細胞培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明大體上涉及一種培養(yǎng)基，例如血清替代物、培養(yǎng)基補充物、完全培養(yǎng)基或低溫保存培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)生理緩沖劑和包含膽固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂質(zhì)體。預(yù)期與不使用本文中所描述的血清替代物培養(yǎng)的細胞相比，培養(yǎng)基提供改良的培養(yǎng)中細胞生長的優(yōu)點。
【專利說明】
細胞培養(yǎng)基
[0001 ]本申請要求2013年12月20日提交的美國臨時專利申請第61/918,833號的優(yōu)先權(quán)， 所述臨時專利申請W全文引用的方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明大體上設(shè)及一種細胞培養(yǎng)基組合物，例如血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng) 基補充物，其包含熱力學穩(wěn)定脂質(zhì)體和液體基礎(chǔ)混合物W在無血清環(huán)境中培養(yǎng)細胞。預(yù)期 脂質(zhì)體包含膽固醇和卵憐脂W及脂肪酸。也預(yù)期包含脂質(zhì)體的低溫保存培養(yǎng)基，其用于在 冷凍期間保存細胞。
【背景技術(shù)】
[0003] 用于體外實驗或離體培養(yǎng)W投予人類或動物的細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細 胞)培養(yǎng)為人類疾病研究和治療的一種重要工具。細胞培養(yǎng)廣泛用于生產(chǎn)各種生物活性產(chǎn) 品，如病毒疫苗、單克隆抗體、多膚生長因子、激素、酶W及腫瘤特異性抗原。然而，用于培養(yǎng) 細胞的許多培養(yǎng)基或方法包含可能對細胞生長和/或未分化細胞培養(yǎng)物的維持具有負面影 響的組分。舉例來說，哺乳動物或昆蟲細胞培養(yǎng)基常常補充有來自血液的血清，如小牛血清 (fetal calf se;rum;FCS)或胎牛血清（fetal bovine se;rum;FBS)，W便提供促進細胞在培 養(yǎng)物中增殖和生長的生長因子、載體蛋白、附著和擴散因子、養(yǎng)分W及微量元素。然而，在 FCS或FBS中發(fā)現(xiàn)的因子（如轉(zhuǎn)型生長因子（transforming growth factor;TGF)0或網(wǎng)膜酸） 可促進特定細胞類型分化化e等人，《美國病理學雜志(Am J Pathol.)》137:833-43，1990) 或引發(fā)細胞中可促進培養(yǎng)物中非所需細胞活性的不希望的下游信號傳導(Vel化oen等人， 《自然免疫學(Nat Immunol.)》7( 11 ):1151-6,2006)。
[0004] 血清組合物的非典型性和血清的批間差異使得無血清培養(yǎng)基中血清替代物和培 養(yǎng)物的使用為理想的(Pei等人，《男科學集刊(Arch An化〇1.)》49(5) :331-42,2003)。另外， 由于在向人體投予時潛在的病毒污染和/或動物蛋白的潛在免疫原性效應(yīng)，因此對于在細 胞培養(yǎng)物中生長的用于治療用途的細胞、重組蛋白或疫苗來說，添加來源于動物的組分為 不希望的。
[0005] 已經(jīng)研發(fā)血清替代物W嘗試最小化FCS對細胞培養(yǎng)的影響，W及最小化用于人類 細胞培養(yǎng)的動物蛋白的量。如KNOCKOUT?血清替代物（11^1付〇旨日11，化^36日(1，〔4)的血清替 代物稱為化學成分確定的培養(yǎng)基，其缺乏血清且含有用于細胞生長的基本養(yǎng)分和其它蛋白 質(zhì)。由于缺乏附著因子，使得此調(diào)配物中細胞附著不充分，因此KNOCKOUT SR?無法用作飼養(yǎng) 細胞平板培養(yǎng)中的FBS的替代物。PC-1?無血清培養(yǎng)基化〇nza，Wa化ersville，MD)為在特殊 改性DMEM/F12培養(yǎng)基基礎(chǔ)中調(diào)配的低蛋白無血清培養(yǎng)基且含有具有已知量的膜島素、轉(zhuǎn)鐵 蛋白、脂肪酸W及專有蛋白質(zhì)的完全肥PES緩沖系統(tǒng)。
[0006] Cellgro C0MPLETE?(Cellgro,Manassas，VA)為基于DMEM/F12、RPMI 1640W及麥 克柯伊氏(McCoy ' s)5A基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合物的無血清低蛋白培養(yǎng)基。CelIgro COMPLETE?不含 膜島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膽固醇、生長或附著因子，但包含微量元素和高分子量碳水化合物、附加 維生素、非動物蛋白源w及牛血清白蛋白的混合物。
[0007] 無血清培養(yǎng)基也描述于國際專利公開案第W02009023194號、國際專利公開案第 W02008137641號、國際專利公開案第W02006017370號、國際專利公開案第W02001011011號、 國際專利公開案第W02007071389號、國際專利公開案第W02007016366號、國際專利公開案 第W02006045064號、國際專利公開案第W02003064598號、國際專利公開案第W02001011011 號;美國專利公開案第US20050037492號、美國專利公開案第US20080113433號、美國專利公 開案第11520080299540號;美國專利第4,560,655號、美國專利第5,324,666號、美國專利第 6，162,643號、美國專利第6，103,529號、美國專利第6,048,728號、美國專利第7,709,229號 W及歐洲專利申請第EP2243827號中。
[0008] 美國專利7,220,538描述一種包含親脂性納米粒子和基礎(chǔ)營養(yǎng)培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng) 基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供一種包含基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物和包含膽固醇、卵憐脂W及脂肪 酸的脂質(zhì)體的培養(yǎng)基，其可用作血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物。所述培養(yǎng)基適用 于促進初生細胞或細胞系在細胞培養(yǎng)物中存活、生長和增殖，其中所述培養(yǎng)基包含具有有 助于細胞維持和生長的脂質(zhì)形態(tài)的脂質(zhì)體。也預(yù)期包含脂質(zhì)體的低溫保存培養(yǎng)基。
[0010] 在各種實施例中，本發(fā)明提供一種用于懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的細胞的培養(yǎng)基， 所述培養(yǎng)基包含:基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物;和(a)包含膽固醇、卵憐脂W及脂肪酸的脂 質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的量使得膽固醇在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度為1毫克/ 升到20毫克/升，且其中卵憐脂在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度為100毫克/升到 1000毫克/升;或(b)果膠;或(a)和(b)。
[0011] 在各種實施例中，脂質(zhì)體包含脂質(zhì)、脂肪酸、固醇和/或游離脂肪酸。示例性脂肪酸 包括(但不限于)次亞麻油酸、亞麻油酸、肉豆違酸、油酸肉豆違油酸、棟桐油酸、十六碳締 酸、反油酸、異油酸、反亞油酸、a-次亞麻油酸、二十碳四締酸、二十碳五締酸、芥子酸、二十 二碳六締酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棟桐酸、硬脂酸、二十燒酸、二十二燒酸、二十四燒酸W及 蠟酸。在各種實施例中，脂質(zhì)體包含一或多種由次亞麻油酸、亞麻油酸、肉豆違酸W及油酸 所構(gòu)成的群組中選出的脂肪酸。
[0012] 在各種實施例中，脂質(zhì)體進一步包含乙醇胺和聚山梨醇醋。在各種實施例中，脂質(zhì) 體包含抗氧化劑。
[0013] 在各種實施例中，基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物包含有機鹽、無機鹽、緩沖劑、鐵源 或鐵轉(zhuǎn)運體、甘油、氨基酸、維生素、糖W及微量元素中的一或多者。任選地，基礎(chǔ)生理緩沖 劑液體混合物包含抗氧化劑。
[0014] 在各種實施例中，鐵源或鐵轉(zhuǎn)運體是由W下各者所構(gòu)成的群組中選出：轉(zhuǎn)鐵蛋白、 乳鐵蛋白、硫酸亞鐵、巧樣酸亞鐵、巧樣酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、巧樣酸鐵錠、草酸鐵錠、反下 締二酸鐵錠、蘋果酸鐵錠W及下二酸鐵錠。
[0015] 在各種實施例中，基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物包含一或多種由W下各者所構(gòu)成的 群組中選出的氨基酸:甘氨酸丙氨酸精氨酸天冬酷胺、k天冬氨酸、k瓜氨酸、鹽 酸心半脫氨酸、k脫氨酸谷氨酸谷氨酷胺、k組氨酸異亮氨酸、k亮氨酸賴氨 酸、甲硫氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、IH?氨酸a-絲氨酸、蘇氨酸a-色氨酸、酪氨 酸^及心鄉(xiāng)氨酸。
[0016] 在各種實施例中，基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物包含一或多種由W下各者所構(gòu)成的 群組中選出的有機鹽或無機鹽:憐酸鐘、氯化巧(無水）、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯化儀(無 水）、硫酸儀(無水）、氯化鐘、氯化鋼、無水憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、氯化錫、硫酸鋒W及碳 酸氨鋼。
[0017] 在各種實施例中，脂質(zhì)體或基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物包含一或多種抗氧化劑。 示例性抗氧化劑包括(但不限于)生育酪、生育S締酪、a-生育酪、0-生育酪、丫-生育酪、S- 生育酪、a-生育S締酪、0-生育S締酪、a-生育釀、水溶性維生素6(6-徑基-2,5,7,8-四甲基 色燒-2-甲酸）、下基化徑基甲氧苯（butylated hydroxyanisole ;BHA)、下基化徑基甲苯 (buty lated hy化owtoluene; BHT)、類黃酬、異黃酬、西紅柿紅素、0-胡蘿h素、砸、泛釀、梅 毒菌素、S-腺巧甲硫氨酸、谷脫甘膚、牛橫酸、N義酷半脫氨酸、巧樣酸、k肉堿、冊T、單硫代 甘油、抗壞血酸、沒食子酸丙醋、甲硫氨酸、半脫氨酸、高半脫氨酸、谷脫甘膚、脫胺和脫硫酸 (cysstathionine) W及甘氨酸-甘氨酸-組氨酸(=膚）。
[0018] 在各種實施例中，基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物包含一或多種由W下各者所構(gòu)成的 群組中選出的維生素：生物素、氯化膽堿、D-泛酸巧、葉酸、煙堿酷胺、鹽酸化唉醇、雙黃素 (bibof lavin)、鹽酸硫胺、維生素B12W及異肌醇。
[0019] 在各種實施例中，基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物包含一或多種由W下各者所構(gòu)成的 群組中選出的微量元素:砸、鋼酸鹽、銘、鉆、儀、鋒、銅、儘、領(lǐng)、嫁、裡、錫、鐵、漠、艦、饑、錯、 鋼、娃、鐵、氣、銀、鋼、錯、儒W及侶。在各種實施例中，液體混合物包含砸和鋼酸鹽。
[0020] 在各種實施例中，培養(yǎng)基為血清替代物、完全培養(yǎng)基、培養(yǎng)基補充物或低溫保存培 養(yǎng)基。
[0021] 在各種實施例中，用于細胞培養(yǎng)的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物包含 脂質(zhì)體和基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物。任選地，完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物包含果膠。在各 種實施例中，血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物進一步包含基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混 合物，其包含一或多種有機鹽或無機鹽、鐵供體，且任選地包含果膠、甘油、氨基酸、維生素、 糖、有機鹽、無機鹽W及微量元素。
[0022] 在各種實施例中，本發(fā)明也提供包含脂質(zhì)體和基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物的血清 替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其中脂質(zhì)體包含卵憐脂、乙醇胺、次亞麻油酸、亞麻油 酸、膽固醇W及聚山梨醇醋，且基礎(chǔ)液體混合物包含至少一種有機鹽或無機鹽、至少一種 糖、甘油、至少一種微量元素、至少一種非離子表面活性劑W及至少一種鐵源。在各種實施 例中，脂質(zhì)體或基礎(chǔ)液體混合物包含至少一種抗氧化劑。
[0023] 在各種實施例中，對于本文中所描述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物， 脂質(zhì)體的量使得膽固醇在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度為1毫克/升到20毫克/ 升，且其中卵憐脂在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度為100毫克/升到1000毫克/升。
[0024] 在各種實施例中，脂質(zhì)體包含一或多種由次亞麻油酸、亞麻油酸、肉豆違酸W及油 酸所構(gòu)成的群組中選出的脂肪酸。預(yù)期的額外脂肪酸包括(但不限于）肉豆違油酸、棟桐油 酸、十六碳締酸、反油酸、異油酸、反亞油酸、a-次亞麻油酸、二十碳四締酸、二十碳五締酸、 芥子酸、二十二碳六締酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棟桐酸、硬脂酸、二十燒酸、二十二燒酸、二十 四燒酸w及蠟酸。
[0025] 在各種實施例中，脂質(zhì)體進一步包含乙醇胺。在各種實施例中，脂質(zhì)體進一步包含 聚山梨醇醋。預(yù)期聚山梨醇醋可為聚山梨醇醋20、聚山梨醇醋40、聚山梨醇醋60或聚山梨醇 醋80。示例性聚山梨醇醋包括TWEEN? 20和TWEEN愈80。
[0026] 在各種實施例中，一或多種有機鹽或無機鹽是由W下各者所構(gòu)成的群組中選出： 憐酸鐘、氯化巧(無水）、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯化儀(無水）、硫酸儀(無水）、氯化鐘、氯 化鋼、無水憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、氯化錫、硫酸鋒W及碳酸氨鋼。在各種實施例中，液體 混合物包含氯化鋼、氯化鐘、憐酸鋼W及憐酸鐘。
[0027] 在各種實施例中，培養(yǎng)基進一步包含鐵源或鐵轉(zhuǎn)運體。在各種實施例中，鐵源或鐵 轉(zhuǎn)運體是由W下各者所構(gòu)成的群組中選出:轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、硫酸亞鐵、巧樣酸亞鐵、巧 樣酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、巧樣酸鐵錠、草酸鐵錠、反下締二酸鐵錠、蘋果酸鐵錠W及下二酸 鐵錠。在各種實施例中，鐵源為巧樣酸鐵。在各種實施例中，鐵轉(zhuǎn)運體為轉(zhuǎn)鐵蛋白。
[00%]在各種實施例中，血清替代物進一步包含銅源或銅轉(zhuǎn)運體(例如G皿-Cu)。示例性 銅源包括(但不限于)氯化銅和硫酸銅。
[0029] 在各種實施例中，液體混合物包含一或多種由Pluronic-68(F68pastille)、 Pluronic-128、去水山梨醇、聚山梨醇醋W及嵌段共聚物所構(gòu)成的群組中選出的非離子表 面活性劑。在各種實施例中，非離子表面活性劑為Pluronic-68(F68pastille)。
[0030] 在各種實施例中，每升培養(yǎng)基提供甘油在細胞培養(yǎng)物(例如細胞懸浮液或貼壁培 養(yǎng)物）中的最終濃度為約2微升/升到0.5毫升/升。
[0031 ]在各種實施例中，培養(yǎng)基提供果膠在細胞培養(yǎng)物(例如細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物） 中的最終濃度為約0.25克/升到0.5克/升，或25毫克/升到500毫克/升。
[0032] 在各種實施例中，培養(yǎng)基提供砸在細胞培養(yǎng)物(例如細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物）中 的最終濃度為約0.005毫克/升到0.050毫克/升。
[0033] 在各種實施例中，也預(yù)期血清替代物，其中來自脂質(zhì)體的膽固醇在血清替代物中 的最終濃度為約10毫克/升到200毫克/升，且來自脂質(zhì)體的卵憐脂在血清替代物中的最終 濃度為約50毫克/升到1克/升，或約1000毫克/升到10克/升。
[0034] 在各種實施例中，本發(fā)明提供一種完全培養(yǎng)基，其中來自脂質(zhì)體的膽固醇在完全 培養(yǎng)基中的濃度為約1毫克/升到20毫克/升，且來自脂質(zhì)體的卵憐脂在完全培養(yǎng)基中的濃 度為約100毫克/升到1000毫克/升。
[0035] 在各種實施例中，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)基補充物，其中來自脂質(zhì)體的膽固醇在培 養(yǎng)基補充物中的濃度為約100毫克/升到2000毫克/升或大于2000毫克/升，且來自脂質(zhì)體的 卵憐脂在培養(yǎng)基補充物中的濃度為約10克/升到100克/升。
[0036] 在各種實施例中，本發(fā)明提供一種低溫保存培養(yǎng)基，其中來自脂質(zhì)體的膽固醇在 低溫保存培養(yǎng)基中的最終濃度為約10毫克/升到200毫克/升，且來自脂質(zhì)體的卵憐脂在低 溫保存培養(yǎng)基中的最終濃度為約1000毫克/升到10克/升。
[0037] 在各種實施例中，脂質(zhì)體為納米粒子。在各種實施例中，納米粒子具有范圍為約50 納米到500納米，約100納米到約300納米或約100納米到200納米的平均直徑。
[0038] 本文提供脂質(zhì)體為熱力學穩(wěn)定的。在各種實施例中，脂質(zhì)體在水溶液中為穩(wěn)定的 (例如不沉淀）。在各種實施例中，脂質(zhì)體在水溶液中在37°C、25°C、4°C、0°C或-20°C下穩(wěn)定 至少7天、10天、14天、21天、30天、2個月、3個月、6個月或1年或大于1年的時間段。示例性水 溶液包括(但不限于）水、緩沖生理鹽水和其它平衡鹽溶液、基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基W及完全細胞 培養(yǎng)基。
[0039] 本文也提供一種細胞低溫保存培養(yǎng)基，其包含脂質(zhì)體、基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合 物W及任選的果膠。
[0040] 本文也預(yù)期一種細胞低溫保存培養(yǎng)基，其包含基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物和果 膠。
[0041 ]在各種實施例中，在低溫保存培養(yǎng)基中，果膠在細胞懸浮液中的最終濃度為約 0.25克/升到5克/升，或250毫克/升到5000毫克/升或約50毫克/升到5克/升。
[0042] 在各種實施例中，本文中所描述的低溫保存培養(yǎng)基進一步包含甘油。在各種實施 例中，當使用低溫保存培養(yǎng)基時，甘油在細胞懸浮液中的最終濃度為約0.2毫升/升到5毫 升/升。
[0043] 在各種實施例中，低溫保存培養(yǎng)基進一步包含脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)體包含膽固醇、卵 憐脂W及脂肪酸，其中脂質(zhì)體的量使得膽固醇在細胞懸浮液中的最終濃度為約10毫克/升 到200毫克/升，且其中卵憐脂在細胞懸浮液中的最終濃度為約1克/升到10克/升。
[0044] 在各種實施例中，低溫保存培養(yǎng)基進一步包含二甲亞諷(dimethyl sulfoxide; DMSO)，其中DMSO在低溫保存培養(yǎng)基中的濃度小于或等于4%。在各種實施例中，DMSO的濃度 為 4%、3%、2%、1%或0.5%。
[0045] 在各種實施例中，低溫保存培養(yǎng)基進一步包含聚賴氨酸。在各種實施例中，聚賴氨 酸為改性聚賴氨酸。在各種實施例中，聚賴氨酸為e-聚-k賴氨酸。在某些實施例中，聚賴氨 酸包含簇化胺基。在各種實施例中，聚賴氨酸的最終濃度為約10%、9%、8%、7%、6%、5%、 4%、3%、2%、1%或0.5%。
[0046] 在各種實施例中，在添加到細胞培養(yǎng)物前，將血清替代物或培養(yǎng)基補充物添加到 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。標準基礎(chǔ)培養(yǎng)基在所屬領(lǐng)域中已知且可購得。此類培養(yǎng)基的實例包括(但不限 于）杜爾貝科氏改性伊格爾培養(yǎng)基（Du化ecco's Modified Eagle's Medium;DMEM)、DMEM F12、伊斯寇氏改性達爾伯克培養(yǎng)基（Iscove's Modified Du化ecco's Medium)、漢姆氏養(yǎng) 分混合物F-10(化m's Nutrient mix1:ure F-10)(漢姆氏F-10(化m's F-10))或漢姆氏F- 12、羅斯威爾帕克紀念學會培養(yǎng)基（Roswell Park Memorial Institute Medium;RPMI)、 MCDB 131、克里克氏培養(yǎng)基(Click's medium)、麥克柯伊氏5A培養(yǎng)基、培養(yǎng)基199、威廉姆氏 培養(yǎng)基E(William's Medium E)W及如格雷斯氏培養(yǎng)基（Grace's medium)和TNM-即的昆蟲 培養(yǎng)基。
[0047] 運些培養(yǎng)基中的任一者任選地補充有鹽、氨基酸、維生素、緩沖劑、核巧酸、抗生 素、微量元素W及葡萄糖或等效能量來源。也可包括所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的適當濃度 的其它任選的補充物。培養(yǎng)基補充物為所屬領(lǐng)域中眾所周知且可購得，且更詳細描述于具 體實施方式中。
[004引在各種實施例中，更預(yù)期血清替代物本身包含如上文所描述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補充 物的要素，例如鹽、氨基酸、維生素、緩沖劑、核巧酸、抗生素、微量元素、抗氧化劑W及葡萄 糖或等效能量來源，W使得血清替代物W無血清完全培養(yǎng)基形式提供。
[0049]在各種實施例中，培養(yǎng)基不含動物組分。
[0050] 在各種實施例中，脂質(zhì)體負載有本文中所描述的基礎(chǔ)液體混合物。更預(yù)期脂質(zhì)體 負載有在細胞培養(yǎng)中有利的其它組合物。在細胞培養(yǎng)中有利的示例性組合物包括(但不限 于)緩沖劑、鐵轉(zhuǎn)運體、游離脂肪酸、生長膚(例如膜島素、包含甘氨酸-組氨酸-賴氨酸=聚 體的GHK膚）、氨基酸(必需和非必需）、維生素、微量元素、抗氧化劑和/或鹽。
[0051] 在各種實施例中，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)細胞的方法，其包含在完全培養(yǎng)基或含有 本文中所描述的血清替代物或培養(yǎng)基補充物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
[0052] 在各種實施例中，細胞在由哺乳動物細胞和昆蟲細胞所構(gòu)成的群組中選出。在各 種實施例中，細胞自哺乳動物個體分離。在各種實施例中，細胞為原始培養(yǎng)物或細胞系。在 各種實施例中，細胞是由W下各者所構(gòu)成的群組中選出：多能性干細胞、胚胎干細胞、骨髓 基質(zhì)細胞、造血祖細胞、淋己干細胞、骨髓干細胞、T細胞、B細胞、巨隧細胞、肝細胞、膜腺細 胞W及細胞系。
[0053 ] 預(yù)期的哺乳動物細胞系包括（但不限于）CH0、CH0K1、DXB-11、DG-44、CH0/-DHFR、 CV1、C0S-7、肥K293、B服、TM4、VER0、肥LA、MDCK、B化 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、T細胞系（例如化rkat)、B細胞系（例女日8146、6胖36、〔446、51486^及船116、1?曰占-1、 化malvaW及Daudi)、3T3、RIN、A549、PC12、K562、l：)ER.C6度、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、 L929、融合瘤、癌細胞系W及所屬領(lǐng)域中眾所周知的其它細胞系。預(yù)期的昆蟲細胞系包括 (但不限于）Sf9、Sf21、HIGHFIVE?、EXPRESSF+及、S2、l'n5、TN-368、BmN、Schneider2、D2、 C6/36W及KC細胞。
[0054] 在各種實施例中，本發(fā)明涵蓋一種低溫保存細胞的方法，其包含使細胞懸浮在本 文中所描述的低溫保存培養(yǎng)基中，所述低溫保存培養(yǎng)基任選地包含果膠或任選地包含脂質(zhì) 體，且將細胞置于小于8°C的環(huán)境中。低于8°C的示例性溫度包括(但不限于)溫度處于或低 于 4 °C、0°C、-20°C、-70°C、-135 °C 或在液氮(-196 °C)中。
[0055] 在各種實施例中，所述方法進一步包含使細胞解凍且將其置于如本文所描述的培 養(yǎng)基中。
[0056] 在各種實施例中，解凍后，當置于本文中所描述的培養(yǎng)基時，無論用作血清替代 物、培養(yǎng)基補充物或完全培養(yǎng)基，至少30 %的冷凍細胞仍然有活力。在各種實施例中，解凍 后細胞的存活率為約40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%或高于80%。
[0057] 在一個實施例中，WlO毫升、50毫升、100毫升、500毫升或1升的體積封裝培養(yǎng)基 (血清替代物、培養(yǎng)基補充物、完全培養(yǎng)基或低溫保存培養(yǎng)基）。在一個相關(guān)實施例中，將血 清替代物、培養(yǎng)基補充物或低溫保存培養(yǎng)基封裝于1 X、5X、10X或20X溶液中。
[005引也提供一種制造本文中所描述的脂質(zhì)體的方法。在各種實施例中，制造脂質(zhì)體的 方法包含將所需量的膽固醇溶解于非甲醇或非氯仿溶液中。在各種實施例中，將膽固醇溶 解于液體憐脂溶液中。在各種實施例中，在室溫下膽固醇混合在非甲醇或非氯仿溶液中，或 在非甲醇或非氯仿溶液中加熱，直到膽固醇成溶液。溶液可加熱到約35°C、40°C、45°C、50 °C、55°C或60°C，且不超過80°C。一旦成溶液，將W下組合物添加到膽固醇組合物且混合:聚 山梨醇醋、乙醇胺W及脂肪酸。將最終混合物儲存在4°C、0°C或-20°C下。任選地，混合膽固 醇溶液，隨后添加殘余化合物。
[0059]在各種實施例中，預(yù)期如本文所描述的某些培養(yǎng)基組合物或脂質(zhì)體組合物促進改 良的細胞培養(yǎng)，例如相比于包含不同組的組分的培養(yǎng)基或脂質(zhì)體組合物，細胞生長增加、細 胞存活率增加或重組蛋白質(zhì)表達增加。預(yù)期那些促進改良的細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基或脂質(zhì)體組 合物用于進一步實驗。
[0060] 應(yīng)理解本文中所描述的各特征或?qū)嵤├蚪M合為本發(fā)明方面中任一者的非限制 性、示例性實例，且因此，打算與本文中所描述的任何其它特征或?qū)嵤├蚪M合可組合。運 些類型實施例中每一者為特征的一個非限制性實例，所述特征打算與本文中所描述的任何 其它特征或特征組合進行組合而不必列出每個可能的組合。此類特征或特征組合適用于本 發(fā)明方面中的任一者。當掲露落在范圍內(nèi)的數(shù)值實例時，預(yù)期運些實例中任一者為一個范 圍的可能端點，預(yù)期在所述端點之間的任何和所有數(shù)值，且預(yù)想上端點與下端點的任何和 所有組合。
【附圖說明】
[0061] 圖1展示相比于可商購的美國食品藥物管理局(抑A)認可的無血清培養(yǎng)基，本文中 描述的血清替代物對所刺激脾細胞的影響。
[0062] 圖2A和圖2B展示相比于在包含胎牛血清的培養(yǎng)基中的脾細胞培養(yǎng)，本文中所描述 的血清替代物對所刺激脾細胞生長的影響。
[0063] 圖3A展示與培養(yǎng)基加 FBS相比，血清替代物加生長因子將誘發(fā)更大程度的細胞增 殖。圖3B展示相比于FBS，當用血清替代物培養(yǎng)細胞時，增殖中的實驗內(nèi)差異減小。
[0064] 圖4A展示歷經(jīng)3天培養(yǎng)，相比于在培養(yǎng)基加 FBS中培養(yǎng)的細胞，血清替代物加生長 因子中的細胞培養(yǎng)減少細胞死亡水平。圖4B展示相比于包含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，當用含血清替代 物的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞時，細胞調(diào)亡的實驗內(nèi)差異減小。
【具體實施方式】
[0065] 本發(fā)明提供一種包含基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物和包含膽固醇、卵憐脂W及脂肪 酸的脂質(zhì)體的培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基可為血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物組合物，其 用于體外細胞培養(yǎng)W便提供類似在胎牛血清細胞(FBS)中生長的生長而沒有FBS對細胞生 理機能所貢獻的非特定副作用。血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物提供一種包含生 理學相關(guān)濃度的膽固醇和卵憐脂與脂肪酸組合的脂質(zhì)體W使得在血清替代物、完全培養(yǎng)基 或培養(yǎng)基補充物中的脂質(zhì)體向細胞提供一個類似于血漿膜的環(huán)境。任選地，完全培養(yǎng)基、血 清替代物或培養(yǎng)基補充物包含果膠。也提供一種包含脂質(zhì)體和/或果膠的低溫保存培養(yǎng)基。 本文的培養(yǎng)基(血清替代物、完全培養(yǎng)基、培養(yǎng)基補充物或低溫保存培養(yǎng)基)組合物提供優(yōu) 于在含F(xiàn)BS培養(yǎng)基中或在無血清培養(yǎng)基中進行細胞培養(yǎng)的優(yōu)勢。
[0066] 如本說明書和所附權(quán)利要求書中所使用，除非上下文明確規(guī)定，否則不定冠詞"一 (a)"和"一(an)" W及定冠詞"所述(the)"包括復(fù)數(shù)W及單數(shù)指示物。
[0067] 術(shù)語"約(about)"或"大約（approximately)"意指由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員確定的 可接受特定值誤差，其在某種程度上視所述值如何測量或測定而定。在某些實施例中，術(shù)語 "約"或"大約"意指在1、2、3或4個標準偏差內(nèi)。在某些實施例中，術(shù)語"約"或"大約"意指在 給定值或范圍的 30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、 0.5%或 0.05%內(nèi)。
[006引如本文中所使用，"培養(yǎng)基(media)"或"細胞培養(yǎng)基（cell culture media)"是指 提供細胞生長、存活或儲存的水溶液類溶液。如本文中預(yù)期的培養(yǎng)基可補充有如實施方式 中描述的養(yǎng)分W促進培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的細胞的所需細胞活性，如細胞存活率、生長、增殖、 分化。如本文所使用的培養(yǎng)基包括血清替代物、培養(yǎng)基補充物、完全培養(yǎng)基或低溫保存培養(yǎng) 基。
[0069] 如本文所使用，"血清替代物(serum replacement)"或"血清替代物培養(yǎng)基(ser皿 r邱lacement media)"是指可與基礎(chǔ)培養(yǎng)基結(jié)合使用或用作完全培養(yǎng)基W便促進培養(yǎng)物中 細胞生長和生存的組合物。在各種實施例中，血清替代物作為典型地添加到體外細胞培養(yǎng) 的培養(yǎng)基中的任何血清的替代物用于基礎(chǔ)或完全培養(yǎng)基中。預(yù)期血清替代物包含蛋白質(zhì)和 用于培養(yǎng)物中細胞生長和生存的其它因子。在各種實施例中，在用于細胞培養(yǎng)前，將血清替 代物添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在各種實施例中，更預(yù)期血清替代物可包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和基礎(chǔ)養(yǎng) 分，如鹽、氨基酸、維生素、微量元素、抗氧化劑等，W使得血清替代物適用作用于細胞培養(yǎng) 的無血清完全培養(yǎng)基。
[0070] 如本文所使用，"基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basal media/base media/base medium)"或"基礎(chǔ) 營養(yǎng)培養(yǎng)基(base nutritive media)"是指基礎(chǔ)鹽養(yǎng)分或鹽和其它要素的水溶液，其向細 胞提供正常細胞代謝所必需的水和某些大量無機離子，且維持細胞內(nèi)和細胞外滲透平衡。 在各種實施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含至少一種碳水化合物作為能量來源，和/或緩沖系統(tǒng)W維 持培養(yǎng)基在生理pH范圍內(nèi)。可商購基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實例包括（但不限于）憐酸鹽緩沖鹽水 (phosphate buffered saline;PBS)、杜爾貝科氏改性伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、最低必需培養(yǎng) 基（Minimal Essential Medium;MEM)、伊格爾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Basal Medium Eagle ;BME)、 RPMl 1640、漢姆氏F-10、漢姆氏F-12、a-最低必需培養(yǎng)基(aMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養(yǎng) 基（Glasgow's Minimal Essential Medium;G-MEM)、伊斯科夫氏改性杜爾貝科氏培養(yǎng)基 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)或經(jīng)改性用于多能細胞的通用培養(yǎng)基，如X- VIVO(Lonza)或造血干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基可補充有如實施方式中更詳細描述的 養(yǎng)分。
[0071] 如本文中所使用，"完全培養(yǎng)基(complete media)"是指進一步包含可促進細胞生 長的額外補充物(如生長因子、激素、蛋白質(zhì)、血清或血清替代物、微量元素、糖、抗生素抗氧 化劑等）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。舉例來說，可商購?fù)耆囵B(yǎng)基包含補充物，如乙醇胺、谷脫甘膚(還 原型）、抗壞血酸憐酸醋、膜島素、人類轉(zhuǎn)鐵蛋白、富含脂質(zhì)牛血清蛋白、微量鹽、亞砸酸鋼、 偏饑酸錠、硫酸銅W及氯化亞儘(DMEM ADVANCED?培養(yǎng)基，Life Technologies)。
[0072] 如本文中所使用，"培養(yǎng)基補充物(media supplement)"是指在細胞培養(yǎng)前添加到 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試劑或組合物。培養(yǎng)基補充物可為對培養(yǎng)物中細胞生長有利的試劑，如生長 因子、激素、蛋白質(zhì)、血清或血清替代物、微量元素、糖、抗生素、抗氧化劑等。典型地，培養(yǎng)基 補充物為所需補充物的濃縮溶液，其稀釋成完全或基礎(chǔ)培養(yǎng)基W達到適用于細胞培養(yǎng)的最 終濃度。
[0073] 如本文所使用，"低溫保存培養(yǎng)基(CTyopreservation media)"是指適于在處于或 低于8°C溫度(包括處于或低于4°C、0°C、-20°C、-70°C、-135°C或在液氮(-196°C)中的溫度） 下將細胞懸浮儲存或冷凍的培養(yǎng)基。
[0074] 如本文所使用，"果膠(pectin)"是指來源于植物細胞壁的結(jié)構(gòu)性雜多糖，其分子 量為30,000道爾頓(Da)到250,000道爾頓。果膠主要由a-1-4鍵聯(lián)半乳糖醒酸殘基構(gòu)成。在 某些實施例中，果膠醋化，例如55%、60%、65%、70%、75%或高于75%醋化，且可為高醋果 膠或低醋果膠。在各種實施例中，果膠對巧敏感。巧敏感果膠能夠與巧相互作用形成凝膠， 而非巧敏感果膠不能。預(yù)期果膠在pH 4.5-6.9范圍內(nèi)的酸性溶液內(nèi)或pH7.5到10范圍內(nèi)的 堿性溶液內(nèi)，視所用果膠類型而定。任選地，果膠在抑范圍7.0-7.4的溶液中。使用所屬領(lǐng)域 中的常識和技能，可測定在不同pH水準下使用的果膠，且在所需pH水準下使用的果膠受果 膠的醋化程度或巧敏感性影響。
[0075] 通過商業(yè)來源供應(yīng)果膠，且其可來自具有果膠的任何植物，如梨、蘋果、番石惱、冥 護、李子、醋栗、相橘和其它相枯類水果、樓桃、葡萄W及草替。具有不同醋化（甲基化)度和 巧敏感性的果膠組合物描述于W0 2000008952中，其W引用的方式并入本文中。
[0076] 如本文中所使用，"脂質(zhì)體(liposomeT是指包含包圍內(nèi)部水溶液空間的外脂質(zhì)雙 層或多層膜的封閉結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體可為多層或單層。預(yù)期脂質(zhì)體的尺寸在直徑5微米到10微米 到納米粒子尺寸范圍內(nèi)。在某些實施例中，脂質(zhì)體納米粒子直徑為約50納米到500納米，約 100納米到300納米或約100納米到200納米。
[0077] 如本文所使用，"液體基礎(chǔ)混合物（liquid base mix)"或"基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混 合物(base physiological buffer liquid mix)"是指血清替代物或培養(yǎng)基補充物的基礎(chǔ) 液體溶液，其中脂質(zhì)體懸浮W形成細胞培養(yǎng)基組合物。在各種實施例中，更預(yù)期將液體基礎(chǔ) 混合物裝載入脂質(zhì)體W使得當與細胞培養(yǎng)物中的細胞融合/由細胞吸收時，脂質(zhì)體向細胞 傳遞一定量的液體基礎(chǔ)混合物。在各種實施例中，本文中預(yù)期液體基礎(chǔ)混合物或基礎(chǔ)生理 緩沖劑液體混合物為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基或生理緩沖溶液，如憐酸鹽緩沖鹽水(PBS)和 其它平衡鹽溶液，其可與脂質(zhì)體和/或本文中其它組分結(jié)合使用來形成血清替代物、完全培 養(yǎng)基、培養(yǎng)基補充物或低溫保存培養(yǎng)基。
[0078] 如本文所使用，"改良的細胞培養(yǎng)"是指相比于使用不包含脂質(zhì)體的血清替代物或 無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)，當使用本文中所描述的培養(yǎng)基組合物(血清替代物、完全培養(yǎng)基 或培養(yǎng)基補充物)培養(yǎng)時，細胞增殖增加、細胞生長增加、細胞死亡減少或細胞的蛋白質(zhì)產(chǎn) 生（重組型或內(nèi)源性）增加。使用所屬領(lǐng)域中眾所周知的方法，包括生長曲線分析、刺激指 數(shù)、錐蟲藍微觀評估、氣化胸巧(?)、增殖分析、MTT分析、刃天青類分析W及DNA梯度變化分 析來測量增殖增加、生長增加和細胞死亡變化。使用所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)，包括量化總蛋 白質(zhì)或mRNA，或定量相關(guān)特定蛋白質(zhì)的含量，測量細胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)生(重組型或內(nèi)源性)增 加。
[0079] 如本文中所使用，"無動物組分"是指其中組分不來源于動物的組合物。預(yù)期組分 W重組方式產(chǎn)生或來源于植物或其它來源，而非直接自動物分離。如本文中所使用，無動物 組分允許培養(yǎng)基組分在動物類細胞系中重組產(chǎn)生。
[0080] 培養(yǎng)基組合物
[0081] 先前已描述包含脂質(zhì)組分和脂質(zhì)體的細胞培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)，但成就有限。舉 例來說，Hams等人（《美國國家科學院院刊（Proc化tl Acad USA)》78:5588-92，1981)掲露 在包含不同脂質(zhì)組分(例如包含膽固醇、卵憐脂或純化卵憐脂、銷憐脂W及維生素E的脂質(zhì) 體)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類纖維母細胞。然而，Hams描述脂質(zhì)體不穩(wěn)定，因為其需要在使用的 24小時內(nèi)制備，且展示在完全培養(yǎng)基中僅使用脂質(zhì)體不促進細胞生長。Spens等人(《生物技 術(shù)進展(Biotechnol Prog)》21:87-95,2005)描述在尤其進一步包含膽固醇、環(huán)糊精、卵憐 月旨、維生素E、巧樣酸鐵、Pluronic和氨基酸的無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)NSO骨髓瘤細胞。Spens (前述)描述脂質(zhì)自溶液W高水平沉淀（引用Keen等人，《細胞技術(shù)學(切totechnology)》17 (3):203-11,1995)0
[0082] 制造脂質(zhì)體的方法在所屬領(lǐng)域中已知，包括用于制造多層小泡（具有一系列同屯、 雙層脂質(zhì)）的液體水合或溶劑小球制備，用W制備單層小泡(具有單層脂質(zhì)）的衛(wèi)生設(shè)備、法 式壓制、溶劑注入、清潔劑去除、逆相蒸發(fā)、巧誘發(fā)融合、微流體化或凍融方法。
[0083] 脂質(zhì)體制備描述于美國專利7，220，538號、美國專利第6，217，899號；美國專利公 開案第20100021531號；Lichtenbe;rg等人,《生物化學分析方法(Methods Biochem Anal.)》 33 : 337-462,1988; W及G .Gregoriadis :《脂質(zhì)體技術(shù)脂質(zhì)體制備和相關(guān)技術(shù)化iposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques)》，第2片反，第I-III卷，CRC Press。用于醫(yī)藥用途的脂質(zhì)體已掲露于Mozafari M,《脂質(zhì)體、方法和方案化iposomes. Methods and Protocols)》第1 卷，第2章，V.Wessing編2010,Humana Press。
[0084] 在各種實施例中，本發(fā)明提供一種用于懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的細胞的培養(yǎng)基， 所述培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物和(a)包含膽固醇、卵憐脂W及脂肪酸的脂質(zhì) 體，其中所述脂質(zhì)體的量使得膽固醇在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度為1毫克/升 到20毫克/升，且其中卵憐脂在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度為5毫克/升到100毫 克/升;或(b)果膠;或(a)和化）。
[0085] 在各種實施例中，培養(yǎng)基為血清替代物、培養(yǎng)基補充物或完全培養(yǎng)基。在各種實施 例中，本發(fā)明提供一種包含脂質(zhì)體和基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物，任選地包含果膠的細胞 低溫保存培養(yǎng)基，其中脂質(zhì)體包含膽固醇、卵憐脂W及脂肪酸。在各種實施例中，脂質(zhì)體的 量使得膽固醇在細胞懸浮液中的最終濃度為1毫克/升到20毫克/升，且其中卵憐脂在細胞 懸浮液中的最終濃度為5毫克/升到100毫克/升。
[0086] 在各種實施例中，本發(fā)明提供一種包含基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物和果膠的低溫 保存培養(yǎng)基。
[0087] 脂質(zhì)體可為多層或單層。預(yù)期脂質(zhì)體的尺寸在直徑5微米到10微米到納米粒子尺 寸范圍內(nèi)。在一些實施例中，脂質(zhì)體為納米粒子。在某些實施例中，納米粒子具有范圍為約 50納米到500納米，約100納米到約300納米，或約100納米到200納米的平均直徑?？墒褂盟?屬領(lǐng)域中已知的方法，包括使用Zetasizer (Malvern Instruments , Uni ted Kingdom)測量 脂質(zhì)體尺寸，其通過動態(tài)光散射方法將粒度測量為整個粒子的平均直徑值。
[0088] 在各種實施例中，脂質(zhì)體包含脂質(zhì)、脂肪酸、固醇和/或游離脂肪酸。在各種實施例 中，脂質(zhì)體包含為細胞生長提供更加生理相關(guān)環(huán)境的濃度的膽固醇和卵憐脂W及脂肪酸。 血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物組合物中的脂質(zhì)體組分的示例性最終濃度闡明于 表1中。
[0089] 表1
[00901
[0091] 在各種實施例中，血清替代物脂質(zhì)體包含最終濃度為約10毫克/升到200毫克/升、 25毫克/升到175毫克/升、50毫克/升到150毫克/升、60毫克/升到120毫克/升、20毫克/升到 100毫克/升、30毫克/升到90毫克/升、40毫克/升到80毫克/升或50毫克/升到70毫克/升的 膽固醇。在各種實施例中，血清替代物脂質(zhì)體包含最終濃度為約50毫克/升、約55毫克/升、 約60毫克/升、約65毫克/升、約70毫克/升或約75毫克/升的膽固醇。
[0092] 在各種實施例中，血清替代物中脂質(zhì)體的量使得膽固醇在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng) 物中的最終濃度為1毫克/升到20毫克/升，且其中卵憐脂在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的 最終濃度為5毫克/升到100毫克/升或100毫克/升到1000毫克/升。
[0093] 在各種實施例中，脂質(zhì)體包含一或多種脂肪酸。示例性脂肪酸包括(但不限于)次 亞麻油酸、亞麻油酸、肉豆違酸、油酸、肉豆違油酸、棟桐油酸、十六碳締酸、反油酸、異油酸、 反亞油酸、a-次亞麻油酸、二十碳四締酸、二十碳五締酸、芥子酸、二十二碳六締酸、辛酸、癸 酸、月桂酸、棟桐酸、硬脂酸、二十燒酸、二十二燒酸、二十四燒酸W及蠟酸。在各種實施例 中，血清替代物脂質(zhì)體包含最終濃度為約0.5毫克/升到5毫克/升、0.75毫克/升到4毫克/ 升、1毫克/升到3毫克/升、0.5毫克/升到3毫克/升、0.5毫克/升到2毫克/升或1毫克/升到2 毫克/升的脂肪酸。在各種實施例中，血清替代物脂質(zhì)體包含最終濃度為約0.5毫克/升到5 毫克/升的亞麻油酸或次亞麻油酸。
[0094] 在各種實施例中，血清替代物脂質(zhì)體包含最終濃度為約0.5毫克/升到50毫克/升、 1毫克/升到50毫克/升、2.5毫克/升到40毫克/升、5毫克/升到35毫克/升、10毫克/升到30毫 克/升或15毫克/升到25毫克/升的乙醇胺。在各種實施例中，乙醇胺在血清替代物中的最終 濃度為約1毫克/升、2.5毫克/升、5毫克/升、10毫克/升、15毫克/升、20毫克/升、25毫克/升、 30毫克/升、35毫克/升、40毫克/升、45毫克/升或50毫克/升。
[00M]在各種實施例中，脂質(zhì)體進一步包含聚山梨醇醋。在某些實施例中，聚山梨醇醋為 聚山梨醇醋20、聚山梨醇醋40、聚山梨醇醋60或聚山梨醇醋80。示例性聚山梨醇醋包括 TWEEN海20或TWEEN⑧80。預(yù)期聚山梨醇醋在血清替代物中的最終濃度在約100微升/升 與1000微升/升之間，200微升/升到800微升/升，300微升/升到700微升/升或400至化00微 升/升。在各種實施例中，聚山梨醇醋在血清替代物中的最終濃度為約500微升/升。
[0096] 上文所描述的關(guān)于血清替代物組合物的最終濃度可用作計算培養(yǎng)基補充物或完 全培養(yǎng)基中的組分濃度的基礎(chǔ)。各別組分在培養(yǎng)基補充物中的最終濃度為用于血清替代物 組合物中的最終濃度的10倍。各別組分在完全培養(yǎng)基中的最終濃度為用于血清替代物中的 最終濃度的1 /10。示例性濃度闡明于表1和表2中。
[0097] 更預(yù)期W大于5 X或10 X的稀釋度使用血清替代物。在各種實施例中，Wl:5、l: 10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:100、1:200、1:250、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、 1:900、1:1000、1:1500或1:2000的稀釋度使用血清替代物。
[0098] 對于低溫保存培養(yǎng)基，組分的起始濃度與用于血清替代物培養(yǎng)基的濃度相同，即， 為用于完全培養(yǎng)基濃度的10倍濃度。然而，低溫保存培養(yǎng)基無需稀釋或僅在最低稀釋度下 即可使用，使得組分的最終濃度與起始濃度大約相等。舉例來說，在各種實施例中，對于低 溫保存培養(yǎng)基，膽固醇在細胞懸浮液中的最終濃度為10毫克/升到200毫克/升，且卵憐脂在 細胞懸浮液中的最終濃度為50毫克/升到1克/升，或1000毫克/升到10克/升。
[0099] 預(yù)期當用于完全細胞培養(yǎng)基溶液中時，盡管高濃度的膽固醇和卵憐脂存在于用于 血清替代物或培養(yǎng)基補充物中的脂質(zhì)體中且考慮到長期暴露于水溶液，本文中所描述的脂 質(zhì)體在水溶液中為熱力學穩(wěn)定的。本發(fā)明提供本文中所描述的具有如表1中闡明的組分最 終濃度的脂質(zhì)體在水溶液中為穩(wěn)定的（例如不沉淀）。在各種實施例中，脂質(zhì)體在水溶液中 在37°(：、25°(：、4°(：、0°(：或-20°(：下穩(wěn)定至少7天、10天、14天、21天、30天、2個月、3個月、6個月 或1年或大于1年的時間段。示例性水溶液包括(但不限于)水、緩沖生理鹽水和其它平衡鹽 溶液、基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基W及完全細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明脂質(zhì)體組合物的優(yōu)勢為其含有生理學 相關(guān)含量的固醇和脂肪酸，此提供極佳生長增效而在若干天后不自溶液沉淀，所述優(yōu)勢已 在包含高含量如膽固醇和卵憐脂的試劑的其它培養(yǎng)基中觀察到（Spens等人、Keen等人，前 述)。
[0100] 預(yù)期培養(yǎng)基的液體基礎(chǔ)混合物組分包含果膠、甘油、砸和鐵源中的一或多者。任選 地，液體基礎(chǔ)混合物進一步包含氨基酸、維生素、糖、無機鹽、抗氧化劑W及微量元素。類似 于上文所描述的脂質(zhì)體復(fù)合物，在其中制造脂質(zhì)體的液體基礎(chǔ)混合物可W用于血清替代 物、培養(yǎng)基補充物或完全培養(yǎng)基的不同濃度制造。示例性最終濃度闡明于表2中。
[0101] 表2 「01021
[0103] 在各種實施例中，甘油在血清替代物中的最終濃度為約0.02毫升/升到5毫升/升 (L)，或0.05毫升/升到4毫升/升、0.1毫升/升到3毫升/升、0.5毫升/升到2.5毫升/升或1暈 升/升到2毫升/升。在各種實施例中，甘油在血清替代物中的最終濃度為約0.02毫升/升、 0.05毫升/升、0.1毫升/升、0.25毫升/升、0.5毫升/升、1.0毫升/升、1.5毫升/升、2毫升/升、 2.5毫升/升、3毫升/升、3.5毫升/升、4毫升/升、4.5毫升/升或5毫升/升D
[0104] 在各種實施例中，果膠在血清替代物中的最終濃度為約0.25克/升到5克/升、0.5 克/升到4克/升、1.5克/升到3克/升或1克/升到2克/升。在各種實施例中，果膠在血清替代 物中的最終濃度為約0.25克/升、0.5克/升、0.75克/升、1克/升、1.5克/升、2克/升、2.5克/ 升、3克/升、3.5克/升、4克/升、4.5克/升或5克/升。
[0105] 示例性無機鹽包括(但不限于)憐酸鐘、氯化巧(無水）、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯 化儀(無水）、硫酸儀(無水）、氯化鐘、碳酸氨鋼、氯化鋼、無水憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、氯化 錫W及硫酸鋒。示例性有機鹽包括(但不限于)碳酸氨鋼或肥PES。
[0106] 示例性糖包括(但不限于)右旋糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖W及運些糖的多聚 體。
[0107] 示例性抗氧化劑包括(但不限于)生育酪、生育立締酪、a-生育酪、0-生育酪、丫 -生 育酪、S-生育酪、a-生育s締酪、(6-生育S締酪、a-生育釀、水溶性維生素6(6-?基-2,5,7, 8-四甲基色燒-2-甲酸）、下基化徑基甲氧苯(BHA)、下基化徑基甲苯(BHT)、類黃酬、異黃酬、 西紅柿紅素、e-胡蘿h素、砸、泛釀、梅毒菌素、S-腺巧甲硫氨酸、谷脫甘膚、牛橫酸、N-乙酷半 脫氨酸、削i酸、k肉堿、BHT、單硫代甘油、抗壞血酸、沒食子酸丙醋、甲硫氨酸、半脫氨酸、 高半脫氨酸、谷脫甘膚、脫胺和脫硫酸W及甘氨酸-甘氨酸-組氨酸(=膚）。
[010引示例性微量元素包括(但不限于)銅、鐵、鋒、儘、娃、鋼酸鹽、鋼、饑、儀、錫、侶、銀、 領(lǐng)、漠、儒、鉆、銘、巧、二價陽離子、氣、錯、艦、鋼、錯或砸。額外微量金屬掲露于W0 2006/ 004728 中。
[0109] 在各種實施例中，培養(yǎng)基或液體基礎(chǔ)混合物包含鐵源或鐵轉(zhuǎn)運體。示例性鐵源包 括(但不限于)鐵鹽和亞鐵鹽，如硫酸亞鐵、巧樣酸亞鐵、巧樣酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵;鐵錠化 合物，如巧樣酸鐵錠、草酸鐵錠、反下締二酸鐵錠、蘋果酸鐵錠W及下二酸鐵錠。示例性鐵轉(zhuǎn) 運體包括(但不限于)轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白。
[0110] 在各種實施例中，培養(yǎng)基或液體基礎(chǔ)混合物或脂質(zhì)體包含一或多種如上文所描述 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補充物的要素，例如鹽、氨基酸、維生素、緩沖劑、核巧酸、抗生素、微量元 素、抗氧化劑W及葡萄糖或等效能量來源，W使得培養(yǎng)基能夠用作無血清完全培養(yǎng)基。
[0111] 在各種實施例中，培養(yǎng)基或液體基礎(chǔ)混合物進一步包含銅源或銅轉(zhuǎn)運體（例如 GHK-化）。示例性銅源包括(但不限于)氯化銅和硫酸銅。
[0112] 在各種實施例中，鐵源或銅源W在約0.05納克/毫升到250納克/毫升、0.05納克/ 毫升到100納克/毫升、約0.05納克/毫升到50納克/毫升、約0.05納克/毫升到10納克/毫升、 約0.1納克/毫升到5納克/毫升、約0.5納克/毫升到2.5納克/毫升或約1納克/毫升到5納克/ 毫升范圍內(nèi)的最終濃度添加到血清替代物培養(yǎng)基。更預(yù)期鐵源或銅源在血清替代物中的最 終濃度為約0.05納克/毫升、0.1納克/毫升、0.25納克/毫升、0.35納克/毫升、0.45納克/毫 升、0.5納克/毫升、0.6納克/毫升、0.7納克/毫升、0.8納克/毫升、1納克/毫升、1.5納克/毫 升、2納克/毫升、2.5納克/毫升、3納克/毫升、4納克/毫升、5納克/毫升、6納克/毫升、7納克/ 毫升、8納克/毫升、9納克/毫升或10納克/毫升。
[0113] 上文所描述的關(guān)于血清替代物組合物的培養(yǎng)基或液體混合物中的組分的最終濃 度可用作計算培養(yǎng)基補充物或完全培養(yǎng)基中組分濃度的基礎(chǔ)。各別組分在培養(yǎng)基補充物中 的最終濃度為用于血清替代物組合物中的最終濃度的10倍。各別組分在完全培養(yǎng)基中的最 終濃度為用于血清替代物中的最終濃度的1/10。
[0114] 關(guān)于低溫保存培養(yǎng)基，預(yù)期用于血清替代物的起始濃度范圍與預(yù)期用于低溫保存 培養(yǎng)基的起始濃度范圍相同。然而，低溫保存培養(yǎng)基無需稀釋或僅在最低稀釋度下即可使 用，使得組分的最終濃度與起始濃度大約相等。舉例來說，在低溫保存培養(yǎng)基的各種實施例 中，果膠在細胞懸浮液中的最終濃度為約0.25克/升到5克/升、0.5克/升到4克/升、1.5克/ 升到3克/升或1克/升到2克/升。
[0115] 在各種實施例中，脂質(zhì)體負載有有利于細胞培養(yǎng)的組分。有利于細胞培養(yǎng)的示例 性組合物包括(但不限于)鐵轉(zhuǎn)運體、游離脂肪酸、生長膚（例如膜島素、包含甘氨酸-組氨 酸-賴氨酸S聚體的G皿膚）、氨基酸（必需和非必需）、維生素、微量元素、抗氧化劑W及鹽。 在各種實施例中，預(yù)期脂質(zhì)體負載有額外乙醇胺和游離脂肪酸。
[0116] 在各種實施例中，將血清替代物或培養(yǎng)基補充物添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基。標準基礎(chǔ)培 養(yǎng)基為細胞培養(yǎng)領(lǐng)域中已知且可購得。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實例包括(但不限于)杜爾貝科氏改性 伊格爾培養(yǎng)基(DMEMKDMEM F12(l:l)、伊斯寇氏改性達爾伯克培養(yǎng)基、漢姆氏養(yǎng)分混合物 F-10或F-12、羅斯威爾帕克紀念學會培養(yǎng)基(RPMIKMCDB 131、克里克氏培養(yǎng)基、麥克柯伊 氏5A培養(yǎng)基、培養(yǎng)基199、威廉姆氏培養(yǎng)基EW及如格雷斯氏培養(yǎng)基和TNM-FH的昆蟲培養(yǎng)基。
[0117] 也預(yù)期本文中所描述的血清替代物和培養(yǎng)基補充物用于可商購無血清培養(yǎng)基。示 例性無血清培養(yǎng)基包括（但不限于）AIM-V化ife Technologies,Carlsbad，CA)、PER-C6 (Life Technologies ,Carlsbad,CA)、Knock-0ut?(Life Technologies)、SlcmPrc):及'(Life Technologies)、CdlGro?(Corning Life Sciences-Mediatech Inc. ,Manassas ,VA) 〇
[0118] 運些培養(yǎng)基中的任一者任選地補充有鹽(如氯化鋼、巧、儀W及憐酸鹽）、氨基酸、 維生素、緩沖劑(如皿PES)、核巧酸（如腺巧和胸巧）、抗生素（如慶大霉素(gentamicin)藥 物）、微量元素(定義為通常W在微摩爾范圍內(nèi)的最終濃度存在的無機化合物）、抗氧化劑W 及葡萄糖或等效能量來源。也可包括所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的適當濃度的任何其它必要 的補充物。如溫度、pH值等的培養(yǎng)條件將為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所顯而易見。
[0119] 預(yù)期培養(yǎng)基組合物呈單元形式封裝。在一個實施例中，W10毫升、50毫升、100毫 升、500毫升或1升的體積封裝培養(yǎng)基(血清替代物、培養(yǎng)基補充物、完全培養(yǎng)基或低溫保存 培養(yǎng)基）。在一個相關(guān)實施例中，將血清替代物、培養(yǎng)基補充物或低溫保存培養(yǎng)基封裝于1 X、5X、10X或20X溶液中。
[0120] 細胞培養(yǎng)
[0121] 預(yù)期本文中所描述的培養(yǎng)基，例如血清替代物、培養(yǎng)基補充物、完全培養(yǎng)基或低溫 保存培養(yǎng)基適用于細胞體外培養(yǎng)，較佳適用于體外充分生長典型地需要血清補充物或明確 培養(yǎng)基的細胞。此類細胞包括真核細胞(如哺乳動物細胞)和昆蟲細胞。預(yù)期得益于使用血 清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物的哺乳動物細胞包括(但不限于)倉鼠、猴、黑猩猩、 狗、貓、母牛/公牛、豬、小鼠、大鼠、家兔、綿羊W及人類細胞。昆蟲細胞包括來源于草地粘蟲 (Spodoptera frugiperda)(毛蟲）、埃和斑蚊（Aedes aegypti)(蚊子）、白蚊伊蚊（Aedes albopictus)(蚊子）、黑腹果蛹（Drosophila melanogaster)(果蛹）W及家蠶（Bombyx mori)的細胞。
[0122] 預(yù)期經(jīng)血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物培養(yǎng)或經(jīng)低溫保存培養(yǎng)基冷凍的 細胞為不朽化細胞(細胞系)或非不朽化(初級或次生)細胞，且可為在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多種細胞 類型中的任一者。示例性細胞類型包括(但不限于)纖維母細胞、角質(zhì)細胞、上皮細胞、卵巢 細胞、內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、血液成形成分(例如淋己細胞、骨髓細胞）、軟骨細胞 和其它骨來源細胞、肝細胞、膜腺細胞W及運些體細胞類型的前驅(qū)細胞。
[0123] 在各種實施例中，預(yù)期用于培養(yǎng)基的細胞自哺乳動物個體分離。自哺乳動物個體 分離的細胞包括(但不限于）多能干細胞、胚胎干細胞、骨髓基質(zhì)細胞、造血祖細胞、淋己干 細胞、骨髓干細胞、淋己細胞、T細胞、B細胞、巨隧細胞、內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、軟骨 細胞和其它骨來源細胞、肝細胞、膜腺細胞、體細胞類型的前驅(qū)細胞W及任何癌瘤或腫瘤來 源細胞。
[0124] 在各種實施例中，細胞為細胞系。示例性細胞系包括(但不限于）中國倉鼠卵巢細 胞，包括C冊K1、DXB-11、DG-44 W及C冊/-DHFR;猴腎CV1、C0S-7;人胚腎化EK) 293;幼倉鼠腎 細胞(BHK);小鼠塞特利氏（sertoli)細胞(TM4);非洲綠猴腎臟細胞(VER0);人類子宮頸癌 細胞化ELA);犬類腎臟細胞(MDCK);布法羅(buffalo)大鼠肝臟細胞(B化3A);人類肺細胞 (W138);人類肝癌細胞化ep G2; SK-胎P);小鼠乳房腫瘤(MMT); TRI細胞;MRC 5細胞;FS4細 胞；T細胞系（Jurkat)、B細胞系、小鼠 3T3、RIN、A549、PC12、K562、PE及.C6⑩、SP2/0、NS-0、 U20S、HT 1080、L929、融合瘤、腫瘤細胞W及不朽化初生細胞。
[0125] 示例性昆蟲細胞系包括（但不限于）Sf9、Sf21、HIGHFIVE?、EXP民ES邸+啜、S2、 Tn5、TN-368、BmN、Schne ider 2、D2、C6/36 W 及KC細胞。
[01%]額外細胞類型和細胞系掲露于WO 2006/004728中，其W引用的方式并入本文中。 運些細胞包括（但不限于）CD34+造血細胞和骨髓譜系細胞、293胚胎腎臟細胞、A-549、 Jurkat、化ma 1 wa、皿LA、293BHK細胞、胎La子宮頸上皮細胞、PER-C6視網(wǎng)膜細胞(PER. C6)、 MDBK(NB^I)細胞、911細胞、CRFK細胞、MDCK細胞、BeWo細胞、張氏細胞（Chang ce 11)、 Detroit 562細胞、HeLa 229細胞、HeLa S3細胞、Hep-G2細胞、KB細胞、LS 180細胞、LS 174T 細胞、NCI-H-548細胞、RPMI 2650細胞、SW-13細胞、T24細胞、WI-28VA1 3、2RA細胞、WI甜細 胞、BS-C-I細胞、LLC-MK2細胞、克隆M-3細胞、1-10細胞、RAG細胞、TCMK-I細胞、Y-I細胞、 LLC-PK1細胞、PK(15)細胞、GH1細胞、GH3細胞、L2細胞、LLC-RC 256細胞、MH1C1細胞、XC細 胞、MD0K細胞、VSW細胞、TH-I、B1細胞或其衍生物;來自任何組織或器官(包括(但不限于）屯、 臟、肝臟、腎臟、結(jié)腸、腸、食道、胃、神經(jīng)組織（大腦、脊髓）、肺、血管組織（動脈、靜脈、毛細 管）、淋己組織(淋己腺、腺樣增殖體、扁桃體、骨髓W及血液）、脾、纖維母細胞W及纖維母細 胞類細胞系）的纖維母細胞、TRG-2細胞、IMR-33細胞、Don細胞、G皿-21細胞、瓜氨酸血癥細 胞、登普西細胞（Dempsey cell)、De1:;roi1:55l細胞、Detroit 510細胞、Detroit 525細胞、 Detroit 529細胞、Detroit 532細胞、Detroit539細胞、Detroit 548細胞、Detroit 573細 胞、皿L 299細胞、MR-90細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、WI-26細胞、MiCll細胞、CV-I細胞、 C0S-I 細胞、C0S-3 細胞、C0S-7 細胞、VER0 細胞、DBS-Fr化-2 細胞、BALB/3T3 細胞、F9 細胞、SV- T2 細胞、M-MSV-BALB/3T3 細胞、K-BALB 細胞、BL0-I1 細胞、N0R-I0 細胞、C3H/I0TI/2 細胞、 HSDM1C3細胞、KLN205細胞、麥克柯伊細胞、小鼠L細胞、株系2071 (小鼠L)細胞、L-M株系（小 鼠 U 細胞、L-MTK(小鼠 L)細胞、NCTC 克隆體2472 和 2555、SCC-PSA1 細胞、NS0、NSl、Swiss/3T3 細胞、印度鹿細胞、SIRC細胞、化細胞、延森細胞(Jensen 〇611)、0)5細胞、和592/0細胞、模 擬細胞和/或其衍生物。
[0127] 本文中預(yù)期的細胞培養(yǎng)條件可經(jīng)調(diào)整W適于適用于生長細胞的任何培養(yǎng)基質(zhì)。具 有適合表面的基質(zhì)包括組織培養(yǎng)孔、培養(yǎng)瓶、滾瓶、可透氣容器、平面或平行板生物反應(yīng)器 或細胞培養(yǎng)器。也預(yù)期其中細胞附著到懸浮保存于攬拌槽容器中的微載體或粒子的培養(yǎng)條 件。
[0128] 細胞培養(yǎng)方法通常描述于《動物細胞的培養(yǎng):基礎(chǔ)技術(shù)手冊(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)》，第6版，2010(1?.1.化6311]1巧編，胖;[1巧&50]13);《細 胞培養(yǎng)的一般技術(shù)（General Techniques of Cell Culture)》（M.A.化rrison和I.F.Rae, Cambridge Univ.Press) 及《胚胎干細胞：方法和方案（EmbiTonic Stem Cells:Methods and Protocols)》化.Turksen編,Humana Press)。其它參考文獻文本包括《創(chuàng)造高效能培養(yǎng) 物（Creating a High Performance Culture)》（A;roselli,Hu《研究發(fā)展進程 (Res .Dev .Pr.)》1996)和《生長限制化imits to Growth)》（D .H. Meadows等人，Uni verse Publ. 1974)。組織培養(yǎng)用品和試劑為技術(shù)人員眾所周知且可購得。
[0129] 應(yīng)了解，將細胞W適合于與血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物一起使用的 特定細胞系或分離細胞類型的密度置于具有培養(yǎng)物中。在某些實施例中，細胞X 103個 細胞/毫升、5 X 103個細胞/毫升、1 X 104個細胞/毫升、5 X 104個細胞/毫升、1 X 105個細胞/ 毫升、5X 105個細胞/毫升、1 X 106個細胞/毫升或5X 106個細胞/毫升培養(yǎng)。
[0130] 在各種實施例中，預(yù)期本文中所描述的培養(yǎng)基用作低溫保存培養(yǎng)基。低溫保存是 指細胞或組織儲存在小于8°C的環(huán)境中，其允許細胞長期儲存且可處于低于8°C的任何溫度 下，包括處于或低于4°(：、0°(：、-20°(：、-70°(：、-135°(：或在液氮(-196°(：)中的溫度。用含膽堿 鹽和薦糖的培養(yǎng)基低溫保存細胞的方法掲露于美國專利5,985,538中。額外低溫保存組合 物和方法掲露于美國專利7,935,478和美國專利7,112,576中。預(yù)期本文中所描述的低溫保 存培養(yǎng)基可進一步包含W下試劑中的一或多者:二甲亞諷(DMS0)、甘油、乙二醇、聚乙二醇、 丙二醇、糖(如薦糖、右旋糖、海藻糖、果膠）、蛋白質(zhì)、碳水化合物(如徑基乙基淀粉化y化oxy ethyl starch;肥S))、聚葡萄糖和/或聚賴氨酸。在各種實施例中，低溫保存培養(yǎng)基包含脂 質(zhì)體和/或果膠。
[0131] 在各種實施例中，解凍后，當置于本文中的培養(yǎng)基時，無論用作血清替代物、培養(yǎng) 基補充物或完全培養(yǎng)基，至少30%細胞仍然有活力。在各種實施例中，解凍后細胞的存活率 為 40%、50%、60%、65%、70%、75%、80% 或高于 80%。
[0132] 測量在低溫保存后存活率的額外分析包括(但不限于)干細胞菌落形成單位的測 定、細胞倍增時間和增殖的測定、MTT分析、刃天青分析W及所屬領(lǐng)域用W測量細胞存活率 和生長的其它分析。
[0133] 在各種實施例中，預(yù)期如本文所描述的某些培養(yǎng)基組合物或脂質(zhì)體組合物促進改 良的細胞培養(yǎng)，例如相比于包含不同組的組分的培養(yǎng)基或脂質(zhì)體組合物，細胞生長增加、細 胞存活率增加或重組蛋白質(zhì)表達增加。預(yù)期那些促進改良的細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基或脂質(zhì)體組 合物用于進一步實驗。
[0134] 在各種實施例中，已證明包含具有抗氧化劑的脂質(zhì)體的血清替代物培養(yǎng)基支持細 胞在培養(yǎng)物中生長增加。運個結(jié)果與展示抗氧化劑維生素E或a-生育酪抑制培養(yǎng)物中的細 胞生長的先前研究形成對比。
[0135] 試劑盒
[0136] 本發(fā)明更提供一種包含如本文所描述的培養(yǎng)基(例如血清替代物、培養(yǎng)基補充物、 完全培養(yǎng)基或低溫保存培養(yǎng)基)和使用說明書的試劑盒。在各種實施例中，培養(yǎng)基為血清替 代物、培養(yǎng)基補充物或低溫保存培養(yǎng)基，且試劑盒提供適用于產(chǎn)生完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng) 基和/或附加因子。在各種實施例中，培養(yǎng)基封裝在標簽貼附到容器的容器中，或包括于描 述組合物用于體外、體內(nèi)或離體用途的包裝中。示例性容器包括(但不限于)容器、小瓶、管、 安飯、瓶、燒瓶等。更預(yù)期容器經(jīng)調(diào)整W適于封裝液體或冷暖形式的培養(yǎng)基，例如血清替代 物、培養(yǎng)基補充物或低溫保存培養(yǎng)基。預(yù)期容器由所屬領(lǐng)域中眾所周知的材料制成，包括 (但不限于)玻璃、聚丙締、聚苯乙締W及其它塑料。在各種方面中，組合物W單位劑型封裝。 試劑盒任選地包括一種適用于組合血清替代物、培養(yǎng)基補充物或低溫保存培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培 養(yǎng)基，且或者組合培養(yǎng)基與附加生長因子的裝置。在各種方面中，試劑盒含有描述培養(yǎng)基用 于細胞培養(yǎng)或低溫保存用途的標簽和/或說明書。
[0137] 本發(fā)明血清替代物的額外方面和細節(jié)將自W下實例顯而易見，所述實例意圖為說 明性而非限制性的。
[013引實例1
[0139] 示例性脂質(zhì)體血清替代物組合物
[0140] 下文描述本文中預(yù)期的制造示例性脂質(zhì)體和血清替代物培養(yǎng)基的方法。適用于血 清替代物的組分闡明于表3和表4中。在所述表中列出的組分不打算限制，而是證明脂質(zhì)體 復(fù)合物在血清替代物中的功效。表3闡明脂質(zhì)體組合物的示例性組分。任選地，脂質(zhì)體復(fù)合 物可包含Tw旅n數(shù)(例如50微升/升）。
[0141] 表3
[0142]
[0143] 為制成脂質(zhì)體，將700微升乙醇置入1.5毫升微量離屯、管，且將250微升:PHOSAL? 53添加到乙醇。將50毫克膽固醇添加到PHOSAL見混合物且加熱到50°C直到膽固醇成溶 液。使混合物滿旋（V0RTEXGENIE皮,Scientific Industries Inc. ,Bohemia,NY)10秒，歷 經(jīng)20秒到30秒增量，直到溶液為透明班巧色(短暫滿旋且將脂質(zhì)混合物放回，進行加熱且重 復(fù)直到其成溶液）。任選地，將50微升Tween某20添加到脂質(zhì)混合物且滿旋。將乙醇胺添加到 混合物且滿旋。隨后，添加如亞麻油酸和次亞麻油酸的脂肪酸且通過滿旋混合。最終脂質(zhì)混 合物儲存在暗處4°C下。
[0144] 血清替代物也包含與上文所描述的脂質(zhì)混合物組合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基液體混合物。在 一個實施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基液體混合物包含W下組分:果膠、氯化鋼(化C1)、右旋糖、氯化鐘 化C1)、憐酸鋼(化出P〇4)、憐酸鐘化也P〇4)、砸、鋼酸鹽、巧樣酸鐵、甘油W及pluronic?；A(chǔ) 液體混合物的一個示例性實施例描述于表4中。
[0145] 表4 「01461

[0147] ~將右旋糖、果膠W及化Cl混合成粉末且緩慢添加到600毫升再蒸饋水（double distilled water;dd出0)。將氯化鐘、憐酸鋼W及憐酸鐘粉末添加到果膠-NaCl溶液且混合 直到成溶液。砸、鋼酸鹽W及巧樣酸鐵在憐酸鹽緩沖鹽水(PBS)中稀釋且混合直到成溶液。 添加甘油，且使用1N化0H使溶液pH到7.2。將Pluronic添加到溶液且體積用d地2〇增加到1 升。
[0148] 為組合脂質(zhì)和液體混合物，隨后將1毫升脂質(zhì)混合物在10毫升血清替代物基礎(chǔ)液 體中混合。經(jīng)由低粘結(jié)過濾器孔徑(例如0.22微米)過濾脂質(zhì)混合物。將10毫升基礎(chǔ)培養(yǎng)基 混合物置入100毫升無菌容器。將脂質(zhì)混合物緩慢滴入10毫升基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時例如使用滿 旋，且隨后震蕩瓶來滿旋10毫升基礎(chǔ)培養(yǎng)基且劇烈混合。任選地，使脂質(zhì)體混合物經(jīng)過微流 化床，其將有助于制造均勻尺寸化的納米脂質(zhì)體。為制得較大體積溶液，將10毫升脂質(zhì)體混 合物緩慢滴入990毫升液體混合物，同時滿旋基礎(chǔ)培養(yǎng)基W達到1升溶液。
[0149] 實例2
[0150] 脂質(zhì)體血清替代物促進細胞生長和存活
[0151] 為證明實例1中描述的血清替代物促進細胞的細胞生長和增殖的能力，在包含血 清替代物的儲備液培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離自小鼠的初生細胞或細胞系。
[0152]如先前所描述，脾細胞自預(yù)先用憐酸脂蛋白（phospholipop;rotein;F>LP)139-151 免疫接種的S化小鼠分離(McRae等人，《實驗醫(yī)學雜志(J Exp Med.)》182( 1): 75-85，1995)， 且將在D M E M + 1 0 %血清替代物中的細胞生長與在可商購無血清培養(yǎng)基AIM - V⑥ (Invitrogen，Carlsbad CA)中的生長相比較。將5X105個細胞于200微升生長培養(yǎng)基中置 于96孔板中，且在3天后測量回應(yīng)PLP139-15U0微克/毫升、0.5微克/毫升、5微克/毫升或50 微克/毫升)再刺激的脾細胞增殖程度。圖1展示在DMEM+10%血清替代物中的細胞培養(yǎng)與無 血清培養(yǎng)基相比產(chǎn)生顯著更大的增殖。也比較脾細胞在含F(xiàn)BS的DMEM或DMEM+10%血清替代 物中的生長。圖2A展示無論受刺激還是未受刺激，在DMEM+10%FBS中培養(yǎng)的細胞均增殖，刺 激指數(shù)低，而DMEM+10%血清替代物中培養(yǎng)的脾細胞的數(shù)目加倍。圖2B表示第二增殖分析， 其中脾細胞在DMEM+10 % FBS或DMEM+10 %血清替代物中培養(yǎng)。圖2B展示在DMEM/10 % FBS中 培養(yǎng)的細胞具有高于3的刺激指數(shù)，而在DMEM/10%血清替代物中培養(yǎng)的細胞具有略低于3 的刺激指數(shù)。有趣的是，圖2A和圖2B中的數(shù)據(jù)展示在DMEM/10 %血清替代物中的細胞培養(yǎng)與 在DMEM/FBS中的細胞培養(yǎng)相比提供一致的增殖結(jié)果，即使在未受刺激細胞群體中其也可產(chǎn) 生非特定增殖。相比于在FBS中培養(yǎng)，本文中所描述的血清替代物提供更一致、可再生的細 胞培養(yǎng)條件，其可具有細胞刺激特性且可引起具有內(nèi)部批間差異的細胞刺激。
[0153] 除了原生細胞培養(yǎng)外，測定血清替代物對細胞系生長的影響。單獨在漢姆氏(F12) 或含10 %血清替代物的漢姆氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國倉鼠卵巢(化inese hams ter ovary; C冊） 細胞(5 XIO5個，在96孔板中），且測量細胞生長和存活率。在漢姆氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)的C冊細 胞數(shù)目在4天內(nèi)加倍，而在漢姆氏/10%血清替代物中培養(yǎng)的CH0細胞數(shù)目在4天內(nèi)增加大約 8倍。在4天內(nèi)，細胞在任一培養(yǎng)條件中的存活率為大約90 %。
[0154] 也已證明相比于具有缺乏抗氧化劑的脂質(zhì)體的血清替代物，包括包含a生育酪的 脂質(zhì)體的血清替代物培養(yǎng)基改良細胞生長。運個結(jié)果與a生育酪在培養(yǎng)中抑制細胞生長的 報導形成對比。參見例如Sylvester等人，"維生素巧巧制正常乳房上皮細胞生長與蛋白激酶 C(曰）活性減小相關(guān)（Vitamin E inhibition of normal mammary epithelial cell growth is associated with a reduction in protein kinase C(alpha)activation)'' 《細胞增殖(Cell Prolif.)》34(6):347-57,2001或化uzil等人/'維生素E類似物作為細胞 調(diào)亡的誘導劑：其潛在抗腫瘤作用的影響（Vitamin E analogues as inducers of apoptosis: implications for their potential antineoplastic role)''《氧化還原報告 (Redox R巧.）》6(3):143-51,2001。
[0155] 運些結(jié)果證明包含本文中所描述的脂質(zhì)體的血清替代物有效地提供體外細胞系 生長。
[0156] 實例3
[0157] 相比于血清，脂質(zhì)體血清替代物減少細胞死亡和實驗內(nèi)變化
[0158] 也使用經(jīng)分離的CD4+T細胞，檢驗本文中所描述的血清替代物在培養(yǎng)期間減緩或 減少細胞死亡的能力。
[0159] 使用磁珠分離度方案（參見例如Miltenyi Biotec Inc. ,Auburn,CA的MACS及分 離或Life Technologies,Carlsbad,CA的DYNABEADS?)，自小鼠脾分離CD4+T細胞。比較 細胞在DMEM+10%血清替代物中的生長與在包含10%FBS的DMHM中的生長。包含血清替代物 的培養(yǎng)基也補充有各種生長因子W補償在FBS中發(fā)現(xiàn)的那些額外生長因子(參見例如美國 專利公開案20130130373)。將5 X 105個CD4+T細胞于200微升生長培養(yǎng)基中置于96孔板中，且 經(jīng)由并入WST-1歷經(jīng)3天測量回應(yīng)于抗-CD3/抗-CD28刺激的T細胞增殖程度（參見例如 Francoeur等人，《生物化學（81〇油61111。日）》3:19-25，1996)。胖51'-1分析使用四挫鐵鹽胖51'-1 斷裂成可溶性甲染料來測量細胞增殖。隨著細胞數(shù)目增加，四挫鐵還原酶的含量上升，使 WST-1到可檢測染料的轉(zhuǎn)化增加。在440納米處，通過吸光度測量染料的量。
[0160] 圖3展示受刺激CD4+T細胞的增殖比在培養(yǎng)基加FBS中培養(yǎng)的細胞中觀察到的增殖 更好或至少相當。八個復(fù)制培養(yǎng)物用于各刺激組W可W計算實驗內(nèi)變量。差異確定為增殖 中觀察到的標準偏差的平方。圖3B展示與在FBS中培養(yǎng)相比，血清替代物與生長因子中的細 胞培養(yǎng)產(chǎn)生最低實驗內(nèi)差異。通過乳酸脫氨酶（lactate dehy化ogenase;LDH)細胞調(diào)亡分 析，也測量歷經(jīng)3天培養(yǎng)過程的細胞死亡（參見例如Wolterbeek H.T.和van deer Meer J.G.M.《分析藥物發(fā)展技術(shù)(Assay Drug Dev Technol)》3:675-682,2005)。分析測量LDH在 由細胞膜斷裂產(chǎn)生的上清液中的含量。經(jīng)由一系列反應(yīng)，LDH引起可檢測可溶性染料產(chǎn)生， 通過490納米到520納米的吸光度來定量。更高LDH含量表示細胞調(diào)亡增加。圖4A展示與用 FBS培養(yǎng)相比，培養(yǎng)基加血清替代物和生長因子中的培養(yǎng)減少在培養(yǎng)期間發(fā)生的細胞調(diào)亡 程度。圖4B展示與用含F(xiàn)BS培養(yǎng)基培養(yǎng)的實驗內(nèi)差異相比，在運個實驗中，在血清替代物中 培養(yǎng)的細胞中的實驗內(nèi)差異也為最低。
[0161] 運些結(jié)果展示本文中所描述的血清替代物，W及包含脂質(zhì)體的完全培養(yǎng)基或培養(yǎng) 基補充物提供類似于FBS中生長的細胞培養(yǎng)環(huán)境，但缺乏在用FBS培養(yǎng)中所見的缺點，如批 間差異和實驗內(nèi)差異。
[0162] 預(yù)期所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員想到如上文說明性實例中闡明的本發(fā)明的大量修改和 變化。因此，僅如在所附權(quán)利要求書中呈現(xiàn)的限制應(yīng)施于本發(fā)明。
【主權(quán)項】
1. 一種用于懸浮或貼壁培養(yǎng)中細胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混 合物和 (a) 包含膽固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的量使得膽固醇在細胞 懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度為1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在細胞懸浮液 或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度為100毫克/升到1000毫克/升;或 (b) 果膠;或 (a)和(b)〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述脂質(zhì)體包含一或多種由次亞麻油酸、亞麻油 酸、肉豆蔻酸以及油酸所組成的群組中選出的脂肪酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其中所述脂質(zhì)體進一步包含乙醇胺和聚山梨醇 酯。4. 根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項所述的培養(yǎng)基，其中果膠在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中 的最終濃度為25毫克/升到500毫克/升。5. 根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項所述的培養(yǎng)基，其中所述基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物包 含一或多種有機鹽、無機鹽、緩沖劑、鐵源或鐵轉(zhuǎn)運體、甘油、氨基酸、維生素、糖、抗氧化劑 以及微量元素。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其中甘油在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度 為2微升/升到0.5毫升/升。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其中所述鐵源或鐵轉(zhuǎn)運體是由以下各者所構(gòu)成的群 組中選出：轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、檸檬酸 鐵銨、草酸鐵銨、反丁烯二酸鐵銨、蘋果酸鐵銨以及丁二酸鐵銨。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含一或多種由以下各者所構(gòu)成的 群組中選出的氨基酸:甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、鹽 酸L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨 酸、L-甲硫氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨 酸以及L-纈氨酸。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含一或多種由以下各者所構(gòu)成的 群組中選出的鹽:磷酸鉀、氯化鈣(無水）、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯化鎂(無水）、硫酸鎂 (無水）、氯化鉀、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化錫、硫酸鋅以及碳酸氫鈉。10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含一或多種由以下各者所構(gòu)成的 群組中選出的維生素：生物素、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、煙堿酰胺、鹽酸吡哆醇、雙黃素 (bibof lavin)、鹽酸硫胺、維生素 B12以及異肌醇。11. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含一或多種由以下各者所構(gòu)成的 群組中選出的微量元素:砸、鉬酸鹽、鉻、鈷、鎳、鋅、銅、錳、鋇、鎵、鋰、錫、鈦、溴、碘、釩、鍺、 鉬、硅、鐵、氟、銀、銣、鋯、鎘以及鋁。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的培養(yǎng)基，其中所述微量元素為硒，且硒在細胞懸浮液或貼壁 培養(yǎng)物中的最終濃度為〇. 005毫克/升到0.05毫克/升。13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基為血清替代物、完全培 養(yǎng)基、培養(yǎng)基補充物或低溫保存培養(yǎng)基。14. 一種血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其包含脂質(zhì)體和基礎(chǔ)生理緩沖劑液 體混合物，其中所述脂質(zhì)體包含卵磷脂、乙醇胺、次亞麻油酸、亞麻油酸、膽固醇以及聚山梨 醇酯，且所述基礎(chǔ)液體混合物包含至少一種無機鹽、至少一種糖、甘油以及至少一種微量元 素。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，進一步包含至少 一種非離子表面活性劑和至少一種鐵源。16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其中所述脂質(zhì)體 的量使得膽固醇在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度為1毫克/升到20毫克/升，且其 中卵磷脂在細胞懸浮液或貼壁培養(yǎng)物中的最終濃度為100毫克/升到1000毫克/升。17. 根據(jù)權(quán)利要求14到16中任一項所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其 中所述基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物包含一或多種由以下各者所構(gòu)成的群組中選出的鹽:磷 酸鉀、氯化鈣(無水）、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯化鎂(無水）、硫酸鎂(無水）、氯化鉀、碳酸 氫鈉、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鋅以及氯化錫。18. 根據(jù)權(quán)利要求14到17中任一項所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其 中所述液體混合物包含氯化鈉、氯化鉀、磷酸鈉以及磷酸鉀。19. 根據(jù)權(quán)利要求14到18中任一項所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其 中所述液體混合物包含一或多種由以下各者所構(gòu)成的群組中選出的微量元素:硒、鉬酸鹽、 鉻、鈷、鎳、鋅、銅、錳、鋇、鎵、鋰、錫以及鈦。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其中所述液體混 合物包含硒和鉬酸鹽。21. 根據(jù)權(quán)利要求13到19中任一項所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其 中所述液體混合物包含一或多種由以下各者所構(gòu)成的群組中選出的鐵源或鐵轉(zhuǎn)運體:轉(zhuǎn)鐵 蛋白、乳鐵蛋白、硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、檸檬酸鐵、檸檬酸鐵銨、草酸鐵銨、 反丁烯二酸鐵銨、蘋果酸鐵銨以及丁二酸鐵銨。22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其中所述鐵源為 梓檬酸鐵。23. 根據(jù)權(quán)利要求14到22中任一項所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其 中所述液體混合物包含一或多種由以下各者所構(gòu)成的群組中選出的非離子表面活性劑： Pluronic_68、F68 Pastille、Pluronic_128、去水山梨醇、聚山梨醇酯以及嵌段共聚物。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其中所述非離子 表面活性劑為Pluronic-68〇25. 根據(jù)權(quán)利要求14到24中任一項所述的血清替代物，其中膽固醇在所述血清替代物 中的最終濃度為約10毫克/升到200毫克/升，且卵磷脂在所述血清替代物中的最終濃度為 約1000毫克/升到10克/升。26. 根據(jù)權(quán)利要求14到24中任一項所述的完全培養(yǎng)基，其中膽固醇在所述完全培養(yǎng)基 中的濃度為約1毫克/升到20毫克/升，且卵磷脂在所述完全培養(yǎng)基中的濃度為約100毫克/ 升到1000暈克/升。27. 根據(jù)權(quán)利要求14到24中任一項所述的培養(yǎng)基補充物，其中膽固醇在所述培養(yǎng)基補 充物中的濃度為約100暈克/升到2000_克/升，且卵磷脂在所述培養(yǎng)基補充物中的濃度為 約10克/升到100克/升。28. 根據(jù)權(quán)利要求14到24中任一項所述的血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其 進一步包含果膠。29. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的培養(yǎng)基、血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充 物，其中所述脂質(zhì)體為納米粒子。30. 根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的培養(yǎng)基、血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物，其 中所述納米粒子具有在約50納米到約500納米范圍內(nèi)的平均直徑。31. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的培養(yǎng)基、血清替代物、完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充 物，其不含動物性成分。32. -種細胞低溫保存培養(yǎng)基，其包含脂質(zhì)體和基礎(chǔ)生理緩沖劑液體混合物，其中膽固 醇在所述低溫保存培養(yǎng)基中的最終濃度為約10毫克/升到200毫克/升，且卵磷脂在所述低 溫保存培養(yǎng)基中的最終濃度為約1000毫克/升到10克/升。33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的低溫保存培養(yǎng)基，其進一步包含果膠。34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的低溫保存培養(yǎng)基，其中果膠在細胞懸浮液中的最終濃度為 約50暈克/升到5克/升。35. 根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的低溫保存培養(yǎng)基，其進一步包含甘油。36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的低溫保存培養(yǎng)基，其中甘油在細胞懸浮液中的最終濃度為 約0.02毫升/升到5毫升/升。37. 根據(jù)權(quán)利要求32到36中任一項所述的低溫保存培養(yǎng)基，其進一步包含二甲亞砜 (dimethyl sulfoxide;DMSO)，其中所述DMSO的濃度小于4%。38. 根據(jù)權(quán)利要求32到37中任一項所述的低溫保存培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基進一步包 含聚賴氨酸。39. -種培養(yǎng)細胞的方法，其包含在含有如前述權(quán)利要求中任一項所述的血清替代物、 完全培養(yǎng)基或培養(yǎng)基補充物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述細胞是由以下所構(gòu)成的群組中選出：多能干 細胞、胚胎干細胞、骨髓基質(zhì)細胞、造血祖細胞、淋巴干細胞、骨髓干細胞、T細胞、B細胞、巨 噬細胞、肝細胞、胰腺細胞、癌瘤細胞以及細胞系。41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細胞系是由以下各組所構(gòu)成的群組中選出： CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep 62 51(-此？、]\^1'、了1?1、]\0^5、卩54、1'細胞系、8細胞系、3了3、1?預(yù)、厶549、？(：12、 K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌細胞系。42. -種低溫保存細胞的方法，其包含將細胞懸浮于如前述權(quán)利要求中任一項所述的 低溫保存培養(yǎng)基中，且將所述細胞置于小于8°C的環(huán)境中。43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其進一步包含使所述細胞解凍且將其置于如前述權(quán) 利要求中任一項所述的培養(yǎng)基中。44. 根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的方法，其中至少30 %所述細胞在解凍后仍然有活力。45. 根據(jù)權(quán)利要求42到44中任一項所述的方法，其中所述細胞是由以下各者所構(gòu)成的 群組中選出：多能干細胞、胚胎干細胞、骨髓基質(zhì)細胞、造血祖細胞、淋巴干細胞、骨髓干細 胞、T細胞、B細胞、巨噬細胞、肝細胞、胰腺細胞、癌瘤細胞以及細胞系。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述細胞系是由以下各者所構(gòu)成的群組中選出： CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep 62 51(-此？、]\^1'、了1?1、]\0^5、卩54、1'細胞系、8細胞系、3了3、1?預(yù)、厶549、？(：12、 K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌細胞系。
【文檔編號】C12N5/00GK106062205SQ201480075947
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年12月19日
【發(fā)明人】A.埃爾霍菲, A.韋伯
【申請人】基本藥品有限責任公司