序列的相鄰位置的 DNA序列。啟動子優(yōu)選地可操作地連接至相鄰的DNA序列。相較于在沒有啟動子存在時表達(dá) 的重組產(chǎn)物的量，啟動子通常增加從DNA序列表達(dá)的重組產(chǎn)物的量。來自一種生物體的啟動 子可被用來增強(qiáng)源自另一種生物體的DNA序列的重組產(chǎn)物表達(dá)。例如，脊椎動物啟動子可W 用于水母GFP在脊椎動物中的表達(dá)。此外，一個啟動子元件可W增加串聯(lián)的多個DNA序列表 達(dá)的重組產(chǎn)物的量。因此，一個啟動子元件可增加一個或多個重組產(chǎn)物的表達(dá)。多種啟動子 元件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的。
[0210] 如本文所用的術(shù)語"增強(qiáng)子"可W指位于編碼重組產(chǎn)物的DNA序列的相鄰位置的 DNA序列。增強(qiáng)子元件通常位于啟動子元件的上游或可W位于編碼DNA序列（例如，轉(zhuǎn)錄或翻 譯成重組產(chǎn)物的DNA序列）的下游或編碼DNA序列之中。因此，增強(qiáng)子元件可W位于編碼重組 產(chǎn)物的DNA序列的上游或下游100個堿基對、200個堿基對、或300或多個堿基對。增強(qiáng)子元件 可W增加從上述由啟動子元件增加了表達(dá)的DNA序列表達(dá)的重組產(chǎn)物的量。多種增強(qiáng)子元 件對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是容易獲得的。
[0W]藥物組合物
[0212] 本公開內(nèi)容提供了藥物組合物:a)如上文所述的rAAV載體;和b)藥學(xué)上可接受的 載體、稀釋劑、賦形劑或緩沖液。在一些實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑 或緩沖液適用于人類使用。
[0213] 運(yùn)樣的賦形劑、載體、稀釋劑和緩沖液包括可W被施用而沒有不適當(dāng)?shù)亩拘缘娜?何藥劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑包括，但不限于，液體，例如水、鹽水、甘油和乙醇。
[0214] 藥學(xué)上可接受的鹽可W包含在其中，例如，無機(jī)酸鹽如鹽酸鹽，氨漠酸鹽，憐酸鹽， 硫酸鹽，等;和有機(jī)酸的鹽如乙酸鹽，丙酸鹽，丙二酸鹽，苯甲酸鹽，等。此外，輔助性物質(zhì)可 W存在于運(yùn)樣的媒介物中，所述輔助性物質(zhì)為例如潤濕劑或乳化劑，抑緩沖物質(zhì)，等。廣泛 多樣的藥學(xué)上可接受的賦形劑在本領(lǐng)域中是已知的并且不需要在運(yùn)里詳細(xì)地討論。藥學(xué)上 可接受的賦形劑已在各種出版物中充分描述，包括，例如，A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy ,"20th edition ,Lippincott,Wi11iams, & Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel 等人，eds. ,7(th)ed. ,Lippincott,Williams,&Wilkins;和Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人，eds. ,3rd ed.Amer.Pharmaceutical Assoc。
[0215] 在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含在藥學(xué)上可接受的載體或其它藥劑、藥 物、載體、佐劑、稀釋劑等中的如上文所述的rAAV載體的藥物組合物。對于注射，載體通常將 是液體。對于其它施用方法，載體可W是固體或液體，例如無菌無熱原的水或無菌無熱原的 憐酸緩沖鹽水溶液。對于吸入施用，載體將是可吸入的，并且將優(yōu)選為固體或液體顆粒的形 式。作為注射介質(zhì)，優(yōu)選使用包含通常用于注射溶液的添加劑例如穩(wěn)定劑、鹽或鹽水和/或 緩沖液的水。
[0216] "藥學(xué)上可接受的"是指不是生物學(xué)上或其它方面不期望的，例如，該材料可施用 至受試者而不引起任何不期望的生物效應(yīng)。因此，運(yùn)樣的藥物組合物可W例如用于細(xì)胞的 離體轉(zhuǎn)染或用于直接施用病毒顆?；蚣?xì)胞至受試者。
[0217] 遞送基因產(chǎn)物至組織或細(xì)胞(例如肝臟、神經(jīng)元或視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞）的方法和治 療方法
[0218] 本發(fā)明的方法提供了用于遞送異源核酸序列至宿主組織或細(xì)胞(包括分裂和非分 裂細(xì)胞）中的手段。本發(fā)明的載體和其它試劑、方法和藥物制劑另外地可用于施用蛋白質(zhì)或 膚至有此需要的受試者的方法，作為治療或其它的方法。W運(yùn)種方式，蛋白質(zhì)或膚可因此在 受試者中體內(nèi)產(chǎn)生。受試者可能需要該蛋白質(zhì)或膚，因為受試者具有該蛋白質(zhì)或膚的缺陷， 或因為在受試者中蛋白質(zhì)或膚的產(chǎn)生可賦予一定的治療效應(yīng)，從而作為治療或其它的方 法，并且如在下文進(jìn)一步解釋。
[0219] 如本文所用，術(shù)語"治療"、"醫(yī)治"等是指獲得所需的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效應(yīng)。該 效應(yīng)在完全或部分防止疾病或其癥狀方面可W是預(yù)防性的和/或在疾病和/或可歸因于該 疾病的不利影響的部分或完全治愈方面可W是治療性的。如本文所用的"治療"涵蓋哺乳動 物特別是人中的疾病的任何治療，并且包括：（a)預(yù)防疾病在可能易患該疾病或處于發(fā)生該 疾病的風(fēng)險中但還沒有被診斷為患有其的受試者中發(fā)生；（b)抑制疾病，即，阻止其發(fā)展;和 (C)緩解疾病，即，導(dǎo)致疾病的消退。
[0220] 在一般情況下，本發(fā)明可W用于遞送具有生物效應(yīng)的任何外來核酸W治療或改善 與任何器官、組織或細(xì)胞中的基因表達(dá)相關(guān)的任何病癥相關(guān)聯(lián)的癥狀，特別是與例如肝臟、 腦或眼相關(guān)聯(lián)的那些癥狀。示例性疾病狀態(tài)包括，但不限于:溶酶體膽積癥，急性間歇性化 嘟，鳥氨酸氨甲酯轉(zhuǎn)移酶缺乏癥，曰（1)-抗膜蛋白酶缺乏癥，急性肝臟功能衰竭，龐皮病，酪 氨酸血癥，克里格勒一納賈爾綜合征，肝炎，肝硬化，肝細(xì)胞癌，AIDS,阿爾茨海默氏病，帕金 森氏病，亨廷頓氏病，肌萎縮性側(cè)索硬化癥，癒痛癥，和其它神經(jīng)病癥，癌癥(例如腦癌），視 網(wǎng)膜變性疾病和其它眼部疾病。
[0221] 基因轉(zhuǎn)移在理解和提供用于疾病狀態(tài)的治療中具有實(shí)質(zhì)性的潛在用途。存在許多 其中有缺陷的基因是已知的并已被克隆的遺傳性疾病。在某些情況下，運(yùn)些克隆的基因的 功能是已知的。在一般情況下，上述的疾病狀態(tài)分為兩類:缺陷性狀態(tài)，通常為酶的，其通常 W隱性方式遺傳，和不平衡狀態(tài)，至少有時設(shè)及調(diào)節(jié)或結(jié)構(gòu)蛋白，其W顯性方式遺傳。對于 缺陷性狀態(tài)疾病，基因轉(zhuǎn)移可用于將正常基因引入受影響的組織用于替代療法，W及用于 使用反義突變創(chuàng)建疾病的動物模型。對于不平衡疾病狀態(tài)，基因轉(zhuǎn)移可用于創(chuàng)建模型系統(tǒng) 中的疾病狀態(tài)，其可隨后嘗試用于消除疾病狀態(tài)。因此本發(fā)明的方法允許遺傳性疾病的治 療。如本文所使用的，疾病狀態(tài)通過部分或全部地補(bǔ)救導(dǎo)致疾病或使其更嚴(yán)重的缺陷或不 平衡來治療。使用核酸序列的位點(diǎn)特異性整合W引起突變或糾正缺陷也是可能的。
[0222] 在一個方面，本發(fā)明提供了遞送基因產(chǎn)物至受試者的組織或細(xì)胞(例如，肝臟、神 經(jīng)元或視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞）的方法，該方法包括給受試者施用如上所述的rAAV載體?；虍a(chǎn) 物可W是多膚或干擾RNA(例如，shRNA，SiRNA等），或適體，例如如上文所述的。細(xì)胞可W是 例如血細(xì)胞，干細(xì)胞，骨髓(例如造血)細(xì)胞，肝細(xì)胞，癌細(xì)胞，血管細(xì)胞，膜腺細(xì)胞，神經(jīng)細(xì) 胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，眼或視網(wǎng)膜細(xì)胞，上皮或內(nèi)皮細(xì)胞，樹突細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，肺細(xì)胞，肌細(xì) 胞，屯、肌細(xì)胞，腸細(xì)胞或腎細(xì)胞。類似地，組織可W例如選自血液，骨髓，肌肉組織(例如骨骼 肌，屯、肌或平滑肌包括血管平滑?。?，中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)組織（例如，腦、神經(jīng)元組織或視 網(wǎng)膜組織），膜腺組織，肝臟組織，腎組織，肺組織，腸組織或屯、臟組織。
[0223] 遞送基因產(chǎn)物至視網(wǎng)膜細(xì)胞可W提供視網(wǎng)膜疾病的治療。視網(wǎng)膜細(xì)胞可W是光感 受器，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，米勒細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長突細(xì)胞，水平細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì) 胞。在一些情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞為感光細(xì)胞，例如，視桿或視錐細(xì)胞。類似地，遞送基因產(chǎn)物 至神經(jīng)元組織或細(xì)胞可W提供神經(jīng)障礙的治療?；虍a(chǎn)物可被傳遞至存在于神經(jīng)元組織中 的各種細(xì)胞類型，例如神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(例如星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞等等）。遞 送基因產(chǎn)物至肝臟可W提供肝臟病癥的治療。基因產(chǎn)物可被遞送至例如肝細(xì)胞。
[0224] 本公開內(nèi)容提供了治療疾病(例如，肝臟、神經(jīng)或眼部疾?。┑姆椒?，該方法包括對 有需要的個體施用有效量的如上所述的rAAV載體。受試者rAAV載體可W通過煩內(nèi)注射，腦 內(nèi)注射，眼內(nèi)注射，通過玻璃體內(nèi)注射，視網(wǎng)膜注射，視網(wǎng)膜下注射，靜脈注射或通過任何其 它方便的施用模式或途徑施用。
[022引施用的其它示例性模式包括日服、直腸、經(jīng)粘膜、局部、透皮、吸入、腸胃外（例如， 靜脈內(nèi)，皮下，皮內(nèi)，肌內(nèi)，和關(guān)節(jié)內(nèi)）施用等，W及直接的組織或器官注射，可替代地，銷內(nèi)， 直接肌內(nèi)，屯、室內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。注射劑可常規(guī)形式制備，作為液 體溶液或懸浮液，適合于在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式，或作為乳液?；蛘撸?局部而非全身方式例如在膽庫或緩釋制劑中施用病毒。
[0226]重組病毒載體優(yōu)選W足W導(dǎo)致受試者的細(xì)胞(例如肝臟，神經(jīng)或視網(wǎng)膜細(xì)胞）中異 源核酸序列的感染(或轉(zhuǎn)導(dǎo)）和表達(dá)的量的施用至受試者。優(yōu)選地，祀細(xì)胞是肝細(xì)胞，神經(jīng)細(xì) 胞(包括中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞，特別是腦細(xì)胞)或視網(wǎng)膜細(xì)胞。在一些情況下，視網(wǎng)膜 細(xì)胞為感光細(xì)胞(例如，視桿和/或視錐細(xì)胞）。在其它情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞是RGC細(xì)胞。在其 它情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞是RPE細(xì)胞。在其它情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞可W包括無長突細(xì)胞，雙極細(xì) 胞，和水平細(xì)胞。
[0227]優(yōu)選地，載體W治療有效量施用。如本文所使用的"治療有效"量是足W減輕（例 如，緩解，降低，減少)與疾病狀態(tài)相關(guān)的至少一個癥狀的量。可替代地陳述地，"治療有效" 量是足W提供受試者的病況的一定改善的量。"治療有效量"將落入可W通過實(shí)驗和/或臨 床試驗確定的相對寬的范圍內(nèi)。例如，對于體內(nèi)注射，治療有效劑量將為約1 〇6至約1 〇is的 rAAV病毒體，例如約108至10"的rAAV病毒體的量級。對于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，待遞送至細(xì)胞的有效量 的rAAV病毒體將為約108至約l〇u的rAAV病毒體的量級。其它有效劑量可W由本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通過常規(guī)試驗建立劑量響應(yīng)曲線來容易地建立。
[02%]在一些實(shí)施方案中，可W采用多于一次施用（例如，兩次，=次，四次或更多次施 用）W在一段不同的時間間隔上（例如，每天，每周，每月，每年等)實(shí)現(xiàn)期望水平的基因表 達(dá)。
[0229] 可W治療的神經(jīng)性疾病包括與腦或CNS相關(guān)的任何疾病，包括精神疾病。腦的疾病 分為兩個一般種類：（a)病理過程諸如感染、創(chuàng)傷和腫瘤;和(b)神經(jīng)系統(tǒng)所特有的疾病，其 包括髓銷疾病和神經(jīng)元變性疾病。任何一類的疾病可W進(jìn)行治療。例如，神經(jīng)性疾病可W選 自神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)，脊髓性肌 萎縮和小腦變性;精神分裂癥;癒痛;缺血相關(guān)疾病和中風(fēng);脫髓銷疾病例如多發(fā)性硬化，靜 脈周腦炎，腦白質(zhì)營養(yǎng)不良例如因芳基硫酸醋酶A的缺乏引起的異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，因 半乳糖腦巧脂e-半乳糖巧酶的缺乏引起的克拉伯病，腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和腎上腺髓質(zhì) 神經(jīng)病;病毒后疾病，例如進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病，急性播散性腦脊髓炎，急性壞死性出血 性白質(zhì)腦炎；線粒體腦肌病;神經(jīng)癌，例如原發(fā)性腦腫瘤，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤，腦膜瘤，神經(jīng)銷 瘤，垂體腺瘤，髓母細(xì)胞瘤，煩咽管瘤，血管瘤，表皮樣瘤，肉瘤和從其它腫瘤來源的煩內(nèi)轉(zhuǎn) 移;神經(jīng)性感染或神經(jīng)炎癥性疾病。
[0230] 可利用本發(fā)明方法治療的眼部疾病包括，但不限于，急性黃斑視神經(jīng)視網(wǎng)膜病變； 白塞氏病;脈絡(luò)膜新生血管化;糖尿病性葡萄膜炎;組織胞漿菌病;黃斑變性，例如急性黃斑 變性，非滲出性年齡相關(guān)的黃斑變性和滲出性年齡相關(guān)的黃斑變性;水腫，例如黃斑水腫， 囊樣黃斑水腫和糖尿病性黃斑水腫；多灶性脈絡(luò)膜炎;影響后部眼位點(diǎn)或位置的眼外傷;眼 部腫瘤;視網(wǎng)膜疾病，例如視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞，糖尿病視網(wǎng)膜病變(包括增生性糖尿病視 網(wǎng)膜病變），增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)，視網(wǎng)膜動脈阻塞性疾病，視網(wǎng)膜脫離，葡萄膜 炎視網(wǎng)膜疾病讀感性眼炎;伏格特-小柳(VKH)綜合征；葡萄膜擴(kuò)散；由眼激光治療引起的 或影響的后部眼病癥；由光動力治療引起的或影響的后部眼病癥;光凝固，福射性視網(wǎng)膜病 變;視網(wǎng)膜前膜病癥;視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞;前部缺血性視神經(jīng)病變;非視網(wǎng)膜病變糖尿病 視網(wǎng)膜功能障礙;視網(wǎng)膜劈裂;視網(wǎng)膜色素變性;青光眼；烏謝爾綜合征，視錐-視桿營養(yǎng)不 良；斯特格疾病(眼底黃色斑點(diǎn)癥）；遺傳性黃斑變性;脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性;利伯先天性黑朦； 先天性靜止性夜盲;無脈絡(luò)膜；己比二氏綜合征;黃斑毛細(xì)血管擴(kuò)張;利伯遺傳性視神經(jīng)病 變;早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病;和色覺的病癥，包括全色盲，紅色盲，綠色盲，和藍(lán)色盲。
[0231 ]可被治療的肝臟疾病包括，例如，溶酶體膽積病，例如急性間歇性化嘟，鳥氨酸氨 甲酯轉(zhuǎn)移酶缺乏癥，威爾遜氏病，粘多糖?。ɡ鏜PS I型或MPS VI型），斯萊綜合征，龐皮 病，酪氨酸血癥，0(1)抗膜蛋白酶缺乏癥，克里格勒一納賈爾綜合征;A、B或C型肝炎;肝硬 化;肝癌，例如肝細(xì)胞癌;或急性肝功能衰竭。
[0232]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在獸醫(yī)和醫(yī)療應(yīng)用兩者中的用途。合適的受試者包括禽類和哺乳動 物，其中哺乳動物是優(yōu)選的。如本文所用的術(shù)語"禽"包括，但不限于，雞，鴨，碟，鶴譜，火雞 和錐。如本文所用的術(shù)語"哺乳動物"包括，但不限于，人，牛，綿羊，山羊，馬科動物，貓科動 物，犬科動物，兔類動物等。人受試者是最優(yōu)選的。人受試者包括胎兒，新生小鼠，嬰兒，青少 年和成年受試者。
[0233] 組織(例如肝臟、神經(jīng)元或視網(wǎng)膜組織)的轉(zhuǎn)導(dǎo)
[0234] 在一些實(shí)施方案中，本文所公開的rAAV載體表現(xiàn)出組織（例如肝臟，神經(jīng)元和/或 視網(wǎng)膜組織）的增加的轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如相比于包含野生型AAV衣殼蛋白的相應(yīng)AAV載體(來自相同 血清型）。例如，rAAV載體相較于包含相應(yīng)的野生型AAV衣殼蛋白的AAV病毒體的感染性可W 表現(xiàn)出至少10% ,50% ,100% ,500%或1000%增加的感染性。
[0235] 在其它實(shí)施方案中，本文所公開的rAAV載體可W選擇性或特異性感染組織（例如 肝臟，神經(jīng)元或視網(wǎng)膜組織），例如相較于其它類型的細(xì)胞類型，顯示出肝臟、神經(jīng)元或視網(wǎng) 膜細(xì)胞的增加的轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，相較于另一種細(xì)胞類型(如非肝臟，非神經(jīng)元和/或非視網(wǎng)膜細(xì) 胞），rAAV載體可W表現(xiàn)出特定細(xì)胞類型（如肝臟，神經(jīng)元或視網(wǎng)膜細(xì)胞）的至少10% ,50%， 100 % ,500%或1000%增加的感染性。例如，相較于肝臟、腦和/或眼外的細(xì)胞，rAAV載體可 W選擇性地感染肝細(xì)胞、神經(jīng)元和/或感光細(xì)胞。
[0236] 當(dāng)重組AAV載體表現(xiàn)出神經(jīng)元或視網(wǎng)膜組織的增加的轉(zhuǎn)導(dǎo)時，例如當(dāng)使用載體用 于治療神經(jīng)性或眼部病癥時，載體優(yōu)選包含變體AAV2衣殼蛋白。
[0237] 當(dāng)重組AAV載體表現(xiàn)出肝臟組織的增加的轉(zhuǎn)導(dǎo)時，例如當(dāng)使用載體用于治療肝臟 疾病時，載體優(yōu)選包含變體AAV3B、AAV-LK03或AAV 8衣殼蛋白。
[0238] 核酸和宿主細(xì)胞
[0239] 本公開內(nèi)容提供了分離的核酸，其包含編碼如上所述的變體腺相關(guān)病毒(AAV)衣 殼蛋白的核巧酸序列。分離的核酸可W包含在AAV載體，例如重組AAV載體中。
[0240] 包含運(yùn)樣的變體AAV衣殼蛋白編碼序列的重組AAV載體可被用于產(chǎn)生重組AAV病毒 體（即重組AAV載體顆粒）。因此，本公開內(nèi)容提供了重組AAV載體，當(dāng)引入到合適的細(xì)胞中 時，其可W提供重組AAV病毒體的產(chǎn)生。
[0241] 本發(fā)明還提供了宿主細(xì)胞，例如分離的(遺傳修飾)的宿主細(xì)胞，其包含目標(biāo)核酸。 主題宿主細(xì)胞可W是分離的細(xì)胞，例如，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞。主題宿主細(xì)胞可用于產(chǎn)生主題 rAAV病毒體，如下文所描述的。當(dāng)主題宿主細(xì)胞用于產(chǎn)生主題rAAV病毒體時，它被稱為"包 裝細(xì)胞"。在一些實(shí)施方案中，主題宿主細(xì)胞用主題核酸穩(wěn)定地遺傳修飾。在其它實(shí)施方案 中，主題宿主細(xì)胞用主題核酸瞬時遺傳修飾。
[0242] 主題核酸使用已建立的技術(shù)穩(wěn)定或瞬時引入宿主細(xì)胞，包括，但不限于，電穿孔， 憐酸巧沉淀，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，主題核酸通常將還包括選擇標(biāo)記，例如， 幾種公知的選擇標(biāo)記的任一種，例如新霉素抗性等。
[0243] 通過引入主題核酸至任何的各種細(xì)胞產(chǎn)生主題宿主細(xì)胞，所述各種細(xì)胞為例如哺 乳動物細(xì)胞，包括，例如，鼠細(xì)胞，靈長類動物細(xì)胞(例如，人細(xì)胞）。合適的哺乳動物細(xì)胞包 括但不限于，原代細(xì)胞和細(xì)胞系，其中合適的細(xì)胞系包括，但不限于，293細(xì)胞，COS細(xì)胞， 化La細(xì)胞，Vero細(xì)胞，3T3小鼠成纖維細(xì)胞，C3H10T1/2成纖維細(xì)胞，C冊細(xì)胞等。合適的宿主 細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括，例如，HeLa細(xì)胞(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中屯、(ATCC)號CCk 2)，C冊細(xì)胞（例如ATCC號CRL9618，(XL61，CRL9096)，293細(xì)胞（例如ATCC號CRkl573)，Vero 細(xì)胞，NIH 3T3細(xì)胞（例如，ATCC號CRkl658)，Huh-7細(xì)胞，B皿細(xì)胞（例如，ATCC號(XLIO)， PC12 細(xì)胞(ATCC 號 CRL1721)，COS 細(xì)胞，COS-7 細(xì)胞(ATCC 號 CRL1651)，RATI 細(xì)胞，小鼠 L細(xì)胞 (ATCC號(：化1.3)，人胚腎化610細(xì)胞(41〇：號(：化1573)，化胎962細(xì)胞，等。主題宿主細(xì)胞還可 W使用桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞例如Sf9細(xì)胞(其產(chǎn)生AAV)來制備(參見，例如，美國專利號7， 271,002;美國專利申請 12/297,958)。
[0244] 在一些實(shí)施方案中，除了包含編碼如上所述的變體AAV衣殼蛋白的核巧酸序列的 核酸W外，遺傳修飾的主題宿主細(xì)胞還包括包含編碼一種或多種AAV rep蛋白的核巧酸序 列的核酸。在其它實(shí)施方案中，主題宿主細(xì)胞還包含rAAV載體。可使用主題宿主細(xì)胞產(chǎn)生 rAAV病毒體。產(chǎn)生rAAV病毒體的方法描述于，例如，美國專利公開號2005/0053922和美國專 利公開號2009/0202490中。
[0245] 如本文所用，"包裝"是指一系列導(dǎo)致AAV顆粒的組裝和衣殼化的細(xì)胞內(nèi)事件。AAV "rep"和"cap"基因是指編碼腺相關(guān)病毒的復(fù)制和衣殼化蛋白的多核巧酸序列。AAV rep和 cap在本文中稱為AAV"包裝基因"。組裝相關(guān)蛋白（AAP)是cap基因內(nèi)的開放閱讀框的產(chǎn)物， 并且可能還需要進(jìn)行包裝。
[0246] AAV的"輔助病毒"是指允許AAV(例如野生型AAV)進(jìn)行復(fù)制并被哺乳動物細(xì)胞包裝 的AAV。用于AAV的多種運(yùn)樣的輔助病毒在本領(lǐng)域是已知的，包括腺病毒、瘤疹病毒和痘病毒 例如牛痘。腺病毒包括許多不同的亞組，盡管腺病毒亞群C的5型是最常用的。人、非人哺乳 動物和禽來源的大量的腺病毒是已知的并且可得自保藏機(jī)構(gòu)例如ATCC。瘤疹家族的病毒包 括，例如，單純瘤疹病毒化SV)和EB病毒化BV)，W及巨細(xì)胞病毒（CMV)和偽狂犬病病毒 (PRV);其也可得自保藏機(jī)構(gòu)例如ATCC。
[0247] "輔助病毒功能"是指在輔助病毒基因組中編碼的允許AAV復(fù)制和包裝（與本文中 所描述的復(fù)制和包裝的其它要求結(jié)合)的功能。如本文所述，"輔助病毒功能"可多種方 式提供，包括通過提供輔助病毒或提供例如編碼所需的功能的多核巧酸序列至生產(chǎn)者細(xì) 胞。例如，將包含編碼一種或多種腺病毒蛋白的核巧酸序列的質(zhì)?；蚱渌磉_(dá)載體與rAAV 載體一起轉(zhuǎn)染到生產(chǎn)者細(xì)胞中。
[0248] "感染性"病毒或病毒顆粒是包含被適當(dāng)?shù)亟M裝的病毒衣殼且能夠遞送多核巧酸 組分至其中病毒物種是向性的細(xì)胞的病毒或病毒顆粒。該術(shù)語并不一定意味著該病毒的任 何復(fù)制能力。用于計數(shù)感染性病毒顆粒的測定法在本公開內(nèi)容和本領(lǐng)域中其它地方描述。 病毒感染性可W表示為感染性病毒顆粒與總病毒顆粒的比率。測定感染性病毒顆粒與總病 毒顆粒的比率的方法在本領(lǐng)域中是公知的。參見，例如，Grainger等人(2005)Mol.化er. 11: S337(描述了TCID50感染滴度測定）；和ZoloUiWiin等人（1999)Gene Ther.6:973。
[0249] "復(fù)制能力"病毒(例如復(fù)制能力的AAV)是指具有感染性并且還能夠在被感染的細(xì) 胞（即在輔助病毒或輔助病毒功能的存在下)進(jìn)行復(fù)制的表型上野生型的病毒。在AAV的情 況下，復(fù)制能力通常需要功能性AAV包裝基因的存在。在一般情況下，如本文所述的rAAV載 體在哺乳動物細(xì)胞中（特別是在人細(xì)胞中）由于缺少一種或多種AAV包裝基因而是復(fù)制無能 的。通常，運(yùn)樣的rAAV載體缺乏任何AAV包裝基因序列W最小化復(fù)制能力的AAV通過AAV包裝 基因和傳入的rAAV載體之間的重組產(chǎn)生的可能性。在許多實(shí)施方案中，如本文所述的rAAV 載體制劑是含有很少(如果有的話)的復(fù)制能力的AAV(rcAAV，也被稱為RCA)(例如，少于約 l；TcAAV/102rAAV顆粒，少于約IrcAAV/loVAAV顆粒，少于約IrcAAV/loVAAV顆粒，少于約 lrcAAV/10l2rAAV顆粒，或沒有rcAAV)的rAAV載體制劑。
[0250] "分離的"核酸、載體、病毒、病毒顆粒、宿主細(xì)胞或其它物質(zhì)是指不含至少一些其 它組分的物質(zhì)的制劑，所述其它組分在所述物質(zhì)或類似物質(zhì)天然存在或最初從其制備時也 可W存在。因此，例如，分離的物質(zhì)可W通過使用純化技術(shù)W從源混合物富集來制備。富集 可W在絕對基礎(chǔ)上測量，例如每溶液體積的重量，或它可W相對于存在于源混合物中的第 二潛在的干擾物質(zhì)來測量。本公開內(nèi)容的實(shí)施方案的遞增富集是遞增地更加分離的。分離 的核酸、載體、病毒、宿主細(xì)胞或其它物質(zhì)在一些實(shí)施方案中是純化的，例如，約80%至約 90 %純，至少約90 %純，至少約95 %純，至少約98 %純，或至少約99 %純或更純。
[0251] 除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中普通 技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然類似或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和 材料也可W在實(shí)踐或測試本發(fā)明中使用，但現(xiàn)描述優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出 版物通過引用并入本文W公開和描述與引用出版物有關(guān)的方法和/或材料。
[0252] 應(yīng)理解，為清楚起見在單獨(dú)實(shí)施方案的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征也可W 在單個實(shí)施方案中組合提供。相反，為簡明起見在單個實(shí)施方案的上下文中描述的本發(fā)明 各種特征也可W單獨(dú)地或W任何合適的子組合提供。與本發(fā)明有關(guān)的實(shí)施方案的所有組合 具體地涵蓋在本發(fā)明中并且公開在本文中如同每一個組合單獨(dú)地和明確的公開。此外，各 種實(shí)施方案及其元件的所有子組合物也具體地涵蓋在本發(fā)明中并且公開在本文中如同每 一個組合單獨(dú)地和明確的公開。
[0253] 下面的實(shí)施例被提供來舉例說明本發(fā)明的某些實(shí)施方案。它并非旨在W任何方式 限制本發(fā)明。 實(shí)施例
[0巧4] 實(shí)施例1
[02W]在本實(shí)施例中，本發(fā)明人設(shè)計并構(gòu)建命名為ttAAV2(如在真實(shí)型中）的新型AAV2載 體。此外，該新型載體在許多動物模型(大鼠，小鼠和新生小鼠）中測試W評估ttAAV2相較于 組織培養(yǎng)適應(yīng)的（野生型)AAV2是否表現(xiàn)出不同。本發(fā)明人證明了ttAAV2相對于AAV2具有用 于基因遞送的優(yōu)點(diǎn)，并且特別地可用于使用異源序列的腦或眼睛組織的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0巧6] 方法
[0257] 1.克?。簑tAAV2的衣殼基因獲自我們的生產(chǎn)者質(zhì)粒pDG(圖10)。該質(zhì)粒含有 wtAAV化ep和cap基因。衣殼基因的子片段（分別地pDG核巧酸A: 3257-3759，B: 4025-4555，C: 4797-5287和0:5149-5425)被亞克隆到地S中用于后續(xù)突變。四個突變通過定向誘變引入片 段A中從而導(dǎo)致編碼氨基酸(AA)改變V125I、V151A、A162S和T205S的構(gòu)建體。片段B被突變?yōu)?編碼單個AA改變N312S。片段C被突變?yōu)榫幋aAA改變Q457M，S492A，E499DJ533Y，G546D, E548G，R585S，R588T和A593S。在成功誘變的確認(rèn)后，片段A-C被重新克隆到pDG中，產(chǎn)生生產(chǎn) 者質(zhì)粒(pDG-ttAAV2)，其將支持產(chǎn)生由ttAAV2衣殼衣殼化的重組病毒。
[0258] 2. ttAAV2-GFP病毒載體產(chǎn)生的純化和滴定。
[0259] 載體產(chǎn)生按照采用rAAV質(zhì)粒與pDG(其提供Ad輔助功能W及AAV rep和cap基因）的 共轉(zhuǎn)染的標(biāo)準(zhǔn)方案來建立。各種rAAV質(zhì)粒被用來產(chǎn)生重組質(zhì)粒。
[0260] pTR-UFll(CAG-GFP)用作 rAAV 質(zhì)粒。每細(xì)胞工廠（CF10)接種 8xl〇s 個 293 細(xì)胞。14- 18小時后，將細(xì)胞用pDG或pDG-rr AAV2和pr AAV (例如PTR-UF11)使用CaP〇4共沉淀方法轉(zhuǎn)染。 72小時后收獲細(xì)胞，并重懸浮于裂解緩沖液(20mMTris-HCl，p冊，150mM化Cl，0.5%脫氧膽 酸鹽）中。細(xì)胞沉淀通過四個凍融循環(huán)裂解W釋放病毒，其中每個循環(huán)由-80°C30分鐘隨后 37°C30分鐘組成。在最后的解凍后，將裂解物用50U/ml濃度的benzonase處理，并在37°C下 溫育30分鐘。重組病毒使用重力流柱純化。
[0261] 純化。作為第一步驟，將粗裂解物通過在4000g離屯、15分鐘來澄清，并施加至預(yù)成 型的艦克沙醇不連續(xù)梯度。然后收集病毒級分并重新緩沖到乳酸林格氏液中W及使用 Ami con離屯、過濾器進(jìn)行濃縮。
[0262] 接著，病毒制劑的純度通過SDS聚丙締酷胺電泳評估，并使用實(shí)時PCR法滴定。粗提 取物含有4.5xl〇i2個顆粒;收集的病毒組分包含1.5xl〇i2個顆粒。此時，純化方法回收存在 于粗提取物中的病毒的約33%。
[0263] 3. rAAV載體生產(chǎn)和純化(替代方法）
[0264] 在上述第2點(diǎn)的替代實(shí)施方案中，rAAV2載體如下產(chǎn)生。為了產(chǎn)生rAAV2病毒體，每 細(xì)胞工廠（CF10)接種5xl08個293T細(xì)胞。14-18小時后，將細(xì)胞用含GFP的載體PD10-PST2- CMV-GFP和pDG或pDG衣殼突變體(pDG-ttAAV2)雙重轉(zhuǎn)染W(wǎng)分別產(chǎn)生AAV2-CMV-GFP野生型或 真實(shí)型載體。雙重轉(zhuǎn)染使用來自化lysciences的陽I-max在3,5ml陽I/mg DNA的比率實(shí)現(xiàn)。 在37°C溫育72小時后通過W22(K)巧m在4°C下離屯、培養(yǎng)基和細(xì)胞10分鐘來收獲細(xì)胞。移去上 清液并保留用于進(jìn)一步處理，將細(xì)胞沉淀重懸浮于裂解緩沖液(0.15M化Cl，50mM化is- 肥1[抑8.8])中。
[0265] 隨后細(xì)胞沉淀通過四個凍融循環(huán)裂解W釋放病毒，其中每個循環(huán)由-80°C30分鐘 隨后37°C30分鐘組成。在最后的解凍后，將裂解物用150U/ml濃度的benzonase處理，并在37 °C下溫育30分鐘。然后將裂解物在2000rpm離屯、20分鐘W澄清裂解物。使用0.22皿乙酸纖維 素濾器過濾上清，使用A K T Apur ifier色譜系統(tǒng)(GEHealthcare)和AVB瓊脂糖親和柱 (bfr.A: PBS，pH 8; b打B: 0.5M甘氨酸，P肥.7)通過FPLC純化重組AAV2病毒制劑。將收集的 級分針對PBS透析過夜，然后將病毒制備物通過SDS聚丙締酷胺電泳和實(shí)時PCR方法滴定。
[0266] 結(jié)果
[0%7] ttAAV2的體內(nèi)傳導(dǎo)和擴(kuò)散
[026引在體內(nèi)測試ttAAV2載體W評估經(jīng)修飾的病毒在運(yùn)樣的背景下的生物活性。制備 AAV2-CMV-GFP WT和TT病毒的樣品用于注射至許多體內(nèi)模型。為了運(yùn)個目的，我們濃縮病 毒，因為只有有限體積的載體可在體內(nèi)注射。然后我們進(jìn)行了 qPCR和SDS-PAGEW評估濃縮 的載體的新滴度(圖11)。
[0269] 在qPCR和蛋白凝膠分析后，我們獲得了下列的新滴度:1.33x10"病毒基因組/ml的 AAV2-CMV-GFP TT和 1.25x10"病毒基因組/ml 的AAV2-CMV-GFP WT。衣殼滴度如下： 8.89x10"衣殼/ml的AAV2-CMV-GFP TT和7.83xl〇i2衣殼/ml的AAV2-CMV-GFP WT。滴度在基 因組拷貝和衣殼拷貝之間不同，因為SDS-PAGE還顯示了空衣殼，其通常在重組AAV載體產(chǎn)生 期間產(chǎn)生，因此衣殼滴度比從qPCR獲得的病毒基因組滴度高。
[0270] 大鼠腦組織中的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0271] rAAV2TT和WT病毒在野生型大鼠的黑質(zhì)或紋狀體中注射，每個條件注射3只大鼠， 劑量為每次注射2xl09vg或3.5xl〇\g"28天后，解剖腦并制備組織切片用于免疫巧光分析。 主要數(shù)據(jù)顯示于圖12和圖26中。
[0272] rAAV2TT和WT病毒均能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)每個注射部位的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，盡管效率 不同。通過比較，我們觀察到相比于WT載體，1T載體更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)腦組織并且從注射位點(diǎn)擴(kuò) 散得更多。此外，我們觀察到在rAAV2TT的紋狀體注射后，轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元在束旁核(下丘腦的 區(qū)域）中的存在。運(yùn)表明了TT載體能夠從注射部位的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞體通過主動運(yùn)輸沿著神經(jīng)元 突起轉(zhuǎn)移到下丘腦，表明逆向運(yùn)輸?shù)膹?qiáng)能力。運(yùn)種逆向運(yùn)輸能力已在組織培養(yǎng)適應(yīng)的WT rAAV2載體中丟失，因為未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可W在相同的區(qū)域中觀察到(參見圖26)。
[0273] 綜合起來，在大鼠腦中的運(yùn)些結(jié)果表明相比于滴度匹配的wtAAV2，ttAAV2的顯著 增加的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。此外，AAV2TT展現(xiàn)非常好的逆向運(yùn)輸能力的證據(jù)，運(yùn)已在AAV2WT病 毒中丟失。
[0274] 小鼠眼模型中的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0275] 來自用于我們的大鼠腦研究的同一批的ttAAV2和wt-AAV2在W每眼2xl〇\g的劑 量注射入成年小鼠眼中。為了避免動物間差異性，每個小鼠在一只眼睛接受rAAV2TT的注射 且在對側(cè)眼接受rAAV2WT的注射。分析了眼內(nèi)注射的S種不同的途徑:前房內(nèi)，玻璃體內(nèi)和 視網(wǎng)膜下。收獲動物并6周后通過免疫巧光評估GFP表達(dá)。結(jié)果示于圖13中。綜合起來，運(yùn)些 數(shù)據(jù)表明在視網(wǎng)膜下注射后ttAAV2對感光細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的顯著增強(qiáng)(在轉(zhuǎn)導(dǎo)的感光細(xì)胞的水 平和數(shù)量上），如果與wtAAV2(其在成功的RPE65臨床試驗中使用)相比較。
[0276] 新生小鼠模型中的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0277] 概括而言，將ttAAV2和wtAAV2GFP載體注射到新生小鼠中。測試了注射的兩種途 徑，靜脈內(nèi)注射和煩內(nèi)注射。4周后，將動物處死并且從所有小鼠采集所有組織。我們已分析 了腦，其在收獲后通過在巧光顯微鏡上器官的直接巧光來可視化。結(jié)果示于圖14中。煩內(nèi)和 全身注射的結(jié)果在下文更詳細(xì)地討論。
[027引煩內(nèi)注射
[0279] 5xl〇i%g任一載體注射在P1新生小鼠的側(cè)腦室。注射后4周將動物處死并對腦進(jìn)行 解剖、切片和使用抗GFP抗體染色。結(jié)果示于圖27中。
[0280] 如在成年大鼠腦中觀察到的，運(yùn)些數(shù)據(jù)表明，AAV2TT在煩內(nèi)注射后相較于AAV2WT 載體顯示小鼠腦組織的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和更高的擴(kuò)散。當(dāng)在更高倍率下觀察染色切片時，運(yùn)兩 個載體之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的差異被進(jìn)一步突出：1T載體在表達(dá)水平和轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的數(shù)目方面 均表現(xiàn)較好。AAV2TT和WT似乎具有相同的細(xì)胞類型親和力，各自展現(xiàn)神經(jīng)元W及神經(jīng)膠質(zhì) 細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明所觀察到的差異是在效率而不是在細(xì)胞類型特異性上的差異（圖28)。綜 合起來，運(yùn)些數(shù)據(jù)表明，ttAAV2相較于基于wtAAV2的載體在煩內(nèi)注射后顯示小鼠腦組織的 更多增強(qiáng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，當(dāng)使用ttAAV2載體時一些證據(jù)暗示襯擱屯、室的室管膜細(xì)胞層的轉(zhuǎn) 導(dǎo)。運(yùn)種現(xiàn)象對于wtAAV2載體是不可見的。
[0281 ]全身注射
[0282] 在P1新生小鼠中完成2xl〇iivg任一載體的頸靜脈內(nèi)注射。注射后4周將動物處死并 收獲各種器官和通過使用抗GFP抗體的免疫組化評估GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)(腦，肝臟，屯、臟，肌肉，肺，脾 和腎）。腦染色的結(jié)果示于圖29中并且高倍率的照片顯示在圖30中。
[0283] 我們在觀察到在AAV2TT的全身注射后CNS中良好的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。AAV2WT載體相比 之下表現(xiàn)較差，只觀察到少數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元。
[0284] 為了評估AAV2TT載體的總體生物分布，我們評估了在全身注射后不同組織中獲得 的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。將收獲的器官固定、石蠟包埋、切片和針對GFP表達(dá)染色（圖31)。
[0285] 運(yùn)些數(shù)據(jù)表明，AAV-TT載體似乎不具有針對其它器官的強(qiáng)親和力，而是顯示主要 針對神經(jīng)元組織的特異性。此觀察可證實(shí)通過AAV的靜脈內(nèi)注射治療神經(jīng)元遺傳疾病的益 處，因為它確保了通過此注射途徑載體不會轉(zhuǎn)導(dǎo)非祀外周器官而主要地僅轉(zhuǎn)導(dǎo)腦。
[0286] 總之，我們的體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，ttAAV2在眼和腦組織中具有非凡的轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，顯示了 幾乎專一的針對神經(jīng)元組織的特異性。
[0巧7] 實(shí)施例2 [028引其它考慮
[0289 ]不受理論的束縛，相信相較于wtAAV2，ttAAV2中存在的突變包括下列功能組：
[0290] 1)位于AAV2衣殼S倍峰上的肝素結(jié)合殘基（S585和T588);相信，運(yùn)些殘基負(fù)責(zé) wtAAV2衣殼的肝素結(jié)合。在ttAAV2中運(yùn)些被替換并且我們假設(shè)此替換支持病毒在富含硫酸 乙酷肝素蛋白聚糖的腦組織中的擴(kuò)散。
[0291] 2)位于衣殼內(nèi)側(cè)上的ttAAV2中的單氨基酸改變(S312);此內(nèi)部絲氨酸殘基可能在 衣殼-DNA相互作用中起作用，從而潛在地促進(jìn)感染過程中的病毒穩(wěn)定性、基因組包裝或基 因組釋放。
[0292] 3)位于AAV衣殼結(jié)構(gòu)的S倍近端峰之間的溝中的兩個空間上緊密的氨基酸(D546 和G548);運(yùn)些殘基可能參與與中和抗體的相互作用，從而有助于體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。
[0293] 4)位于=倍近端峰之間的溝中的單個孤立的氨基酸改變(S593);
[0294] 5)被認(rèn)為參與受體結(jié)合并且緊密地位于S倍峰上的四個氨基酸(M457，A492，D499 和Y533);
[02巧]6)位于VP1/VP2-級序列中的其余四個氨基酸改變（I125，A151，S162和S205);運(yùn) 些殘基在不是VP3的一部分的衣殼區(qū)域內(nèi)。已知病毒衣殼內(nèi)的VP1/VP2特定區(qū)域含有可能參 與傳入病毒的運(yùn)輸?shù)腜LA2活性。已顯示該區(qū)域中的改變影響病毒感染性。
[0296] AAV2衣殼蛋白中的運(yùn)些突變的S維位置是已知的并在圖15至20中示出。相應(yīng)位置 可W在來自其它血清型的AAV衣殼蛋白中鑒定(見下文）。為了進(jìn)一步表征ttAAV2和負(fù)責(zé)改 善的ttAAV2表型的個體氨基酸改變的作用，ttAAV2衣殼可W被突變W將所選擇的氨基酸 (或氨基酸組，例如基于上文討論的組1至6)逆轉(zhuǎn)為它們在野生型AAV2衣殼中的相應(yīng)序列。 每個突變載體隨后可W使用如上述實(shí)施例中描述的方法來進(jìn)行分析。
[0297] 例如，表達(dá)GFP的各種突變載體可通過煩內(nèi)（1C)注射到CD1新生小鼠中來提交到動 物模型中的第一篩選。在注射的腦中獲得的來自每個突變體載體的GFP信號隨后通過巧光 顯微鏡觀察并與從原始的表達(dá)GFP的wtAAV2和ttAAV2載體獲得的信號相比較。在鑒定新的 表型后（即，當(dāng)突變特定氨基酸組后，ttAAV2-特異性強(qiáng)GFP表達(dá)的消失），注射的腦隨后進(jìn)一 步切片并通過免疫組織化學(xué)進(jìn)行分析。
[0298] 同時，將運(yùn)些選擇的突變載體通過成年大鼠煩內(nèi)注射提交到第二篩選。此外，相關(guān) 的突變組合通過靜脈內(nèi)（IV)注射到新生小鼠 W評估載體的生物分布來進(jìn)行分析。選擇的器 官（屯、臟，肺，肝臟，脾，腎，肌肉）隨后進(jìn)行處理用于免疫組織化學(xué)和GFP表達(dá)的評估。
[0299] 各TT特異性殘基對載體的效率和生物分布的貢獻(xiàn)的分析
[0300] 為了進(jìn)一步表征AAV2TT和查明負(fù)責(zé)改善的TT表型的氨基酸改變，將AAV2TT衣殼逐 步突變W將所選擇的氨基酸逆轉(zhuǎn)為它們在野生型AAV2衣殼中的相應(yīng)序列。運(yùn)種策略使我們 能夠更具體地辨別14個氨基酸突變中的每一個針對AAV2TT的表型的貢獻(xiàn)，并限定最小真實(shí) 型載體，其僅包含必要的突變。
[0301] 如上所討論的，我們將14個TT特異性殘基根據(jù)它們在AAV衣殼上的位置和它們對 轉(zhuǎn)導(dǎo)特征的相關(guān)潛在貢獻(xiàn)進(jìn)行分組。各種AAV-TT突變體通過在新生小鼠腦或在成年大鼠腦 中煩內(nèi)注射進(jìn)行篩選W觀察是否一些TT特異性殘基至野生型等效物的逆轉(zhuǎn)與表型的丟失 相關(guān)聯(lián)，由此鑒定14個TT殘基中重要的氨基酸改變。
[0302] 肝素結(jié)合位點(diǎn)化BS)
[0303] 已顯示殘基585和588負(fù)責(zé)AAV2WT衣殼的肝素結(jié)合。在AAV-TT中運(yùn)些被替換并且我 們假定該替換支持病毒在富含硫酸乙酷肝素蛋白聚糖的腦組織中的擴(kuò)散。運(yùn)兩個殘基都位 于AAV2衣殼結(jié)構(gòu)的=倍近端峰上(參見圖16)。
[0304] 我們通過工程改造 WT衣殼上的改變R585S和R588T消除了 AAV2WT肝素結(jié)合能力 (AAV2-HBnull)，即將殘基突變?yōu)檎鎸?shí)型等效物。進(jìn)行此第一分析W確定AAV-TT不僅僅是沒 有肝素結(jié)合位點(diǎn)的能更多地擴(kuò)散的AAV2,而是一些其它12個氨基酸改變也在改善AAV-TT轉(zhuǎn) 導(dǎo)特征中起作用。
[0305] 成年大鼠中的煩內(nèi)注射
[0306] 將滴度匹配的AAV2-TT、AAV2-WT和AAV2-HBnull載體W每次注射3.5xl〇\g的劑量 注射在野生型大鼠的黑質(zhì)或紋狀體中。28天后解剖腦并制備組織切片用于GFP表達(dá)的免疫 巧光分析(圖32)。
[0307] 我們在AAV-TT病毒的紋狀體注射后在丘腦和黑質(zhì)中觀察到強(qiáng)GFP表達(dá)，表明載體 的強(qiáng)逆向運(yùn)輸能力。相比之下，AAV2-HBnull和AAV2WT顯示比AAV-TT少得多（如果有的話）的 逆向運(yùn)輸，因為極少數(shù)細(xì)胞體在紋狀體注射后在運(yùn)些區(qū)域中轉(zhuǎn)導(dǎo)。此觀察表明，AAV2- 皿null與AAV-TT不同并且AAV2衣殼上肝素結(jié)合能力的不存在有助于腦中真實(shí)型載體的良 好擴(kuò)散。然而，運(yùn)不足W解釋其改善的轉(zhuǎn)導(dǎo)特征。
[0308] 殘基 S312、D546-G548 和 S593
[0309] S312殘基是位于AAV2衣殼的內(nèi)側(cè)上的唯一 TT特異性改變。我們的假設(shè)是該內(nèi)部殘 基可能在衣殼-DNA相互作用中起作用，從而潛在地促進(jìn)感染過程中的病毒穩(wěn)定性、基因組 包裝和基因組釋放。
[0310] 分別在位置546和548上的D和G殘基位于近端3倍峰之間的溝中。
[0311] 單個孤立的絲氨酸S593位于=倍近端峰之間的溝中。
[0312] 運(yùn)些TT特異性殘基在AAV2衣殼的=維結(jié)構(gòu)上的位置在圖17至19中顯示。考慮到它 們在結(jié)構(gòu)中不太突出的位置，我們假設(shè)，運(yùn)些殘基可能不促成ttAAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)表型。
[0313] 新生小鼠煩內(nèi)注射
[0314] 突變S312N在AAV2-TT衣殼上工程改造W創(chuàng)建TT-S312N突變體。突變D546G和G548E 在AAV2-1T衣殼上工程改造W產(chǎn)生AAV-TT-DG突變體。突變S593A在AAV2-TT衣殼上工程改造 W創(chuàng)建AAV-TT-S593A突變體。
[031日]通過將運(yùn)些選擇的TT氨基酸逆轉(zhuǎn)為它巧野生型AAV2衣殼中的相應(yīng)序列，我們旨 在確定運(yùn)些殘基對改善的AAV-TT表型的貢獻(xiàn)。
[0316]將5xl〇i%g的各突變載體注射在P1新生小鼠的側(cè)腦室。注射后4周將動物處死并對 腦進(jìn)行解剖、切片和使用抗GFP抗體染色。結(jié)果示于圖33中。
[0317] 有趣的是，運(yùn)些數(shù)據(jù)表明，AAV TT-S312N相較于完全AAV2TT載體顯示小鼠腦組織 的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。另一方面，氨基酸改變S593A或D546E/G548D似乎沒有影響TT表型，因為類似 的傳導(dǎo)特征可W在整個大腦中觀察到。當(dāng)在較高放大倍率下觀察染色切片時，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的 差異進(jìn)一步突出（圖34)。
[0318] 從高倍率照片，我們可W觀察到，AAV TT-S312似乎W比原始的具有14個氨基酸改 變的AAV-TT更高的效率轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元組織。特別地，我們可W看到在TT-S312N載體注射后在 腦的吻側(cè)(皮層，紋狀體，海馬）中更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，無論是在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的水平還是數(shù)目 上。盡管由于與祀向注射部位相關(guān)的困難造成在注射的新生小鼠腦中的高變異性，運(yùn)個觀 察在分析的所有動物中被證實(shí)。在另一方面，逆轉(zhuǎn)S593A或D546E/G548D似乎對TT載體傳導(dǎo) 表型沒有太大的影響。
[0319] 實(shí)施例3
[0320] AAV2真實(shí)型衣殼上祀向的氨基酸突變，選自用實(shí)施例2中的突變體組合獲得的結(jié) 果
[0321] 根據(jù)來自完全AAV TT衣殼上的氨基酸組突變的結(jié)果，我們可W確定突變S312N似 乎對于TT表型是有利的，進(jìn)一步提高了它在腦中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。此外，我們觀察到逆轉(zhuǎn)S593A 和D546G/G548E似乎不影響AAV-TT的神經(jīng)元表型。因此，我們假設(shè)，TT特異性殘基S593、D546 和G548可W從真實(shí)型衣殼序列排除，在運(yùn)些位置上留下AAV2WT殘基W獲得僅具有10個氨基 酸改變的最終TT載體。
[0322] 為了驗證運(yùn)些假設(shè)，我們工程改造了 TT-S312N-D546G-G548D-S593A載體并通過新 生小鼠腦注射測試了它的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。因為最后的新生小鼠煩內(nèi)注射似乎導(dǎo)致檢測到GFP表 達(dá)的飽和信號，我們決定還與運(yùn)個"最終前"TT一起注射TT和TT-S312N載體，使用比W前使 用的低10倍的劑量。通過使用運(yùn)個較低劑量我們旨在避免在轉(zhuǎn)導(dǎo)的腦中達(dá)到GFP染色的飽 和水平，并避免在不同的突變體之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比較的困難。
[0323] 將5xl〇Wyg的各突變載體注射在P1新生小鼠的側(cè)腦室。注射后4周將動物處死并對 腦進(jìn)行解剖、切片和使用抗GFP抗體染色。結(jié)果示于圖35中。
[0324] 如先前觀察到的，運(yùn)些數(shù)據(jù)表明，AAV TT-S312N相較于完全AAV2TT載體顯示小鼠 腦組織的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。另一方面，最小TT-S312N-D546G/G548E-S593A載體似乎沒有達(dá)到運(yùn) 些更高水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)，盡管它也包含內(nèi)部S312N突變。運(yùn)表明，一個或多個氨基酸改變在TT表 型中起著一些作用。通過將運(yùn)些殘基逆轉(zhuǎn)回AAV2WT等效物，我們失去了一些增加的傳導(dǎo)能 力。當(dāng)在更高倍率觀察染色切片時，運(yùn)些觀察結(jié)果得到證實(shí)（圖36)。
[0325] 我們決定通過對全腦蛋白提取物的酶聯(lián)免疫吸附試驗巧LISA)定量注射的腦中獲 得的總GFP表達(dá)來進(jìn)一步研究由運(yùn)些載體的每一個獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。簡言之，在注射 SxlO^vg載體4周后，將動物處死，收獲整個腦并裂解，提取總腦蛋白。通過使用GFP蛋白質(zhì)標(biāo) 準(zhǔn)，我們隨后可W定量每一個注射腦中表達(dá)的GFP蛋白的量(圖37)。
[0326] 我們可W確認(rèn)，TT-S312N內(nèi)部突變體W比完全TT載體更高的效率轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠腦，因 為它在所有注射的腦中導(dǎo)致更多的GFP表達(dá)。另一方面，最小TT載體TT-S312N-D546G/ G548E-S593A似乎導(dǎo)致較低水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)：盡管每腦中表達(dá)的GFP的平均量在此圖中似乎更 高，但運(yùn)是由于在一個腦中測量的極端的GFP值，如通過此條件的高誤差棒所示的。使用此 最小TT載體，動物之間的變異性非常高的，只有五個中的一個動物比用TT-S312N轉(zhuǎn)導(dǎo)的動 物表現(xiàn)更好。運(yùn)種高變異性促使我們謹(jǐn)慎考慮此臨時最小TT載體，特別是因為免疫組化分 析也顯示，TT-S312N變體比TT-S312N-DG-S593A表現(xiàn)更好。
[0327]因此，我們選擇了TT-S312N變體作為我們最優(yōu)選的AAV TT載體，它相較于野生型 AAV2 包含下列 13 個氨基酸突變:V125I，V151A，A162S，T205S，Q457M，S492A，E499D，F(xiàn)533Y, G54 抓，E548G，R585S，R588T 和 A593S。
[0扣引盡管上述研究表明了TT-S312N作為最優(yōu)選的AAV-TT載體，但運(yùn)些研究示出了許多 TT特異性殘基的個體功能和貢獻(xiàn)。特別地，緊密位于衣殼的=倍峰上的四個氨基酸很可能 參與受體結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，運(yùn)些殘基在AAV-TT中逆轉(zhuǎn)回AAV2WT相應(yīng)殘基。例如，突 變M457Q、A492S、D49犯和Y533F可W在AAV-TT衣殼上工程化并如前所述分析此突變載體W 顯示運(yùn)些殘基的作用。在其它實(shí)施方案中，位于VP1/VP2-級序列上的四個氨基酸有可能牽 設(shè)病毒的運(yùn)輸，并且可W在AAV-TT中逆轉(zhuǎn)回AAV2WT相應(yīng)殘基（I125V，A151V，S162A，S205T) 并類似地進(jìn)行分析。
[0；329] 實(shí)施例4
[0330] 其它血清型中變體AAV載體的構(gòu)建
[0331] 還可W測定在其它非AAV2血清型的背景下ttAAV2特異性氨基酸改變的功能。
[0332] 主要腺相關(guān)病毒(AAV)(即44￥1，5,6,8,9和'1110)的衣殼氨基酸序列可與來自 ttAAV2的氨基酸序列比對(例如如圖9中所示的）。運(yùn)使得能夠鑒定哪個ttAAV2特異性氨基 酸已存在于其它血清型中的相同位置上。然后將各種血清型中的相關(guān)殘基突變?yōu)閣tAAV2中 的相應(yīng)殘基。運(yùn)些改變證明了 ttAAV2特異性殘基對于每種血清型的效率和生物分布的重要 性。
[0333] 如上所討論的，表達(dá)GFP的各種突變載體可通過煩內(nèi)（1C)注射到CD1新生小鼠中來 提交到第一篩選。在注射的腦中獲得的GFP信號隨后與從合適的表達(dá)GFP的血清型對照獲得 的信號相比較。在將鑒定的氨基酸突變成其相應(yīng)的AAV2殘基時GFP表達(dá)的減少或增加證實(shí) 在運(yùn)些特定的位置上運(yùn)些特定殘基的重要性。在適用時，隨后將注射的腦進(jìn)一步切片并通 過免疫組織化學(xué)進(jìn)行分析。此外，所選擇的突變血清型通過靜脈內(nèi)（IV)注射到新生小鼠中 進(jìn)行分析W評估載體的生物分布并將其與原始的未突變的對應(yīng)物進(jìn)行比較。
[0334] 在其它實(shí)施方案中，在ttAAV2中鑒定的相關(guān)氨基酸被插入作為在相關(guān)位置上引入 其它主要血清型的關(guān)鍵突變。ttAAV2特異性殘基在其它AAV亞型中的插入使我們能夠改善 各血清型的轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物分布特征。
[0；33引實(shí)施例5
[0336] 在其它AAV血清型中保守的ttAAV2特異性殘基至相應(yīng)的AAV2殘基的修飾。
[0337] 現(xiàn)有的腺相關(guān)血清型的衣殼氨基酸序列與ttAAV2的衣殼氨基酸序列的比較分析 首先使我們能夠鑒定在其它血清型中保守的ttAAV2特異性殘基(見圖9)。運(yùn)些殘基由S162， S205，S312，G548，S585和T588組成。每個非AAV2血清型在其序列的相應(yīng)氨基酸位置上包含 一個運(yùn)些殘基或幾個運(yùn)些殘基的組合。
[0338] 在具體的實(shí)施方案中，各種血清型中運(yùn)些殘基的每一個被轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的野生型 AAV2氨基酸并測試運(yùn)些新突變體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
[0339] 1)AAV1血清型的修飾
[0340] AAVl 包含相應(yīng)于 ttAAV2 中的殘基 S205、G548、S585 和 T588 的殘基 S205、G549、S586 和T589。當(dāng)來自AAV1的VP1單體與來自AAV2的VP1進(jìn)行S維對齊時，我們可W驗證wtAAV2中 相應(yīng)的殘基（即T205、E548、R585和R588)處于3D結(jié)構(gòu)上完美匹配的位置（圖21)。因此，我們 的結(jié)論是，重要的是將AAV1中的每個ttAAV2特異性殘基轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的野生型AAV2對應(yīng)物而 不影響蛋白質(zhì)的=維結(jié)構(gòu)。在具體的實(shí)施方案中，在AAV1衣殼序列中進(jìn)行下列突變:S205T， G54 犯，SSSSRJSSgR。
[0%1] 2)AAV5血清型的修飾
[0；342] AAV5 包含相應(yīng)于 ttAAV2 中的殘基 G548、S585 和巧88 的殘基 G537、S575 和 T578dAAV2 中的R585和R588殘基處于3D結(jié)構(gòu)上與AAV5中的S575和巧78完美匹配的位置。雖然根據(jù)=維 結(jié)構(gòu)AAV2中的E548并沒有與AAV5中的殘基G537完美匹配（圖22)，我們還是決定將其納入研 究，因為兩個殘基是空間上相對緊密的。因此在具體的實(shí)施方案中，在AAV5衣殼序列中進(jìn)行 下列突變:G537E，S575R，T578R。
[0343] 3)AAV6血清型的修飾
[0344] AAV6 包含相應(yīng)于 ttAAV2 中的殘基 S205、G548、S585 和 T588 的殘基 S205、G549、S586 和I'SSgsWtAAVS中相應(yīng)的殘基（即T205、E548、R585和R588)(圖23)處于VP1 3D結(jié)構(gòu)上完美匹 配的位置。因此，在具體的實(shí)施方案中，在AAV6衣殼序列中進(jìn)行下列突變：S205T，G549E， ssseRjssgR。
[0345] 4)AAV8血清型的修飾
[0346] AAV8包含相應(yīng)于ttAAV2中的殘基S312和巧88的殘基S315和I'SgUwtAAVS中相應(yīng)的 殘基（即N312和R588)處于VP1 3D結(jié)構(gòu)上完美匹配的位置（圖24)。因此，在具體的實(shí)施方案 中，在AAV8衣殼序列中進(jìn)行下列突變:S315N，T591R。
[0347] 在一個實(shí)施方案中，通過在TT AAV2中的S312N突變賦予改善的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可W通過 應(yīng)用氨基酸改變S315N來轉(zhuǎn)移至AAV8血清型。
[0%引我們通過定點(diǎn)誘變突變AAV8衣殼序列，并由此產(chǎn)生AAV8-S315N載體質(zhì)粒。該質(zhì)粒 用于產(chǎn)生通過293T細(xì)胞的雙轉(zhuǎn)染表達(dá)含有ITR的CMV-GFP轉(zhuǎn)基因的重組AAV8-S315N載體。該 載體隨后從細(xì)胞裂解物并從收獲的培養(yǎng)上清液通過FPLC親和層析使用AVB瓊脂糖樹脂純 化。衣殼滴度和載體基因組滴度通過SDS-PAGE和qPCR分別評估。
[0349] 表達(dá)GFP的突變AAV8-S315N載體通過CD 1新生小鼠中的全身注射篩選。滴度匹配的 AAV8載體用作對照。在2xl〇iivg的頸靜脈內(nèi)注射后在各器官中獲得的GFP表達(dá)隨后進(jìn)行分 析，主要集中在其中AAV8先前已顯示出一些強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的肝臟。
[0巧日]5)AAV9血清型的修飾
[O%1] AAV9 包含相應(yīng)于 ttAAV2 中的殘基 S162、S205、G548 和 S585 的殘基 S162、S205、G549 和S586dAAV2中相應(yīng)的殘基（即A162、T205、E548和R585)處于VP1 3D結(jié)構(gòu)上完美匹配的位置 (圖25)。因此，在具體的實(shí)施方案中，在AAV9衣殼序列中進(jìn)行下列突變:S162A，S205T，G549E 和S586R。
[0巧2] 6)AAVrhlO血清型的修飾
[0353] AAVrhlO包含相應(yīng)于ttAAV2中的殘基G548的殘基G551。考慮到該殘基和位置在各 種血清型中所表現(xiàn)的保守程度，我們假定AAVrhlO中的G551將與wtAAV2中的E548在S維上 對齊。因此，在一個實(shí)施方案中，在AAVrhlO衣殼序列中進(jìn)行下列突變:G55化。
[0354] 7)AAV3B和AAV-LK03血清型的修飾
[0355] 類似于AAV8血清型，在將衣殼蛋白VP1序列與AAV-TT的序列比對后，我們觀察到 AAV3B血清型也在位置312上包含內(nèi)部絲氨酸(見圖38中的AAV3B衣殼序列）。
[0356] 新描述的LK03AAV載體(包含由M. A. Kay通過DNA改組工程改造的五個不同親本的 AAV衣殼的嵌合衣殼）也在衣殼的內(nèi)側(cè)包含殘基S312(見Lisowski等人，Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model, NaUire 506,382-386(2014))eAAV-LK03的衣殼序列公開于W02013/029030中并顯示于圖39 中。
[0357] 因此，在其它實(shí)施方案中，AAV3B和AAV-LK03載體通過在兩個載體中施加氨基酸改 變S312N來進(jìn)行突變。運(yùn)些新突變體及其相應(yīng)的AAV對照血清型也通過在新生小鼠中的頸靜 脈內(nèi)注射進(jìn)行測試。然后分析在各收獲器官中獲得的GFP表達(dá)。
[。巧引 實(shí)施例6
[0359] 在AAV血清型之間可轉(zhuǎn)移的ttAAV2特異性氨基酸的鑒定
[0360] 在其它實(shí)施方案中，在ttAAV2表征過程中鑒定的關(guān)鍵氨基酸在相關(guān)位置上插入到 其它主要血清型中。然后使用合適的非突變血清型作為對照測試新工程改造的載體。運(yùn)獨(dú) 立于血清型而驗證了 AAV衣殼的特定位置上個體氨基酸的重要性。
[0361] 1)殘基 S585，T588，S312，D546，G548 和 S593
[0362] AAVl、AAV5和AAV6在其衣殼蛋白序列中在相應(yīng)于ttAAV2中的G548、S585和巧88的 位置上天然含有相同的氨基酸殘基。因此，在其它實(shí)施方案中，運(yùn)些血清型的衣殼蛋白在匹 配的位置上進(jìn)行突變W包含存在于ttAAV2中的其它殘基S312、D546和S593。類似地，已在相 應(yīng)于ttAAV2中的S312和T588的位置上包含與ttAAV2相同的氨基酸殘基的AAV8被進(jìn)一步突 變W含有相應(yīng)于ttAAV2中的S585、D546、G548和S593的殘基。已包含與ttAAV2中的G548和 S585相應(yīng)的殘基的AAV9被突變W包含相應(yīng)于ttAAV2中的巧88、S312、D546和S593的殘基。最 后，已包含相應(yīng)于G548的殘基的AAV10被進(jìn)一步修飾W還含有相應(yīng)于S585、T588、S312、G548 和S593的殘基。
[0363] 2)殘基 1125,4151，5162,5205，]?457,4492,0499和￥533
[0364] AAV1和AAV6已天然含有殘基S205。因此，在其它實(shí)施方案中，運(yùn)些血清型在相應(yīng)于 ttAAV2中的殘基1125、4151、5162、]?457、4492、0499和￥533的位置上進(jìn)行突變。類似地，已包 含殘基S162和S205的AAV9被進(jìn)一步突變W包含相應(yīng)于ttAAV2中的I125、A151、M457、A492、 D499和Y533的殘基。最后，AAV5、8和10被修飾W顯示相應(yīng)于ttAAV2中的I125、A151、S162、 S205、M457、A492、D499 和 Y533殘基。
[0365] 存在于ttAAV2中的突變和存在于其它AAV血清型的野生型衣殼蛋白VP1序列中的 相應(yīng)殘基的位置示于下表1中。在一般情況下，變體非AAV2載體可通過突變表1中對于運(yùn)些 血清型所示的任何殘基來構(gòu)建。W斜體示出的殘基是已在相應(yīng)位置上存在于ttAAV2中的殘 基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，非AAV2血清型在W非斜體字示出的一個或多個殘基上進(jìn)行突變。 W此方式，通過ttAAV2顯示的有利性質(zhì)可W被轉(zhuǎn)移到替代AAV血清型中。
[0366] 表 1 「n9A7l
LUJOOJ 傘及明的共K頭她為柔
[0369] 本發(fā)明還設(shè)及另外的方面，如在下面的總結(jié)性段落中定義：
[0370] 1.-種重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含：
[0371] (a)變體AAV衣殼蛋白，其中所述變體AAV衣殼蛋白相對于野生型AAV衣殼蛋白包含 至少1個氨基酸取代;其中，所述至少1個氨基酸取代存在于AAV2衣殼蛋白序列的一個或多 個下列位置上：125，151，162，205，312，457，492，499，533，546，548，585，588 和/或 593;和
[0372] (b)異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0373] 2.根據(jù)段落1的重組AAV載體，其中（i)所述載體包含變體AAV2衣殼蛋白；（i i)所述 變體AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:2的序列，或與其具有至少95%的序列同一性的序列； (iii)野生型AAV衣殼蛋白來自AAV2;和/或（iv)野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:1的序 列。
[0374] 3.根據(jù)段落2的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列殘 基：1125,4151，5162,5205,5312，]?457,4492,0499，￥533,0546,6548,5585^588和/或5593。
[0375] 4.根據(jù)段落2或段落3的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型 AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代:V125I，V151A，A162S，T205S，N312S，Q457M, S492A，E499D，F(xiàn)533Y，G54抓，E548G，R585S，R588T和/或A593S。
[0376] 5.根據(jù)段落語3的任一項的重組AAV載體，其中變體AAV衣殼蛋白來自AAV1，AAV5， AAV6，AAV8，AAV喊AAV10。
[0377] 6.根據(jù)段落5的重組AAV載體，其中（i)所述載體包含變體AAV1衣殼蛋白；（ii)所述 變體AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:3具有至少95%的序列同一性的序列；（iii)野生型AAV 衣殼蛋白來自AAV1;和/或（iv)野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:3的序列；
[0378] 并且其中至少1個氨基酸取代存在于AAV1衣殼蛋白序列的一個或多個下列位置 上：125，151，162，205，313，458，493，500，5：34，547，549，586，589 和/或 594。
[0379] 7.根據(jù)段落6的重組AAV載體，其中所述變體AAV1衣殼蛋白相對于野生型AAV1衣殼 蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代：
[0380] (a)V125I，Q151A，T162S，N313S，N458M，K493A，N500D，F(xiàn)534Y，S547D和/或G594S; 和/或
[0381] (b)S205T，G54犯，S586R和/或 I'SSgR。
[0382] 8.根據(jù)段落5的重組AAV載體，其中（i)所述載體包含變體AAV5衣殼蛋白；（ii)所述 變體AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:4具有至少95%的序列同一性的序列；（iii)野生型AAV 衣殼蛋白來自AAV5;和/或（iv)野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:4的序列；
[0383] 并且其中至少1個氨基酸取代存在于AAV5衣殼蛋白序列的一個或多個下列位置 上：124，150，153，195，303，444，479，486，520，533，537，575，578和/或583。
[0384] 9.根據(jù)段落8的重組AAV載體，其中所述變體AAV5衣殼蛋白相對于野生型AAV5衣殼 蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代：
[0385] (曰八1241，1(1504，1(1535,41955，1?035^444]\1，54794，￥48抓，1520￥，口5330和/或 G583S;和/或
[03 化](b)G537E，S575R和/或 I'STSR。
[0387] 10.根據(jù)段落5的重組AAV載體，其中（i)所述載體包含變體AAV6衣殼蛋白；（ii)所 述變體AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:5具有至少95%的序列同一性的序列；（iii)野生型 AAV衣殼蛋白來自AAV6;和/或（iv)野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:5的序列；
[0388] 并且其中至少1個氨基酸取代存在于AAV6衣殼蛋白序列的一個或多個下列位置 上：125，151，162，205，313，458，493，500，5：34，547，549，586，589 和/或 594。
[0389] 11.根據(jù)段落10的重組AAV載體，其中所述變體AAV6衣殼蛋白相對于野生型AAV6衣 殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代：
[0390] (a)V125I，Q151A，T162S，N313S，N458M，K493A，N500D，F(xiàn)534Y，S547D和/或G594S; 和/或
[0391] (b)S205T，G54犯，S586R和/或 I'SSgR。
[0392] 12.根據(jù)段落5的重組AAV載體，其中（i)所述載體包含變體AAV8衣殼蛋白；（ii)所 述變體AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:6具有至少95%的序列同一性的序列；（iii)野生型 AAV衣殼蛋白來自AAV8;和/或（iv)野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:6的序列；
[0393] 并且其中至少1個氨基酸取代存在于AAV8衣殼蛋白序列的一個或多個下列位置 上：125，151，163，206，315，460，495，502，536，549，551，588，591 和/或 596。
[0394] 13.根據(jù)段落12的重組AAV載體，其中所述變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣 殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代：
[03 巧](a)V125I，Q151A，K163S，A206S，T460M，T495A，N502D，F(xiàn)536Y，N549D，A551G，Q588S 和/或G596S;和/或
[0396] (b)S315N和 / 或 I'SgiR。
[0397] 14.根據(jù)段落5的重組AAV載體，其中（i)所述載體包含變體AAV9衣殼蛋白；（ii)所 述變體AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:7具有至少95%的序列同一性的序列；（iii)野生型 AAV衣殼蛋白來自AAV9;和/或（iv)野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:7的序列；
[0398] 并且其中至少1個氨基酸取代存在于AAV9衣殼蛋白序列的一個或多個下列位置 上：125，151，162，205，314，458，493，500，5：34，547，549，586，589 和/或 594。
[0399] 15.根據(jù)段落14的重組AAV載體，其中所述變體AAV9衣殼蛋白相對于野生型AAV9衣 殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代：
[0400] (a 化 125I，Q151A，N314S，Q458M，V493A，E500D，F(xiàn)534Y，G547D，A589T和/或G594S; 和/或
[0401 ] (b)S162A，S205T，G54 犯和 / 或 S586R。
[0402] 16.根據(jù)段落5的重組AAV載體，其中（i)所述載體包含變體AA化hlO衣殼蛋白；（ii) 所述變體AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID N0:8具有至少95%的序列同一性的序列；（iii)野生 型AAV衣殼蛋白來自AAVrhlO;和/或（iv)野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:8的序列；
[0403] 并且其中至少1個氨基酸取代存在于AAV10衣殼蛋白序列的一個或多個下列位置 上：125，151，163，206，315，460，495，502，536，549，551，588，591 和/或 596。
[0404] 17.根據(jù)段落16的重組AAV載體，其中所述變體AAVrhlO衣殼蛋白相對于野生型 AAVrhlO衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代：
[0405] (a)V125I,Q151A,K163S,A206S,N315S,T460M,L495A,N502D,F536Y,G549D,Q588S, A591T 和/或G596S;和/或
[0406] (b)G551E。
[0407] 18.根據(jù)任何前述段落的重組AAV載體，其中所述重組AAV載體相較于包含相應(yīng)的 野生型AAV衣殼蛋白的AAV載體表現(xiàn)出神經(jīng)元或視網(wǎng)膜組織的增加的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0408] 19.根據(jù)任何前述段落的重組AAV載體，其中所述基因產(chǎn)物包括干擾RNA或適體。
[0409] 20.根據(jù)段落1至18的任一項的重組AAV載體，其中所述基因產(chǎn)物包括多膚。
[0410] 21.根據(jù)段落20的重組AAV載體，其中所述基因產(chǎn)物包括神經(jīng)保護(hù)多膚，抗血管生 成多膚，或增強(qiáng)神經(jīng)元或視網(wǎng)膜細(xì)胞的功能的多膚。
[0411] 22.根據(jù)段落21的重組AAV載體，其中所述基因產(chǎn)物包括膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子， 成纖維細(xì)胞生長因子，神經(jīng)生長因子，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，視紫紅質(zhì)，retinoschisin， RPE65或外周蛋白。
[0412] 23. -種藥物組合物，其包含：
[0413] (a)根據(jù)任何前述段落的重組AAV載體;和
[0414] (b)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0415] 24. -種用于將基因產(chǎn)物遞送至受試者的神經(jīng)元或視網(wǎng)膜組織的方法，所述方法 包括向受試者施用根據(jù)任何前述段落的重組AAV載體或藥物組合物。
[0416] 25.-種用于治療受試者的神經(jīng)或眼部病癥的方法，所述方法包括向受試者施用 根據(jù)任何前述段落的重組AAV載體或藥物組合物。
[0417] 26.根據(jù)段落1至23的任一項的重組AAV載體或藥物組合物，其用于治療神經(jīng)或眼 部病癥。
[0418] 27.根據(jù)段落24至26的任一項使用的方法、重組AAV載體或藥物組合物，其中所述 神經(jīng)病癥是神經(jīng)變性疾病。
[0419] 28.根據(jù)段落24至26的任一項使用的方法、重組AAV載體或藥物組合物，其中所述 眼部病癥是青光眼，色素性視網(wǎng)膜炎，黃斑變性，視網(wǎng)膜劈裂或糖尿病性視網(wǎng)膜病。
[0420] 29. -種分離的變體AAV衣殼蛋白，其中所述變體AAV衣殼蛋白相對于野生型AAV衣 殼蛋白包含至少一個氨基酸取代;其中所述至少一個氨基酸取代存在于AAV2衣殼蛋白序列 的一個或多個下列位置上：125，151，162，205，312，457,492,499，533，546，548，585，588和 / 或593;或者存在于替代的AAV衣殼蛋白序列的一個或多個相應(yīng)的位置上。
[0421] 30. -種分離的核酸，其包含編碼如段落29定義的變體AAV衣殼蛋白的核巧酸序 列。
[0422] 31.-種分離的宿主細(xì)胞，其包含如段落30中定義的核酸。
【主權(quán)項】
1. 一種重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含： (a) 變體AAV2衣殼蛋白，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型AAV2衣殼蛋白包含 至少4個氨基酸取代;其中，所述至少4個氨基酸取代存在于AAV2衣殼蛋白序列的下列位置 上：457,492,499和533;和 (b) 異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的重組AAV載體，其中（i)所述變體AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:2的 序列，或與其具有至少95%的序列同一性的序列；和/或（ii)野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1的序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白包含一個 或多個下列殘基:M457，A492，D499和Y533。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于野 生型AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代:Q457M，S492A，E499D和F533Y。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于野 生型AAV衣殼蛋白還在AAV2衣殼蛋白序列的下列位置上包含一個或多個氨基酸取代：125， 151，162和205。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列殘 基：I125，A151，S162和S205。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于野 生型AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代:￥1251，￥15^41623和了2053。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于野 生型AAV衣殼蛋白還在AAV2衣殼蛋白序列的下列位置上包含一個或多個氨基酸取代:585和 588 〇9. 根據(jù)權(quán)利要求8的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列殘 基：S585 和 T588。10. 權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于野生型 AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代:R585S和R588T。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10的任一項的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于 野生型AAV衣殼蛋白還在AAV2衣殼蛋白序列的下列位置上包含一個或多個氨基酸取代： 546,548和593。12. 根據(jù)權(quán)利要求11的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列 殘基:D546，G548,和 S593。13. 根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白相對于 野生型AAV2衣殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代:G546D，E548G和A593S。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13的任一項的重組AAV載體，其中所述變體AAV2衣殼蛋白包含殘 基N312。15. -種重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含： (a) 變體AAV8衣殼蛋白，其中所述變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣殼蛋白在 AAV8衣殼蛋白序列的位置315上包含氨基酸取代;和 (b) 異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核苷酸序列。16. 根據(jù)權(quán)利要求15的重組AAV載體，其中（i)所述變體AAV衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 6具有至少95%的序列同一性的序列；和/或（ii)野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID N0:6的序 列。17. 根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的重組AAV載體，其中所述變體AAV8衣殼蛋白相對于 野生型AAV8衣殼蛋白包含氨基酸取代S315N。18. 根據(jù)權(quán)利要求15至17的任一項的重組AAV載體，其還包含存在于AAV8衣殼蛋白序列 中的一個或多個下列位置上的一個或多個氨基酸取代：125，151，163,206,460,495,502， 536，549，551，588，591和/或596。19. 根據(jù)權(quán)利要求18的重組AAV載體，其中所述變體AAV8衣殼蛋白相對于野生型AAV8衣 殼蛋白包含一個或多個下列氨基酸取代： (&)￥1251，0151厶，1(1635，厶2065，了4601，了495厶，陽02〇，卩536￥，陽49〇，厶5516,05885和/或 G596S;和/或 (b)T591R〇20. -種重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含： (a) 變體AAV3B衣殼蛋白，其中所述變體AAV3B衣殼蛋白相對于野生型AAV3B衣殼蛋白在 AAV3B衣殼蛋白序列的位置312上包含氨基酸取代;和 (b) 異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核苷酸序列。21. 根據(jù)權(quán)利要求20的重組AAV載體，其中（i)所述變體AAV3B衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 11具有至少95%的序列同一性的序列；和/或（ii)野生型AAV衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 11的序列。22. 根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的重組AAV載體，其中所述變體AAV3B衣殼蛋白相對 于野生型AAV3B衣殼蛋白包含氨基酸取代S312N。23. -種重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含： (a) 變體AAV-LK03衣殼蛋白，其中所述變體AAV-LK03衣殼蛋白相對于如SEQ ID N0:12 定義的AAV-LK03衣殼蛋白序列在位置312上包含氨基酸取代;和 (b) 異源核酸，其包含編碼基因產(chǎn)物的核苷酸序列。24. 根據(jù)權(quán)利要求23的重組AAV載體，其中所述變體AAV-LK03衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 12具有至少95%的序列同一性的序列。25. 根據(jù)權(quán)利要求1至14的任一項的重組AAV載體，其中所述重組AAV載體相較于包含相 應(yīng)的野生型AAV衣殼蛋白的AAV載體表現(xiàn)出神經(jīng)元或視網(wǎng)膜組織的增加的轉(zhuǎn)導(dǎo)。26. 根據(jù)權(quán)利要求15至24的任一項的重組AAV載體，其中所述重組AAV載體相較于相應(yīng) 的野生型AAV衣殼蛋白表現(xiàn)出肝臟組織的增加的轉(zhuǎn)導(dǎo)。27. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求的重組AAV載體，其中所述基因產(chǎn)物包括干擾RNA或適體。28. 根據(jù)權(quán)利要求1至27的任一項的重組AAV載體，其中所述基因產(chǎn)物包括多肽。29. 根據(jù)權(quán)利要求28的重組AAV載體，其中所述基因產(chǎn)物包括神經(jīng)保護(hù)多肽，抗血管生 成多肽，或增強(qiáng)神經(jīng)元或視網(wǎng)膜細(xì)胞的功能的多肽。30. 根據(jù)權(quán)利要求29的重組AAV載體，其中所述基因產(chǎn)物包括膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子， 成纖維細(xì)胞生長因子，神經(jīng)生長因子，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，視紫紅質(zhì)，retinoschisin， RPE65或外周蛋白。31. -種藥物組合物，其包含： (a) 根據(jù)前述任一權(quán)利要求的重組AAV載體;和 (b) 藥學(xué)上可接受的賦形劑。32. -種用于將基因產(chǎn)物遞送至受試者的組織的方法，所述方法包括向受試者施用根 據(jù)前述任一權(quán)利要求的重組AAV載體或藥物組合物。33. 根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述組織選自血液，骨髓，肌肉組織，神經(jīng)元組織，視 網(wǎng)膜組織，胰腺組織，肝臟組織，腎組織，肺組織，腸組織或心臟組織。34. 根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述組織是神經(jīng)元、視網(wǎng)膜或肝臟組織。35. -種用于治療受試者的病癥的方法，所述方法包括向受試者施用根據(jù)前述任一權(quán) 利要求的重組AAV載體或藥物組合物。36. 根據(jù)權(quán)利要求1至31的任一項的重組AAV載體或藥物組合物，其用于治療受試者的 病癥。37. 根據(jù)權(quán)利要求35或權(quán)利要求36使用的方法、重組AAV載體或藥物組合物，其中所述 病癥是神經(jīng)、眼部或肝臟病癥。38. 根據(jù)權(quán)利要求37使用的方法、重組AAV載體或藥物組合物，其中所述神經(jīng)病癥是神 經(jīng)變性疾病。39. 根據(jù)權(quán)利要求37使用的方法、重組AAV載體或藥物組合物，其中所述眼部病癥是青 光眼，色素性視網(wǎng)膜炎，黃斑變性，視網(wǎng)膜劈裂或糖尿病性視網(wǎng)膜病。
【文檔編號】A61P27/02GK106062200SQ201580008760
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年2月17日
【發(fā)明人】R·M·林登
【申請人】倫敦國王學(xué)院, 西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院