具有針對T細(xì)胞受體beta恒定區(qū)的抗原結(jié)合域的嵌合抗原受體(CAR)的制作方法
【專利摘要】本公開涉及嵌合抗原受體(CAR)，其包含選擇性結(jié)合TCR beta恒定區(qū)1(TRBC1)或TRBC2的抗原結(jié)合域；細(xì)胞；包含此類CAR的此類T細(xì)胞；以及此類細(xì)胞用于受試者中T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的治療的用途。
【專利說明】具有針對T細(xì)胞受體beta恒定區(qū)的抗原結(jié)合域的嵌合抗原受 體(CAR) 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及在T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的治療中有用的細(xì)胞和試劑。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 淋巴樣惡性腫瘤在很大程度上可以分為來源于T細(xì)胞或B細(xì)胞的那些。T細(xì)胞惡性 腫瘤是臨床上和生物學(xué)上異質(zhì)性的病癥組，總共包括10-20%的非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤 和20 %的急性白血病。最普遍的經(jīng)鑒定的病理亞型是外周T細(xì)胞淋巴瘤，非特指型 (peripheral T-cell lymphoma，not otherwise specified)(PTCL_N0S);血管免疫母細(xì)胞 1'細(xì)胞淋巴瘤（&叫;[0-;[1]11111111〇131&81:;[(3 1'-0611171]^11〇1]1&，4111^)和間變性大細(xì)胞淋巴瘤 (anaplastic large cell lymphoma,ALCL)。在所有急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)中，約 20 %是T細(xì)胞表型的。
[0004] 與例如B細(xì)胞惡性腫瘤相比，這些狀況通常表現(xiàn)為侵襲性的，其中估算的5年存活 率為僅30%。在T細(xì)胞淋巴瘤的情況下，它們與高比例的呈現(xiàn)播散性疾?。╠isseminated disease)的患者，不利的國際預(yù)后指標(biāo)（International Prognostic Indicator)(IPI)評 分和結(jié)外(extra-nodal)疾病的盛行相關(guān)。單獨化療通常不是有效的，且少于30%的患者使 用目前的治療得到治愈。
[0005] 此外，不像B細(xì)胞惡性腫瘤，其中免疫療法例如抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗 (rituximab)具有顯著改善的結(jié)果，目前不存在同等有效的，最低限度毒性的免疫療法可用 于T細(xì)胞惡性腫瘤的治療。開發(fā)用于T細(xì)胞病癥的免疫療法的重大困難是克隆性和正常T細(xì) 胞的標(biāo)志物表達(dá)的相當(dāng)多的重疊，其中沒有單個抗原明確地能夠鑒定克隆性(惡性)細(xì)胞。
[0006] 當(dāng)靶向全B細(xì)胞抗原以治療B細(xì)胞惡性腫瘤時存在相同的問題。然而，在這種情況 下，對B細(xì)胞區(qū)室的伴隨的耗竭導(dǎo)致相對輕微的免疫抑制，這是易于被大多數(shù)患者忍受的。 此外，在導(dǎo)致特別是正常B細(xì)胞區(qū)室的長期耗竭的療法中，其喪失可以在很大程度上通過施 用匯集的免疫球蛋白來消除。當(dāng)靶向T細(xì)胞惡性腫瘤時，情況完全不同。這里，T細(xì)胞區(qū)室的 伴隨耗竭導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制和嚴(yán)重的毒性。此外，不存在令人滿意的方法來減輕T細(xì)胞區(qū) 室的喪失。
[0007] 毒性部分通過治療性單克隆抗體阿侖單抗(Alemtuzumab)的臨床效果所揭示。該 試劑裂解表達(dá)CD52的細(xì)胞并在T細(xì)胞惡性腫瘤中具有一些效力。該試劑的效用被深切的細(xì) 胞免疫缺陷大大限制，很大程度上由于T細(xì)胞的耗竭，伴隨著升高的感染風(fēng)險。
[0008] 因此，對于不與以上缺點相關(guān)的，用于T細(xì)胞惡性腫瘤的靶向治療的新方法存在需 要。
[0009] 附圖簡述
[0010] 圖1:αβτ細(xì)胞受體/CD3復(fù)合物的示意圖。T細(xì)胞受體由6種不同的蛋白鏈形成，其必 須在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝以表達(dá)在細(xì)胞表面上。CD3復(fù)合物的四種蛋白（⑶3ζ，CD3 γ，⑶3ε和⑶3δ) 覆蓋(sheath)T細(xì)胞受體(TCR)。該TCR給所述復(fù)合物注入對特定抗原的特異性并由兩條鏈 組成:TCRa和TCRi3。每條TCR鏈具有膜遠(yuǎn)端的可變組分和膜近端的恒定組分。幾乎所有的T細(xì) 胞淋巴瘤和許多T細(xì)胞白血病表達(dá)TCR/⑶3復(fù)合物。
[0011] 圖2:T細(xì)胞受體重排期間T細(xì)胞受體β-恒定區(qū)（TRBC)-l和TRBC-2的分隔 (segregation)。每條TCR beta鏈從特定beta可變(V)，多樣性(D)，連接(J)和恒定(TRBC)區(qū) 域的基因組重組形成。人基因組含有兩個非常相似且功能上等同的TRBC基因座，稱作TRBC1 和TRBC2。在TCR基因重排期間，J-區(qū)與TRBC1或TRBC2重組。該重排是永久性的。T細(xì)胞在它們 的表面上表達(dá)單個TCR的許多拷貝，因此每個T細(xì)胞將表達(dá)TCR，其β-鏈恒定區(qū)由TRBC1或 TRBV2編碼。
[0012] 圖3:人TRBC1和TRBC2在氨基酸水平的比對。由TRBC1和TRBC2編碼的TCR0恒定鏈僅 通過4個氨基酸差異而不同：TRBC位置3處的K/N;TRBC位置4處的N/K; TRBC位置36處的F/Y; TRBC位置135處的V/E。
[0013]圖4:明確證明J0VI-1抗體結(jié)合TRBC 1而不結(jié)合TRBC2。細(xì)胞的遺傳工程用于明確證 明J0VI-1單克隆抗體識別TCRi3恒定鏈的TRBC1變體。生成了三-順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒基因盒 (tri-cistronic retroviral cassette)。這編碼人TCR的TCRa和TCRP鏈兩者，所述人TCR識 別次要組織相容性抗原HA1，以及截短的人⑶34作為方便的標(biāo)志物基因。天然地，HA1TCR是 TRBC2。生成了第二逆轉(zhuǎn)錄病毒基因盒，除了 TCRi3恒定區(qū)中的4個殘基以外其與第一個相同， 所述TCRi3恒定區(qū)中的4個殘基(其區(qū)分TRBC1與TRBC2)改變?yōu)橛蒚RBC1編碼的那些。使用任一 載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞，其的TCRa和TCRi3鏈兩者都被敲除。這些細(xì)胞使用全-TCR/CD3抗體 或單克隆J0VI-1與針對CD34的抗體聯(lián)合染色，并在流式細(xì)胞儀中分析。上排揭示了使用全-TCR/⑶3抗體對⑶34 (轉(zhuǎn)導(dǎo)的標(biāo)志物）的染色，下排揭示了使用J0VI -1對⑶34的染色。轉(zhuǎn)導(dǎo)的 細(xì)胞表現(xiàn)出相似的TCR/CD3染色，但僅TRBCl+ve細(xì)胞使用J0VI-1染色。因此J0VI-1對TRBC1 是特異性的且進(jìn)一步使用抗體區(qū)分TRBC1和2的TCR是可能的。
[0014] 圖5:J0VI-lmAb通過識別TRBC的殘基3和4區(qū)分TRBC1與TRBC2。為了精確地確定 J0VI-1如何區(qū)分TRBC1與TRBC2,突變上文詳細(xì)描述的HA1TCR TRBC2構(gòu)建體以制備兩種 TRBC1/2雜交體。生成了另外的變體使得僅TCRi3恒定區(qū)的殘基3和4從TRBC2的那些改變?yōu)?TRBC1中存在的那些。制成了進(jìn)一步的變體，其中僅殘基36從TRBC2中存在的改變?yōu)門RBC1。 使用這些新的構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR敲除的Jurkat T細(xì)胞。圖4中描述的初始的TRBC2和TRBC1轉(zhuǎn)導(dǎo) 的Jurkat用作對照。Jurkat T細(xì)胞使用J0VI-1染色并使用流式細(xì)胞儀分析。將J0VI-1的染 色重疊在非轉(zhuǎn)導(dǎo)的TCR敲除的Jurkat T細(xì)胞的染色上。J0VI-1染色表達(dá)TRBC1TCR而不是 TRBC2TCR的JurkaUjOVI-l染色其中僅TRBC殘基3和4是TRBC1的那些殘基的TRBC1/2雜交 體。J0VI-1不染色其中僅TRBC殘基36是TRBC1的殘基的Jurkat T細(xì)胞。
[0015]圖6:TRBC1的正常供體T細(xì)胞表達(dá)的例子。正常供體外周血單核細(xì)胞使用針對⑶3、 CD4、CD8的抗體和J0VI-1染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。CD4+和⑶8+T細(xì)胞群體示于上組。對 該群體的每一個設(shè)門和前向散射(forward scatter)對J0VI-1染色分別示于Y和X軸。這些 數(shù)據(jù)表明⑶8+和⑶4+區(qū)室兩者都含有TRBCl+ve和-ve的細(xì)胞。這是來自一個供體的代表性 數(shù)據(jù)。
[0016]圖7:幾個正常供體中的TRBC1+T細(xì)胞。對十個正常供體采血且外周血單核細(xì)胞如 上文圖4中所述的染色。CD4和⑶8區(qū)室兩者中TRBC 1T細(xì)胞的比例的匯總數(shù)據(jù)連同中位數(shù)和 范圍一起示于柱狀圖。所有的供體具有TRBC1+和TRBC1-區(qū)室。TRBC1+細(xì)胞的中位數(shù)％ = 36% 〇
[0017]圖8: T細(xì)胞惡性腫瘤衍生的細(xì)胞系使用J0VI-1染色。已經(jīng)從T細(xì)胞惡性腫瘤衍生了 幾個細(xì)胞系。這些細(xì)胞系中的許多仍然表達(dá)TCR。我們選擇了 Jurkats(T細(xì)胞白血病細(xì)胞 系），HPB-ALL(另一種T細(xì)胞白血病細(xì)胞系）和HD-Mar-2(T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系）用于研究。通 過使用全-TCR/CD3抗體染色這些細(xì)胞，我們能夠證明所有的三種表達(dá)TCR(左組，染色重疊 在同種型對照染色上）。接著，通過使用J0VI-1染色，我們能夠確認(rèn)這些T細(xì)胞系是TRBC1陰 性或陽性的。僅 Jurkats 細(xì)胞(TRBC1 + )而不是 HPB-ALL 或 HD-Mar-2(TRBC2+)被 J0VI-1 染色， 支持TRBC1或2的排他性表達(dá)。
[0018] 圖9:使用JOVI-lmAb對TRBC-1T細(xì)胞的選擇性殺傷。將野生型JurkatT細(xì)胞(CD34-， TRBC1 + )與使用和CD34標(biāo)志物基因共表達(dá)的TRBC2轉(zhuǎn)導(dǎo)的ΤΟ?αβ敲除Jurkat T細(xì)胞（CD34+ TRBC2+)混合。將這些細(xì)胞與單獨J0VI-1孵育或與J0VI-1和補(bǔ)體孵育1小時。洗滌細(xì)胞并對 CD34，膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。以下示出的是活的群體中CD34表 達(dá)，如通過膜聯(lián)蛋白-V陰性和7-AAD暗群體所確定的。（a)單獨J0VI-l;(b)J0VI_l和補(bǔ)體。觀 察到了對TRBC1T細(xì)胞(⑶34-)的選擇性殺傷。
[0019]圖10:多克隆埃巴病毒(EBV)特異性T細(xì)胞可以分為兩個大約相等的TRBC1/2群體。 使用良好建立的方法，發(fā)明人選擇性擴(kuò)增了來自正常供體的外周血的EBV特異性T細(xì)胞。隨 后的品系具有高度選擇性針對自體EBV感染的B細(xì)胞(auto LCLs)，和針對異體EBV感染的T 細(xì)胞(alio LCLs)無活性，和無非特異性NK活性(如通過針對K562細(xì)胞測試所測量的）。此類 品系是供體的EBV免疫力的代表。（b)當(dāng)使用J0VI-1染色時，這些T細(xì)胞對于TRBC1和TRBC2大 約相等分型。
[0020] 圖11J0VI-1VH和VL的注解序列。高變區(qū)加下劃線和加粗。
[0021]圖12:證明外周T細(xì)胞淋巴瘤是TRBC限制的，但正常的循環(huán)T細(xì)胞不是。從具有循環(huán) T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的患者抽取了外周血T細(xì)胞。分離了外周血單核細(xì)胞并使用包括⑶5、TCR 和J0VI-1的抗體組染色。通過⑶5表達(dá)強(qiáng)度，可以在流動上區(qū)分正常和惡性T細(xì)胞。CD5明亮 (正常T細(xì)胞)具有大約相等的TRBC1和2群體。CD5中等和暗淡群體(腫瘤)都是TRBC2陽性的。 如果該患者具有TRBC2導(dǎo)向的療法，那么該淋巴瘤將被根除，而他們的T細(xì)胞的大約一半將 被放過。
[0022]圖13:證明來源于JOVI -1的VH和VL是正確的且它們能夠折疊為單鏈可變片段。原 始的雜交瘤上清，重組J0VI-1抗體和從轉(zhuǎn)導(dǎo)的293T細(xì)胞生成的scFv-Fc用于染色一些細(xì)胞 系：Jurkat TCR敲除，野生型Jurkats，使用TRBC1TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat TCR敲除，所述TRBC1TCR 在共表達(dá)eBFP2的載體中；使用TRBD2TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat TCR敲除，所述TRBD2TCR在共表達(dá) eBFP2的載體中。通過流式細(xì)胞術(shù)分析染色。重組抗體和scFv兩者都結(jié)合表達(dá)TRBC2的細(xì)胞。 [0023]圖14:不同形式的基于J0VI-1的CARXARs通常包含結(jié)合域，間隔區(qū)，跨膜域和胞內(nèi) 信號傳導(dǎo)域。在本研究中生成了 CAR，其包含J0VI-1;來源于⑶8莖部，人IgGl的鉸鏈-CH2-CH3域(具有去除FcR結(jié)合的突變)的間隔區(qū)；或來源于人IgGl的間隔區(qū)。
[0024]圖15:基于J0VI-1的CAR的功能。使用上述不同的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)正常供體外周血T細(xì)胞。 也使用CD19特異性CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞作為對照。接著，這些T細(xì)胞使用以下靶細(xì)胞攻擊： Jurkats-TCR敲除和Jurkats野生型以及Raji細(xì)胞(CD19+B細(xì)胞淋巴瘤系）。示出了針對不同 靶標(biāo)的效應(yīng)物的鉻釋放數(shù)據(jù)。J0VI-1CAR T細(xì)胞殺傷Jurkats但不殺傷Raji細(xì)胞或具有TCR 敲除的Jurkats。
[0025] 圖16: J0VI-1CAR T細(xì)胞培養(yǎng)物的自凈化（Self-Purging)。由于T細(xì)胞包含大約相 等數(shù)量的TRBC1或TRBC2陽性的Τ細(xì)胞，可能的是在引入CAR后，培養(yǎng)物的一定量的"相殘 (fratricide)"或自凈化可以發(fā)生。證明了情況就是這樣。在該例子中，CAR T細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后 染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。比較假轉(zhuǎn)導(dǎo)的與轉(zhuǎn)導(dǎo)的，可以觀察到該T細(xì)胞群體失去了 TRBC1陽性T細(xì)胞。
[0026] 圖17:調(diào)查T細(xì)胞大顆粒白血病(T-LGL)的克隆性-患者A
[0027] 圖18:調(diào)查T細(xì)胞大顆粒白血病(T-LGL)的克隆性-患者B
[0028] 圖19:調(diào)查T細(xì)胞大顆粒白血病(T-LGL)的克隆性-患者C
[0029] 圖20:調(diào)查多克隆T細(xì)胞淋巴瘤(PCTL)的克隆性-患者D
[0030]圖21 :TRBC肽噬菌體選擇策略。A)在直接或間接固定化到表面上的TRBC肽上的兩 輪固相噬菌體展示選擇。B)在生物素化的TRBC肽上的三輪溶液相噬菌體展示選擇。
[0031]圖22:來自TRBC肽噬菌體展示選擇的多克隆噬菌體輸出的分析。使用多克隆噬菌 體的TRF結(jié)合測定，所述多克隆噬菌體來自在直接固定化為BSA/0A綴合物的TRBC肽上進(jìn)行 的固相選擇(A)，在固定化于鏈霉親合素/中性親合素(neutravidin)的TRBC肽上的固相選 擇(B)和來自溶液相選擇(C)。
[0032]圖23:pSANG10-3F載體的示意圖。將編碼單鏈抗體（scFv)的基因克隆在T7啟動子 和pelB引導(dǎo)序列（用于周質(zhì)轉(zhuǎn)位）下游的Ncol/Notl。該載體還含有C末端六組氨酸標(biāo)簽 (Hi s6)用于純化和三FLAG標(biāo)簽檢測。
[0033] 圖24:TRBC1和TRBC2特異性結(jié)合物的初級篩選。來自TRBCl(A)和TRBC2(B)選擇的 94個scFvs對生物素化的TRBC1和TRBC2(0.5μg/ml)的結(jié)合，所述TRBC1和TRBC2固定化于中 性親合素（l〇μg/ml)包被的NuncMaxisorp?96孔板上。使用綴合有銪的抗FLAG抗體檢測scFv 對固定化的肽的結(jié)合。
[0034] 圖25:來自使用TRBC1肽免疫的兔#13174的多克隆抗體血清針對TRBC1和TRBC2肽 的結(jié)合。(A)第三次免疫后(B)第三次免疫和TRBC1特異性抗體的純化后。
[0035] 圖26:來自使用TRBC2肽免疫的兔#17363的多克隆抗體血清針對TRBC1和TRBC2肽 的結(jié)合。(A)第三次免疫后(B)第三次免疫和TRBC2特異性抗體的純化后。
[0036] 圖27:來自使用TRBC2肽免疫的兔#17364的多克隆抗體血清針對TRBC1和TRBC2肽 的結(jié)合。(A)第三次免疫后(B)第三次免疫和TRBC2特異性抗體的純化后。
[0037] 發(fā)明簡述
[0038]本發(fā)明人已經(jīng)設(shè)計了方法，其中在受試者中耗竭惡性T細(xì)胞而不影響健康T細(xì)胞的 顯著比例是可能的。具體地，他們已經(jīng)開發(fā)了 TRBC1和TRBC2特異性嵌合抗原受體(CAR)，用 于T細(xì)胞惡性腫瘤的治療中的用途。
[0039]因此，在第一個方面中，本發(fā)明提供嵌合抗原受體(CAR)，其包含選擇性結(jié)合TCR beta恒定區(qū)1 (TRBC1)或TRBC2的抗原結(jié)合域。
[0040]在本發(fā)明的第一個方面的第一個實施方案中，提供選擇性結(jié)合TRBC1的CAR。在這 一實施方案中，CAR可以包含抗原結(jié)合域，其具有包含以下互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的可變重鏈 (乂!〇和可變輕鏈(￥〇:
[0041] VH CDR1:SEQ ID Νο·7;
[0042] VH CDR2:SEQ ID Νο·8;
[0043] VH CDR3:SEQ ID Νο·9;
[0044] VL CDR1:SEQ ID No.10；
[0045] VLCDR2:SEQIDNo.lUP
[0046] VL CDR3:SEQ ID No.12
[0047] CAR可以包含抗原結(jié)合域，其包含具有如SEQ ID No. 1所示序列的可變重鏈(VH)和 具有如SEQ ID No.2所示序列的可變輕鏈(VL)。
[0048] CAR可以包含抗原結(jié)合域，其包含具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的scFv。 [0049] CAR可以包含選自SEQ ID No.33、34和35的氨基酸序列。
[0050] CAR可以包含來自表1中列出的那些的VH CDR3和/或VL CDR3。
[0051] CAR可以包含抗體或其功能片段，其包含：
[0052] (1)重鏈 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR3;
[0053 ] (i i)重鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3;或
[0054] (iii)可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL);來自如SEQ ID如.13至22所示的8〇卩￥8 的一個。
[0055]在本發(fā)明的第一個方面的第二個實施方案中，提供選擇性結(jié)合TRBC2的CAR。
[0056] 與此實施方案相關(guān)，CAR可以包含來自表2中列出的那些的VH⑶R3和/或VL⑶R3。
[0057] CAR可以包含抗體或其功能片段，其包含：
[0058]("重鏈⑶尺和/或所述輕鏈⑶!^;
[0059 ] (i i)重鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3;或
[0060] (iii)可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL);來自如SEQ ID No.23至32所示的scFvs 的一個。
[0061] 在第二個方面，本發(fā)明提供編碼根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的CAR的核酸序列。
[0062] 在第三個方面，提供載體，其包含根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的核酸序列。
[0063] 在第四個方面，提供細(xì)胞，其包含根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的CAR。細(xì)胞可以是細(xì) 胞溶解性免疫細(xì)胞，例如T細(xì)胞或天然殺傷(NK)細(xì)胞。
[0064] 在第五個方面，提供用于制備根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞的方法，其包括使 用根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的核酸序列或根據(jù)本發(fā)明的第三個方面的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染細(xì) 胞的步驟。
[0065] 在第六個方面，提供根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞，用于在用于治療受試者中T 細(xì)胞淋巴瘤或白血病的方法中的用途，所述方法包括以下步驟
[0066] 將包含TCRB1或TCRB2選擇性CAR的細(xì)胞施用至受試者，以引起惡性T細(xì)胞連同與惡 性T細(xì)胞表達(dá)相同TRBC的正常T細(xì)胞的選擇性耗竭，而不引起表達(dá)惡性T細(xì)胞不表達(dá)的TRBC 的正常T細(xì)胞的耗竭。
[0067] 方法還可以包括調(diào)查來自受試者的惡性T細(xì)胞的TCR beta恒定區(qū)（TCRB)的步驟， 以確定其是否表達(dá)TRBC1或TRBC2。
[0068]還提供用于治療受試者中T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括向所述受試者施 用TCRB1或TCRB2選擇性試劑的步驟，其中所述試劑導(dǎo)致惡性T細(xì)胞連同與惡性T細(xì)胞表達(dá)相 同TRBC的正常T細(xì)胞的選擇性耗竭，而不引起表達(dá)惡性T細(xì)胞不表達(dá)的TRBC的正常T細(xì)胞的 耗竭。
[0069] 在本發(fā)明的這一方面的第一個實施方案中，試劑是TCRB1選擇性試劑。在本發(fā)明的 這一方面的第二個實施方案中，試劑是TRBC2選擇性試劑。
[0070] 方法還可以包括在施用步驟前調(diào)查惡性T細(xì)胞的TCR beta恒定區(qū)（TRBC)，以確定 其是否表達(dá)TRBC1或TRBC2的步驟。
[0071]試劑可以是耗竭性(depleting)單克隆抗體或其片段。試劑可以是綴合的抗體，其 可以包含化療實體。
[0072]試劑可以是雙特異性T細(xì)胞結(jié)合劑（engager)。試劑可以是表達(dá)嵌合抗原受體 (CAR)的T細(xì)胞。CAR可以包含選擇下組的氨基酸序列：SEQ ID No.33,34和35。
[0073]試劑可以包含J0VI-1抗體或其功能片段。
[0074] 試劑可以包含具有包含以下互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的 抗體或其功能片段：
[0075] VH CDR1:SEQ ID Νο·7;
[0076] VH CDR2:SEQ ID Νο·8;
[0077] VH CDR3:SEQ ID Νο·9;
[0078] VL CDR1:SEQ ID No.10；
[0079] VLCDR2:SEQIDNo.lUP
[0080] VL CDR3:SEQ ID No.12
[0081] 試劑可以包含抗體或其功能片段，其包含具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列 的可變重鏈(VH)和具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的可變輕鏈(VL)。
[0082]試劑可以包含具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的scFv。試劑可以作為藥物 組合物提供。
[0083] T細(xì)胞淋巴瘤或白血病可以選自外周T細(xì)胞淋巴瘤，非特指型(PTCL-N0S);血管免 疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤（AITL)，間變性大細(xì)胞淋巴瘤（ALCL)，腸病相關(guān)的T細(xì)胞淋巴瘤 (EATL)，肝脾T細(xì)胞淋巴瘤(HSTL)，結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤鼻型，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，原發(fā)性皮 膚ALCL，T細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病和T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病。
[0084] 本發(fā)明還提供試劑，用于根據(jù)此類方法治療T細(xì)胞淋巴瘤或白血病中的用途。
[0085] 本發(fā)明還提供試劑盒，包含用于如上文所定義的用途的試劑。
[0086] 本發(fā)明還提供了試劑在制備用于根據(jù)上述方法治療T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的藥物 中的用途。
[0087] 本發(fā)明還提供用于診斷受試者中T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括確定樣品 中呈TRBC1或TRBC2陽性的總T細(xì)胞的百分比的步驟。
[0088] TRBC1或TRBC2陽性T細(xì)胞的百分比大于約80%指示T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的存在。 [0089]樣品可以是外周血樣品或活組織檢查(biopsy)。
[0090] 結(jié)合總T細(xì)胞的試劑可以結(jié)合⑶3。
[0091] 發(fā)明詳述
[0092]本發(fā)明提供選擇性結(jié)合TRBC1或TRBC2的試劑，如嵌合抗原受體(CARs)。此類試劑 在用于治療受試者中的T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的方法中是有用的。T細(xì)胞惡性腫瘤是克隆性 的，因此它們表達(dá)TRBC1或TRBC2。通過施用TCRB1或TCRB2選擇性試劑至受試者，試劑引起惡 性T細(xì)胞連同與惡性T細(xì)胞表達(dá)相同TRBC的正常T細(xì)胞的選擇性耗竭，而不引起表達(dá)惡性T細(xì) 胞不表達(dá)的TRBC的正常T細(xì)胞的耗竭。
[0093] TCRP 恒定區(qū)（TRBC)
[0094] T細(xì)胞受體(TCR)在T淋巴細(xì)胞的表面上表達(dá)，并負(fù)責(zé)識別結(jié)合至主要組織相容性 復(fù)合物(MHC)分子的抗原。當(dāng)TCR結(jié)合抗原肽和MHC (肽/MHC)時，T淋巴細(xì)胞通過一系列生物 化學(xué)事件活化，所述生物化學(xué)事件由相關(guān)的酶，共受體，特化的銜接頭(adaptor)分子，和活 化或釋放的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)。
[0095] TCR是二硫鍵連接的膜錨定異二聚體，通常由高度可變的alpha(a)和beta(i3)鏈組 成，作為與不變的CD3鏈分子的復(fù)合物的一部分表達(dá)。表達(dá)該受體的T細(xì)胞稱為α:β(或αβ)Τ 細(xì)胞(~95 %總Τ細(xì)胞）。少數(shù)Τ細(xì)胞表達(dá)替換受體，由可變gamma( 丫）和deta(δ)鏈形成，并稱 作γδΤ細(xì)胞(~5%總Τ細(xì)胞）。
[0096]每條α和β鏈由兩個胞外域組成:可變(V)和恒定(C)區(qū)，兩者都是形成反向平行的 片層的免疫球蛋白超家族（IgSF)域的。恒定區(qū)與細(xì)胞膜靠近，接著是跨膜區(qū)和短胞質(zhì)尾 部，而可變區(qū)結(jié)合肽/MHC復(fù)合物(見圖1KTCR的恒定區(qū)由短的連接序列組成，其中半胱氨酸 形成二硫鍵，其形成兩條鏈之間的連接。
[0097] TCRa-鏈和β-鏈兩者的可變域具有三個超變或互補(bǔ)決定區(qū)（CDRs)。0_鏈的可變區(qū) 還可以具有另外的超變區(qū)域(HV4)，然而，這通常不接觸抗原并因此認(rèn)為不是CDR。
[0098] TCR還可以包含多達(dá)五個不變鏈γ、δ、ε (統(tǒng)稱為⑶3)和ζ。在抗原被αβ或γδ識別 后，CD3和ζ亞基通過特定的胞質(zhì)域介導(dǎo)TCR信號傳導(dǎo)，所述胞質(zhì)域與第二信使和銜接頭分子 相互作用。TCR復(fù)合物的細(xì)胞表面表達(dá)之前是亞基的成對(pair-wise)組裝，其中TCRa和β以 及CD3 γ和δ的跨膜和胞外域兩者都發(fā)揮作用。
[0099] 因此，TCR通常由⑶3復(fù)合物和TCRa和β鏈組成，其繼而由可變和恒定區(qū)組成（圖1)。 [0100] 提供TCRi3_恒定區(qū)（TRBC)的基因座(Chr7:q34)在進(jìn)化史中已經(jīng)復(fù)制以產(chǎn)生兩個幾 乎相同且功能等同的基因：TRBC1和TRBC2(圖2)，其差異僅在于各自產(chǎn)生的成熟蛋白中的4 個氨基酸（圖3)。每個TCR將以互相排斥的方式包含TRBC1或TRBC2，而因此，每個αβΤ細(xì)胞將 以互相排斥的方式表達(dá)TRBC1或TRBC2。
[0101]本發(fā)明人已經(jīng)確定了，盡管TRBC 1和TRBC2的序列之間的相似性，區(qū)分它們是可能 的。本發(fā)明人也已經(jīng)確定了可以在細(xì)胞(例如Τ細(xì)胞)表面上原位區(qū)分TRBC1和TRBC2的氨基 酸序列。
[0102] 惡性細(xì)胞
[0103] 術(shù)語"惡性"用于本文根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)含義指代細(xì)胞，其生長不是自我限制的，可以能 夠侵入臨近組織并可以能夠擴(kuò)散到遠(yuǎn)端組織。因而，術(shù)語"惡性Τ細(xì)胞"用于本文指代在淋巴 瘤或白血病的情況下克隆擴(kuò)增的Τ細(xì)胞。
[0104] 本發(fā)明的方法涉及確定惡性Τ細(xì)胞的TRBC。這可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。例 如，可以通過PCR，western印跡，流式細(xì)胞術(shù)，或焚光顯微術(shù)方法確定。
[0105] 一旦已經(jīng)確定了惡性T細(xì)胞表達(dá)的TRBC，將適合的TRBC1或TRBC2選擇性試劑施用 至受試者。"適合的TRBC選擇性試劑"表示在惡性T細(xì)胞確定為表達(dá)TRBC1的情況下，施用 TRBC1選擇性試劑，而在惡性T細(xì)胞確定為表達(dá)TRBC2的情況下，施用TRBC2選擇性試劑。 [0106] 選擇性試劑
[0107]選擇性試劑以互相排斥的方式結(jié)合TRBC1或TRBC2。
[0108] 如上文所述，每個αβτ細(xì)胞表達(dá)TCR，其包含TRBC1或TRBC2。在克隆T細(xì)胞病癥如T細(xì) 胞淋巴瘤或白血病中，來源于相同克隆的惡性Τ細(xì)胞將全部表達(dá)TRBC1或TRBC2。
[0109] 因此，本方法包括施用TRBC1或TRBC2選擇性試劑至受試者的步驟，其中試劑導(dǎo)致 惡性Τ細(xì)胞連同與惡性Τ細(xì)胞表達(dá)相同TRBC的正常Τ細(xì)胞的選擇性耗竭，而不引起與惡性Τ細(xì) 胞相比表達(dá)另一種TRBC的正常Τ細(xì)胞的顯著耗竭。
[0110] 因為TRBC選擇性試劑不引起與惡性Τ細(xì)胞相比表達(dá)另一種TRBC的正常Τ細(xì)胞的顯 著耗竭，其不引起整個T細(xì)胞區(qū)室的耗竭。一定比例的患者T細(xì)胞區(qū)室的保留（即不表達(dá)與惡 性T細(xì)胞相同TRBC的T細(xì)胞)導(dǎo)致降低的毒性和減低的細(xì)胞和體液免疫缺陷，從而降低感染 的風(fēng)險。
[0111] 根據(jù)本發(fā)明的方法，TRBC1選擇性試劑的施用可以導(dǎo)致5，10，20，50，75，90，95或 99 %耗竭，即表達(dá)TRBC1的T細(xì)胞數(shù)量的減少。
[0112] 根據(jù)本發(fā)明的方法，TRBC2選擇性試劑的施用可以導(dǎo)致5，10，20，50，75，90，95或 99 %耗竭，即表達(dá)TRBC2的T細(xì)胞數(shù)量的減少。
[0113] TRBC1選擇性試劑可以以TRBC2的大至少2倍，4倍，5倍，7倍或10倍的親和力結(jié)合 TRBC1。相似地，TRBC2選擇性試劑可以以TRBC1的大至少2倍，4倍，5倍，7倍或10倍的親和力 結(jié)合TRBC2。
[0114] TRBC1選擇性試劑引起細(xì)胞群體中比表達(dá)TRBC2的細(xì)胞更大比例的表達(dá)TRBC1的T 細(xì)胞的耗竭。例如，表達(dá)TRBC1的T細(xì)胞比表達(dá)TRBC2的細(xì)胞的耗竭的比率可以為至少60%: 40 %，70 % : 30 %，80 % : 20 %，90 % : 10 %或95 % : 5 %。相似地，TRBC2選擇性試劑引起細(xì)胞群 體中比表達(dá)TRBC2的細(xì)胞更大比例的表達(dá)TRBC1的T細(xì)胞的耗竭。例如，表達(dá)TRBC2的T細(xì)胞比 表達(dá)TRBC1的細(xì)胞的耗竭的比率可以為至少60% :40%，70% :30%，80% :20%，90% : 10% 或95% :5%。
[0115] 使用本發(fā)明的方法，受試者中的惡性T細(xì)胞被耗竭，而不影響相當(dāng)大比例的健康T 細(xì)胞。通過"相當(dāng)大比例"表示的是為了維持受試者中T細(xì)胞的功能，足夠比例的與惡性T細(xì) 胞表達(dá)不同TRBC的T細(xì)胞存活。試劑可以導(dǎo)致表達(dá)另一種TCRB的T細(xì)胞群體的少于20%， 15%，10%或5%的耗竭。
[0116] 選擇性試劑可以是對于TRBC1或TRBC2是選擇性的，因為其區(qū)分如下列出的殘基：
[0117] (丨奵1^(：位置3處~與1(;
[0118] (ii)TRBC位置 3 處K 與 N;
[0119] (iii)TRBC位置 4 處K 與 N;
[0120] ("奵1^(：位置4處~與1(;
[0121] (v)TRBC位置 36 處F 與 Y;
[0122] (￥1奵1^(：位置36處￥與卩；
[0123] (vii)TRBC 位置 135 處 V與 E;和/或
[0124] (viii)TRBC 位置 135處E與 V。
[0125] 選擇性試劑可以區(qū)分上述差異的任意差異組合。
[0126] 抗體
[0127] 本發(fā)明的方法中使用的試劑可以是耗竭性單克隆抗體(mAb)或其功能片段，或抗 體模擬物(antibody mimetic)。
[0128] 術(shù)語"耗竭性抗體"以其常規(guī)意義使用，涉及結(jié)合靶T細(xì)胞上存在的抗原并介導(dǎo)靶T 細(xì)胞的死亡的抗體。因此，施用耗竭性抗體至受試者導(dǎo)致受試者中表達(dá)靶抗原的細(xì)胞的數(shù) 量降低/減少。
[0129] 如本文所用的，"抗體"表示具有抗原結(jié)合位點的多肽，所述抗原結(jié)合位點包括至 少一個互補(bǔ)決定區(qū)CDR?？贵w可以包含3個CDR并具有與域抗體(dAb)等同的抗原結(jié)合位點。 抗體可以包含6個CDR，并具有與經(jīng)典抗體分子等同的抗原結(jié)合位點。多肽的剩余部分可以 是任意序列，其提供用于抗原結(jié)合位點的適合支架，并以對于其結(jié)合抗原適合的方式展示 它?？贵w可以是整個免疫球蛋白分子或其部分，例如?&13^( &13)'2^￥，單鏈?￥(5(^￥)片段或 納米抗體?？贵w可以是雙功能抗體?？贵w可以是非人的，嵌合的，人源化的或全人的。
[0130]因此，抗體可以是任意功能片段，其保留了全長抗體的抗原特異性。
[0131] TRBC1選擇性抗體
[0132] 用于本發(fā)明的方法中的試劑可以包含抗體或其功能片段，所述抗體或功能片段具 有可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)，其包含一個或多個以下互補(bǔ)決定區(qū)（CDR):
[0133] VH CDR1:GYTFTGY(SEQ ID No.7)；
[0134] VH CDR2:NPYNDD(SEQ ID No.8)；
[0135] VH CDR3:GAGYNFDGAYRFFDF(SEQ ID No.9);
[0136] VL CDR1:RSSQRLVHSNGNTYLH(SEQ ID No.10);
[0137] VLCDR2:RVSNRFP(SEQIDNo.ll)jP
[0138] VL CDR3:SQSTHVPYT(SEQ ID No.12)
[0139] 相比于如SEQ ID No.7至12給出的序列，一個或多個⑶R每個獨立地可以包含或不 包含一個或多個氨基酸突變(例如，取代），只要所得的抗體保留了選擇性結(jié)合TRBC1的能 力。
[0140] 研究已經(jīng)表明⑶R L3和H3普遍地負(fù)責(zé)與抗原的高能量相互作用，因此抗體或其功 能性片段可以包含如上文所述的VH⑶R3和/或VL⑶R3。
[0141] 使用噬菌體展示，已經(jīng)鑒定了幾個另外的抗體結(jié)合域，其對于結(jié)合TRBC1相對于結(jié) 合TRBC2是高度選擇性的，如實施例12中所描述的。
[0142] 試劑可以包含抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段具有可變重鏈(VH) 和/或可變輕鏈(VL)，其包含表1中示出的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR3)。
[0143] 表1
[0144]
[0145] 在試劑是域抗體的情況下，其可以包含3個⑶R，即VH⑶R1-⑶3R或VL⑶R1-⑶R3。
[0146] 試劑可以包含抗體或其功能部分，其包含具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列 的可變重鏈(VH)和具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的可變輕鏈(VL)。
[0147] SEQ_ID_lJovi-lVH
[0148] EVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHWVKQRPGQGLEWIGFINPYNDDIQSNERFRGKAT LTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSS
[0149] SEQ_ID_2Jovi-lVL
[0150] DWMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKR
[0151] 試劑可以包含具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的scFv。
[0152] SEQ_ID_3Jovi-lscFv
[0153] EVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHWVKQRPGQGLEWIGFINPYNDDIQSNERFRGKAT LTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQS PLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKR
[0154]或者，試劑可以包含抗體或其功能片段，其包含：
[0155] (i)重鏈 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR3;
[0156] (i i)重鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3;或
[0157] (iii)可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL);
[0158] 來自如SEQ ID吣.13至22所示的8〇卩￥8的一個。
[0159] 在如SEQ ID No. 13-22所示的序列中，序列的VH和VL部分加粗示出，且重鏈和輕鏈 的⑶R1和⑶R2序列下劃線標(biāo)出。VH和VL的⑶R3序列在表1中給出。
[0160] SEQ ID N〇.13_(CP_01_E09)
[0161]
[0163] SEQ ID No.14(CP_01_D12)
[0164]
[0165] SEQ ID No.15(CP_01_D10)
[0174]
[0182] TRBC2-特異性
[0183] 使用噬菌體展示，已經(jīng)鑒定了幾個抗體結(jié)合域，其對于結(jié)合TRBC2相對于結(jié)合 TRBC1是高度選擇性的，如實施例12中所描述的。
[0184] 試劑可以包含抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段具有可變重鏈(VH) 和/或可變輕鏈(VL)，其包含表2中示出的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR3s)。
[0185] 表2
[0186]
[0187]試劑可以包含抗體或其功能片段，其包含：
[0188] (i)重鏈 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR3;
[0189 ] (i i)重鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3;或
[0190] (iii)可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL);
[0191] 來自如SEQ ID吣.23-32所示的8〇?￥8的一個。
[0192] 在如SEQ ID No.23-32所示的序列中，序列的VH和VL部分加粗示出，且重鏈和輕鏈 的⑶R1和⑶R2序列下劃線標(biāo)出。VH和VL的⑶R3序列在表2中給出。
[0193] SEQ ID No.23(CP_03_E05)
[0194]
[0212]
[0216] 以上氨基酸序列的變體也可以用于本發(fā)明，只要所得的抗體結(jié)合TRBC1或TRBC2且 不顯著交叉反應(yīng)。典型地，此類變體與上文指定序列的一個具有高度序列同一性。
[0217] 用于比較的序列的比對方法是本領(lǐng)域中公知的。
[0218] NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)從幾個來源可用，包括 National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，Md.)和互聯(lián)網(wǎng)，用于 與序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx相關(guān)使用。如何使用該程序確 定序列同一性的說明可以在互聯(lián)網(wǎng)上的NCBI網(wǎng)站上獲得。
[0219] VL或VH域或scFv的變體通常具有與如SEQ ID No. 1-3,13-32所給出的序列至少約 75%，例如至少約80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性。
[0220] 典型地，相比于原始氨基酸或核酸序列，變體可以含有一個或多個保守氨基酸取 代。保守取代是不實質(zhì)上影響或降低抗體結(jié)合TRBC1或TRBC2的親和力的那些取代。例如，特 異性結(jié)合TRBC1或TRBC2的人抗體相比于如SEQ ID No. 1-3或13-32所給出的任何序列，可以 在VH或VL之任一或兩者中包括多達(dá)1個，多達(dá)2個，多達(dá)5個，多達(dá)10個，或多達(dá)15個的保守取 代并保留對TRBC1或TRBC2的特異性結(jié)合。
[0221] 可以通過保守取代的方式交換的功能上相似的氨基酸對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員是公知的。以下六組是認(rèn)為對于彼此是保守取代的氨基酸的例子：1)丙氨酸(A)，絲氨酸 (S)，蘇氨酸(T) ;2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ;3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ;4)精氨酸(R)， 賴氨酸(K) ;5)異亮氨酸（I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸 (Y)，色氨酸(W)。
[0222] 抗體的制備
[0223] 可以使用標(biāo)準(zhǔn)的實驗室技術(shù)進(jìn)行抗體的制備。可以從動物血清獲得抗體，或者，在 單克隆抗體或其片段的情況下，在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生?？梢允褂弥亟MDNA技術(shù)根據(jù)建立的程 序在細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生抗體。
[0224] 用于單克隆抗體的產(chǎn)生的方法是本領(lǐng)域中公知的。簡單的說，通常通過將骨髓瘤 細(xì)胞與來自已經(jīng)使用期望的抗原免疫的小鼠或兔的脾細(xì)胞融合來制備單克隆抗體。本文 中，期望的抗原是TRBC1或TRBC2肽，或包含TRBC1或TRBC2的TCR0鏈。
[0225] 或者，可以通過以重組的方式組合VH和VL鏈的文庫，在免疫系統(tǒng)之外制備抗體和 相關(guān)的分子，特別是scFv?？梢允褂萌鐚嵤├?2所述的噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建和篩選此類文 庫。
[0226] 鑒定TRBC1/TRBC2選擇性抗體
[0227] 可以使用本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的方法鑒定對于TRBC1或TRBC2選擇性的抗體。用于確定抗 體的結(jié)合特異性的方法包括但不限于，ELISA，western印跡，免疫組織化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)， l^rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，噬菌體展示文庫，酵母雙雜交篩選，共免疫沉淀，雙分子熒光 互補(bǔ)和串聯(lián)親和純化。
[0228] 為了鑒定對于TRBC1或TRBC2選擇性的抗體，評估了抗體對TRBC1和TRBC2每一個的 結(jié)合。典型地，這是通過確定抗體分別對每一個TRBC的結(jié)合來評估?？贵w選擇性結(jié)合TRBC1 或TRBC2而不顯著結(jié)合另一種TRBC。
[0229] 抗體模擬物
[0230] 或者，試劑可以是不來源于或基于免疫球蛋白的分子。已經(jīng)發(fā)展了一些"抗體模擬 物"設(shè)計的重復(fù)蛋白（DRPs)以開發(fā)非抗體多肽的結(jié)合能力。
[0231 ]重復(fù)蛋白如錨蛋白（ankyrin)或富含亮氨酸的重復(fù)蛋白是獨特的結(jié)合分子，不像 抗體，其發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外。它們獨特的模塊架構(gòu)特征重復(fù)結(jié)構(gòu)單元(重復(fù)），其堆疊在 一起以形成延長的重復(fù)域，展現(xiàn)出可變的和模塊靶標(biāo)結(jié)合表面?；谶@一模塊性，可以產(chǎn)生 具有高度多樣化的結(jié)合特異性的多肽的組合文庫。DARPins(設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白）是基 于該技術(shù)的抗體模擬物的一個例子。
[0232] 對于Anticalins，結(jié)合特異性來源于脂質(zhì)運載蛋白（lipocalins)，即實施與化學(xué) 敏感性或不溶性化合物的生理運輸和儲存相關(guān)的一批體內(nèi)功能的蛋白家族。脂質(zhì)運載蛋白 具有強(qiáng)的(robust)內(nèi)在結(jié)構(gòu)，包括高度保守的β-桶，其支持所述蛋白一個末端處的四個環(huán)。 用于進(jìn)入結(jié)合口袋的這些環(huán)和該分子的這部分中的構(gòu)象差異負(fù)責(zé)不同脂質(zhì)運載蛋白之間 的結(jié)合特異性的變化。
[0233] Avimers從人細(xì)胞外受體域的大家族進(jìn)化，通過體外外顯子改組(exonshuffling) 和噬菌體展示，產(chǎn)生具有結(jié)合和抑制特性的多結(jié)構(gòu)域蛋白。
[0234] Versabodies是具有>15%的半胱氨酸的3_5kDa的小蛋白，其形成高二硫鍵密度支 架，替代大多數(shù)蛋白中存在的疏水核心。大量疏水性氨基酸，包括疏水核心被少量二硫化物 的替換導(dǎo)致較小的，更親水的，對蛋白酶和熱更抗性的，并具有較低密度T細(xì)胞表位的蛋白。 這些特性的所有四種導(dǎo)致具有大大降低的免疫原性的蛋白。它們也可以在大腸桿菌中制 備，并是高度可溶和穩(wěn)定的。
[0235] 綴合物
[0236] 抗體或模擬物可以是抗體或模擬物和另一種試劑或抗體的綴合物，例如綴合物可 以是可檢測實體或化療實體。
[0237] 可檢測實體可以是熒光部分，例如熒光肽。"熒光肽"指代多肽，其在激發(fā)后，發(fā)射 可檢測波長的光。熒光蛋白的例子包括但不限于，異硫氰酸熒光素(FITC)，藻紅蛋白（PE)， 別藻藍(lán)蛋白（APC)，綠色熒光蛋白（GFP)，增強(qiáng)的綠色熒光蛋白，紅色熒光蛋白（RFP)，藍(lán)色熒 光蛋白（BFP)和mCherry。
[0238] 與可檢測實體綴合的選擇性TRBC1或TRBC2試劑可以用于確定惡性T細(xì)胞的TRBC。
[0239] 化療實體如用于本文指代對細(xì)胞破壞性的實體，也就是降低細(xì)胞的生存力的實 體。該化療試劑可以是細(xì)胞毒性藥物。考慮的化療試劑包括但不限于，烷化劑，亞硝基脲，乙 烯亞胺/甲基三聚氰胺，烷基磺酸鹽，抗代謝物，嘧啶類似物，表鬼白毒素 (epipodophylotoxins)，酶例如L-天冬酰胺酶;生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，如干擾素 a，IL-2，G_CSF和 GM-CSF;鉬配位絡(luò)合物，如順鉬和卡鉬，蒽二酮(anthracenediones)，取代脲例如羥基脲，甲 基肼衍生物包括N-甲基肼(MIH)和甲基芐肼，腎上腺皮質(zhì)抑制劑，如米托坦(〇，p ' -DDD)和氨 魯米特;激素和詰抗劑，包括腎上腺皮質(zhì)類固醇詰抗劑例如強(qiáng)的松(prednisone)和等同物， 地塞米松和氨魯米特;孕激素例如己酸羥孕酮，醋酸甲羥孕酮和醋酸甲地孕酮;雌激素例如 己稀雌?Kdiethylstilbestrol)和炔雌醇等同物;抗雌激素如他莫昔芬(tamoxifen);雄激 素包括丙酸睪酮和氟甲睪酮/等同物;抗雄激素如氟他胺，促性腺激素釋放激素類似物和亮 丙瑞林(leuprolide);和非類固醇抗雄激素，如氟他胺(flutamide)。
[0240]綴合有化療實體的TRBC選擇性試劑使得能夠?qū)⒒煂嶓w靶向遞送至表達(dá)TRBC1或 TRBC2的細(xì)胞。
[0241 ]雙特異性T細(xì)胞結(jié)合劑
[0242] 已經(jīng)開發(fā)了極其多種基于具有兩個抗體樣結(jié)合域的基本概念的分子。
[0243] 雙特異性T細(xì)胞結(jié)合分子是一類已經(jīng)開發(fā)的雙特異性抗體類分子，主要用于抗癌 癥藥物的用途。它們將宿主的免疫系統(tǒng)，更具體地T細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，引導(dǎo)針對靶細(xì)胞 如癌細(xì)胞。在這些分子中，一個結(jié)合域通過CD3受體結(jié)合T細(xì)胞，而另一個結(jié)合靶細(xì)胞如腫瘤 細(xì)胞(通過腫瘤特異性分子）。由于雙特異性分子結(jié)合靶細(xì)胞和T細(xì)胞兩者，其將靶細(xì)胞帶到 與T細(xì)胞臨近，使得T細(xì)胞能夠發(fā)揮其效果，例如，對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性效果。T細(xì)胞:雙特異 性Ab:癌細(xì)胞復(fù)合物的形成誘導(dǎo)T細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)，引起例如細(xì)胞毒性介導(dǎo)物的釋放。理 想地，試劑在靶細(xì)胞的存在下僅誘導(dǎo)期望的信號傳導(dǎo)，引起選擇性殺傷。
[0244] 已經(jīng)以一些不同的形式開發(fā)了雙特異性T細(xì)胞結(jié)合分子，但是最普遍的一個是由 不同抗體的兩個單鏈可變片段(scFv)組成的融合物。這些有時稱為BiTEs(雙特異性T細(xì)胞 結(jié)合劑）。
[0245] 本發(fā)明的方法中使用的試劑可以是雙特異性分子，其選擇性識別TRBC1或TRBC2， 并能夠活化T細(xì)胞。例如，試劑可以是BiTE。方法中使用的試劑可以包含：
[0246] (i)結(jié)合TRBC1或TRBC2的第一結(jié)構(gòu)域;和
[0247] (ii)能夠活化T細(xì)胞的第二結(jié)構(gòu)域。
[0248] 雙特異性分子可以包含信號肽以幫助其產(chǎn)生。信號肽可以引起雙特異性分子被宿 主細(xì)胞分泌，使得可以從宿主細(xì)胞的上清收獲雙特異性分子。
[0249]信號肽可以在分子的氨基末端。雙特異性分子可以具有以下通式:信號肽-第一結(jié) 構(gòu)域-第二結(jié)構(gòu)域。
[0250]雙特異性分子可以包含間隔序列以連接第一結(jié)構(gòu)域與第二結(jié)構(gòu)域并在空間上分 開兩個結(jié)構(gòu)域。
[0251]間隔序列可以例如包含IgGl鉸鏈或CD8莖部。接頭可以可選包括備選接頭序列，其 具有與IgGl鉸鏈或CD8莖部相似的長度和/或結(jié)構(gòu)域間隔特性。
[0252]雙特異性分子可以包含J0VI-1，或其功能性片段，如上文所定義的。
[0253]嵌合抗原受體(CAR)
[0254] 嵌合抗原受體(CAR)，也稱為嵌合T細(xì)胞受體，人工T細(xì)胞受體和嵌合免疫受體，是 工程化的受體，其將任意特異性嫁接到免疫效應(yīng)細(xì)胞上。在經(jīng)典的CAR中，將單克隆抗體的 特異性嫁接到T細(xì)胞上。可以使用例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將編碼CAR的核酸轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞中。以 這種方式，可以產(chǎn)生大量癌癥特異性的T細(xì)胞用于過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移。該方法的I期臨床研究表 現(xiàn)出效力。
[0255] CAR的靶抗原結(jié)合域通常經(jīng)由間隔區(qū)和跨膜域融合至胞內(nèi)域，其包含細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞 信號傳導(dǎo)域，或與細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞信號傳導(dǎo)域相關(guān)聯(lián)。當(dāng)CAR結(jié)合靶抗原時，這導(dǎo)致活化信號傳 輸至它在上面表達(dá)的T細(xì)胞。
[0256] 本發(fā)明的方法中使用的試劑可以是CAR，其選擇性識別TRBC1或TRBC2。試劑可以是 表達(dá)選擇性識別TRBC1或TRBC2的CAR的T細(xì)胞。
[0257] CAR還可以包含跨越膜的跨膜域。其可以包含疏水a(chǎn)lpha螺旋。跨膜域可以來源于 CD28，其給予良好的受體穩(wěn)定性。
[0258] 胞內(nèi)域是CAR參與信號傳輸?shù)牟糠?。胞?nèi)域包含細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞信號傳導(dǎo)域，或與細(xì) 胞內(nèi)T細(xì)胞信號傳導(dǎo)域相關(guān)聯(lián)。在抗原識別后，受體簇集且信號傳輸至細(xì)胞。最普遍使用的T 細(xì)胞信號傳導(dǎo)組分是CD3-zeta的，其含有3個ITAM。在抗原結(jié)合后，這將活化信號傳輸至T細(xì) 胞。CD3-zeta可以不提供完全有能力的活化信號，可以需要另外的共刺激信號。例如，嵌合 ⑶28和0X40可以與⑶3-Zeta-起使用以傳輸增殖/存活信號，或所有三種可以一起使用。
[0259] CAR的胞內(nèi)域可以包含CD28胞內(nèi)域和0X40和CD3_Zeta胞內(nèi)域。
[0260] CAR可以包含信號肽，使得當(dāng)CAR表達(dá)在細(xì)胞如T細(xì)胞內(nèi)時，初生蛋白被引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)和隨后到細(xì)胞表面，在那里其被表達(dá)。
[0261] CAR可以包含間隔序列以連接TRBC結(jié)合域與跨膜域并在空間上將TRBC結(jié)合域從胞 內(nèi)域分開。柔性間隔區(qū)允許TRBC結(jié)合域在不同的方向定向，以實現(xiàn)TRBC結(jié)合。
[0262] 間隔序列可以例如包含IgGIFc區(qū)，IgGl鉸鏈或⑶8莖部，或其組合。接頭可以可選 包含備選接頭序列，其具有與IgGIFc區(qū)，IgGl鉸鏈或CD8莖部相似的長度和/或結(jié)構(gòu)域間隔 特性。
[0263] 發(fā)現(xiàn)包含基于IgGl鉸鏈或⑶8莖部的間隔區(qū)的CAR表現(xiàn)出針對Jurkat細(xì)胞最好的 表現(xiàn)（圖15)。因此，間隔區(qū)可以包含IgGl鉸鏈或CD8莖部，或具有與IgGl鉸鏈或CD8莖部相似 的長度和/或結(jié)構(gòu)域間隔特性的間隔區(qū)。
[0264] 可以改變?nèi)薎gGl間隔區(qū)以去除Fc結(jié)合基序。
[0265] CAR可以包含J0VI-1抗體，或其功能片段，如上文定義的。
[0266] CAR可以包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID No.33、34和35。
[0267] >SEQ_ID_33 具有 CD8 莖部間隔區(qū)的 J0VI-1CAR
[0268] METDTLLLffVLLVffIPGSTGEVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHffVKQRPGQGLEffIG FINPYNDDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRR EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR
[0269] >SEQ_ID_34 具有 H-CH2-CH3pvaa間隔區(qū)的 J0VI-1CAR
[0270] METDTLLLffVLLVffIPGSTGEVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHffVKQRPGQGLEffIG FINPYNDDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTV AFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADA HSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[0271] >SEQ_ID_35 具有 IgGl 鉸鏈間隔區(qū)的 J0VI-1CAR
[0272] METDTLLLffVLLVffIPGSTGEVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHffVKQRPGQGLEffIG FINPYNDDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLV VVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPG GGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[0273] 在上文給出的CAR序列中，6個⑶R的一個或多個各種獨立地可以包含或不包含與 SEQ ID No.7至12給出的序列相比一個或多個氨基酸突變(例如，取代），只要所得的CAR保 留了結(jié)合TRBC1的能力。
[0274]以上氨基酸序列的變體也可以用于本發(fā)明中，只要所得的CAR結(jié)合TRBC1或TRBC2 且不顯著地交叉反應(yīng)。典型地，此類變體與SEQ ID No.33,34或35給出的序列的一個具有高 度的序列同一"性。
[0275] CAR的變體通常具有與如SEQ ID No.33,34或35給出的序列的一個至少約75%，例 如至少約80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性。
[0276] 核酸
[0277] 本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼本發(fā)明的第一個方面的試劑，如BiTE或CAR的核酸。
[0278] 核酸序列可以編碼包含如SEQ ID No.33,34或35所述的氨基酸序列的一個的CAR。
[0279] 如本文所使用的，術(shù)語"多核苷酸"，"核苷酸"和"核酸"旨在是彼此同義的。
[0280] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解由于遺傳密碼的簡并性，許多不同的多核苷酸和核酸可 以編碼相同的多肽。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解使用常規(guī)技術(shù)，可以制備核苷酸取 代，其不影響由此處所述的多核苷酸編碼的多肽序列，以反映多肽將在其中表達(dá)的任意特 定宿主生物中的密碼子選擇。
[0281] 根據(jù)本發(fā)明的核酸可以包括DNA或RNA。它們可以是單鏈的或雙鏈的。它們也可以 是在它們之中包括合成的或修飾的核苷酸的多核苷酸。對寡核苷酸的一些不同類型的修飾 是本領(lǐng)域已知的。這些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架，在分子的3'和/或5'末端的吖啶 (acridine)或聚賴氨酸鏈的添加。為了如本文所述的用途的目的，應(yīng)當(dāng)理解可以通過本領(lǐng) 域可用的任意方法修飾多核苷酸。為了提高感興趣的多核苷酸的體內(nèi)活性或壽命可以進(jìn)行 此類修飾。
[0282] 術(shù)語"變體"、"同源物"或"衍生物"關(guān)于核苷酸序列包括來自序列或?qū)π蛄械囊粋€ (或多個)核酸的任意取代，變異，修飾，置換，缺失或添加。
[0283] 載體
[0284] 本發(fā)明還提供載體，或載體的試劑盒，其包括本發(fā)明的一個或多個核酸序列。此類 載體可以用于將核酸序列引入宿主細(xì)胞中，使得其表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的CAR。
[0285] 載體可以是例如質(zhì)?；虿《据d體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體，或基于轉(zhuǎn)座 子的載體或合成的mRNA。
[0286] 載體可以能夠轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞或NK細(xì)胞。
[0287] 細(xì)胞
[0288] 本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的CAR的細(xì)胞，如免疫細(xì)胞。
[0289]細(xì)胞可以包含本發(fā)明的核酸或載體。
[0290]細(xì)胞可以是T細(xì)胞或天然殺傷(NK)細(xì)胞。
[0291] T細(xì)胞可以是T細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞，其是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮中心作用的淋巴細(xì) 胞類型。通過細(xì)胞表面上的T細(xì)胞受體(TCR)的存在，可以將它們與其它淋巴細(xì)胞，如B細(xì)胞 和天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)區(qū)分。存在多種類型的T細(xì)胞，如下文總結(jié)的。
[0292] 輔助T輔助細(xì)胞(TH細(xì)胞)在免疫過程中協(xié)助其它白細(xì)胞，包括B細(xì)胞成熟成為漿細(xì) 胞和記憶B細(xì)胞，和細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化。TH細(xì)胞在它們的表面上表達(dá)CD4。當(dāng) 抗原提呈細(xì)胞(APCs)表面上的MHC II類分子將肽抗原呈遞至TH細(xì)胞時，它們變得活化。這 些細(xì)胞可以分化成幾個亞型的一種，包括!'!11，1'!12，1'!13，1'!117，1119，或了?!1，其分泌不同的細(xì) 胞因子以促進(jìn)不同類型的免疫應(yīng)答。
[0293] 細(xì)胞毒性T細(xì)胞(TC細(xì)胞，或CTL)破壞病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并也牽連在移 植排斥中。CTL在它們表面上表達(dá)CD8。這些細(xì)胞通過結(jié)合與MHC I類聯(lián)合的抗原識別它們的 靶標(biāo)，所述MHC I類存在于所有有核細(xì)胞的表面上。通過由調(diào)節(jié)T細(xì)胞分泌的IL-10,腺苷和 其它分子，CD8+細(xì)胞可以失活為無變應(yīng)性狀態(tài)，其防止自身免疫性疾病，如實驗性自身免疫 性腦脊髓炎。
[0294]記憶T細(xì)胞是抗原特異性T細(xì)胞的亞組，所述抗原特異性T細(xì)胞在感染已經(jīng)消退后 長期保持。一旦再暴露于它們的關(guān)聯(lián)(cognate)抗原，其快速擴(kuò)增為大量的效應(yīng)T細(xì)胞，從而 給免疫系統(tǒng)提供針對過去感染的"記憶"。記憶T細(xì)胞包括三個亞型：中央記憶T細(xì)胞(TCM細(xì) 胞)和兩類效應(yīng)記憶T細(xì)胞(TEM細(xì)胞和TEMRA細(xì)胞）。記憶細(xì)胞可以是⑶4+或⑶8+。記憶T細(xì)胞 通常表達(dá)細(xì)胞表面蛋白⑶45R0。
[0295]調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg細(xì)胞），以前稱為抑制T細(xì)胞，對于免疫耐受的維持是重要的。它們 主要的作用是關(guān)閉T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫朝向免疫反應(yīng)的結(jié)束和抑制逃脫胸腺中的陰性選擇過 程的自身反應(yīng)Τ細(xì)胞。
[0296] 已經(jīng)描述了兩類主要的⑶4+Treg細(xì)胞:天然發(fā)生的Treg細(xì)胞和適應(yīng)Treg細(xì)胞。
[0297] 天然發(fā)生的Treg細(xì)胞（也稱為CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞)在胸腺中產(chǎn)生，并已經(jīng) 與形成中的T細(xì)胞和已經(jīng)使用TSLP活化的髓樣(CDllc+)以及漿細(xì)胞樣(CD123+)樹突細(xì)胞兩 者之間的相互作用相連?？梢酝ㄟ^稱為FoxP3的細(xì)胞內(nèi)分子的存在，將天然發(fā)生的Treg細(xì)胞 與其它T細(xì)胞區(qū)分。F0XP3基因的突變可以阻止調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致致命的自身免疫病 IPEXo
[0298] 適應(yīng)Treg細(xì)胞(也稱為Trl細(xì)胞或Th3細(xì)胞)可以在正常免疫應(yīng)答期間起源。
[0299]細(xì)胞可以是天然殺傷細(xì)胞(或NK細(xì)胞）。疆細(xì)胞形成固有免疫系統(tǒng)的一部分。NK細(xì) 胞以不依賴MHC的方式提供對來自病毒感染細(xì)胞的固有信號的快速應(yīng)答。
[0300] NK細(xì)胞（屬于固有淋巴樣細(xì)胞組）定義為大顆粒淋巴細(xì)胞（LGL)并構(gòu)成第三種細(xì) 胞，其與產(chǎn)生B和T淋巴細(xì)胞的共同淋巴樣前體細(xì)胞區(qū)分。已知NK細(xì)胞在骨髓、淋巴結(jié)、脾、扁 桃體和胸腺中分化并成熟，然后它們在那里進(jìn)入循環(huán)。
[0301 ]本發(fā)明的CAR細(xì)胞可以是上述任意細(xì)胞類型。
[0302]可以離體從患者自身的外周血(第一方），或在來自供體外周血的造血干細(xì)胞移植 物的背景(第二方）中，或來自無關(guān)聯(lián)供體的外周血(第三方)創(chuàng)建表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的第一個 方面的CAR的T或NK細(xì)胞。
[0303] 或者，表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的CAR的T或NK細(xì)胞可以來源于可誘導(dǎo)祖細(xì)胞 或胚胎祖細(xì)胞離體分化為T或NK細(xì)胞?；蛘?，可以使用保留了其溶解功能并可以起治療劑作 用的永生化的T細(xì)胞系。
[0304] 在所有這些實施方案中，通過許多方法的一種引入編碼CAR的DNA或RNA生成CAR細(xì) 胞，所述方法包括使用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，使用DNA或RNA轉(zhuǎn)染。
[0305]本發(fā)明的CAR細(xì)胞可以是來自受試者的離體T或NK細(xì)胞。T或NK細(xì)胞可以來自外周 血單核細(xì)胞(PBMC)樣品。在使用編碼根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的CAR的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，可以 活化和/或擴(kuò)增T或NK細(xì)胞，例如通過使用抗CD3單克隆抗體處理。
[0306] 本發(fā)明的T或NK細(xì)胞可以通過以下制成：
[0307] (i)從受試者或以上列出的其它來源分離含有T或NK細(xì)胞的樣品；和
[0308] (ii)使用編碼本發(fā)明的CAR的核酸序列轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染T或NK細(xì)胞。
[0309] 接著，可以純化T或NK細(xì)胞，例如基于抗原結(jié)合多肽的抗原結(jié)合域的表達(dá)選擇。
[0310] 本發(fā)明還提供試劑盒，其包括包含根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的CAR的T或NK細(xì)胞。 [0311] 藥物組合物
[0312]本發(fā)明還涉及含有多個表達(dá)本發(fā)明第一個方面的CAR的細(xì)胞的藥物組合物。藥物 組合物可以另外包含藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。藥物組合物可以任選地包含 一種或多種另外的藥學(xué)上活性的多肽和/或化合物。此類配制劑可以是例如為適用于靜脈 內(nèi)輸注的形式。
[0313] T細(xì)胞淋巴瘤和/或白血病
[0314] 本發(fā)明涉及用于治療T細(xì)胞淋巴瘤和/或白血病的試劑，細(xì)胞和方法。
[0315] 用于治療T細(xì)胞淋巴瘤和/或白血病的方法涉及試劑的治療用途。本文中可以將試 劑施用至患有存在的T細(xì)胞淋巴瘤和/或白血病疾病的受試者，以減輕，降低或改善與疾病 相關(guān)的至少一種癥狀和/或減慢，降低或阻斷疾病的進(jìn)展。
[0316] 本發(fā)明的方法可以用于與表達(dá)T細(xì)胞受體(TCR)的細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增相關(guān)的任意 淋巴瘤和/或白血病，所述T細(xì)胞受體包含β恒定區(qū)。因而，本發(fā)明涉及用于治療涉及惡性T細(xì) 胞的疾病的方法，所述惡性Τ細(xì)胞表達(dá)包含TRBC的TCR。
[0317] 本發(fā)明的方法可以用于治療Τ細(xì)胞淋巴瘤，其中惡性Τ細(xì)胞表達(dá)包含TRBC的TCR。 "淋巴瘤"用于本文根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)含義指代通常在淋巴結(jié)中發(fā)展，但也可以影響脾，骨髓，血液 和其它器官的癌癥。淋巴瘤通常表現(xiàn)為淋巴樣細(xì)胞的實體瘤。與淋巴瘤相關(guān)的原發(fā)性癥狀 是淋巴結(jié)病，但繼發(fā)性(Β)癥狀可以包括發(fā)熱，盜汗，消瘦，食欲不振，乏力，呼吸窘迫和瘙 癢。
[0318] 本發(fā)明的方法可以用于治療Τ細(xì)胞白血病，其中惡性Τ細(xì)胞表達(dá)包含TRBC的TCR。 "白血病"用于本文根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)含義指代血液或骨髓的癌癥。
[0319]以下是可以通過本發(fā)明的方法治療的疾病的說明性的，非窮舉列表。
[0320] 外周T細(xì)胞淋巴瘤
[0321]外周T細(xì)胞淋巴瘤是相對不常見的淋巴瘤，并占所有非霍奇金淋巴瘤(NHL)的少于 10%。然而，它們與侵襲性的臨床過程相關(guān)，且大多數(shù)T細(xì)胞淋巴瘤的原因和精確的細(xì)胞起 源仍然沒有很好的定義。
[0322] 淋巴瘤通常首先表現(xiàn)為頸部，腋下或腹股溝的腫大。另外的腫大可以發(fā)生在其它 淋巴結(jié)定位的地方例如在脾中。一般來說，擴(kuò)大的淋巴結(jié)可以侵犯血管，神經(jīng)或胃部的空 間，分別導(dǎo)致腫脹的手臂和腿，導(dǎo)致刺痛和麻木，以及導(dǎo)致飽的感覺。淋巴瘤癥狀還包括非 特異性癥狀例如發(fā)熱，寒戰(zhàn)，不明原因的體重減輕，盜汗，嗜睡和瘙癢。
[0323] WHO分類利用形態(tài)學(xué)和免疫表型特征連同臨床方面以及在一些情況下遺傳學(xué)來劃 定外周T細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后和治療上有意義的分類(Swerdlow等;WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues.4th ed.;Lyon:IARC Press;2008)〇 贅生性T細(xì)胞的解剖定位部分平行于它們所提議的正常細(xì)胞的對應(yīng)物和功能，因此T細(xì)胞淋 巴瘤與淋巴結(jié)和外周血相關(guān)。該方法允許更好的理解一些T細(xì)胞淋巴瘤的臨床表現(xiàn)，包括它 們的細(xì)胞分布，形態(tài)學(xué)的一些方面和甚至相關(guān)的臨床發(fā)現(xiàn)。
[0324] 最普遍的T細(xì)胞淋巴瘤是外周T細(xì)胞淋巴瘤，非特指型（PTCL-N0S)，包括總體的 25%，接著是血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤(AITL) (18.5% )。
[0325] 外周T細(xì)胞淋巴瘤，非特指型(PTCL-N0S)
[0326] ?了(^403構(gòu)成所有外周1'細(xì)胞淋巴瘤和疆/1'細(xì)胞淋巴瘤的超過25%且是最常見的 亞型。其通過排除診斷確定，不對應(yīng)在目前WHO 2008中列出的任意特定成熟T細(xì)胞淋巴瘤實 體。因此其類似于彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤，非特指型(DLBCL-N0S)。
[0327] 大多數(shù)患者是成年人，其中中位數(shù)年齡為60且男性比女性比率2:1。大部分的病例 是結(jié)(nodal)起源的，然而，結(jié)外表現(xiàn)發(fā)生于約13%的患者中，最常見涉及皮膚和胃腸道。 [0328]該細(xì)胞學(xué)范圍非常廣，范圍從多形的到單形的。已經(jīng)描述了三種形態(tài)學(xué)上定義的 變體，包括淋巴上皮樣(Lennert)變體，T-區(qū)變體和濾泡變體。PTCL的淋巴上皮樣變體含有 豐富的背景上皮樣組織細(xì)胞且通常是⑶8陽性的。其已經(jīng)與較好的預(yù)后相關(guān)。PTCL-N0S的濾 泡變體正在成為潛在的獨特臨床病理學(xué)實體。
[0329] 大部分PTCL-N0S具有成熟的T細(xì)胞表型且大多數(shù)病例是⑶4陽性的。75 %的病例表 現(xiàn)出至少一種全Τ細(xì)胞標(biāo)志物(CD3，CD2，CD5或⑶7)的可變?nèi)笔В渲孝?和⑶5是經(jīng)常下調(diào) 的。可以表達(dá)⑶30和罕見地⑶15,其中⑶15是不利的預(yù)后特征。盡管不常見，CD56的表達(dá)也 具有負(fù)面的預(yù)后影響。另外的不利病理預(yù)后診斷因素包括基于ΚΙ-67表達(dá)的大于25%的增 殖速率，和大于70%的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的存在。這些淋巴瘤的免疫表型分析提供很少的對它們生 物學(xué)的了解。
[0330] 血管免疫母細(xì)胞Τ細(xì)胞淋巴瘤(AITL)
[0331] AITL是系統(tǒng)性疾病，特征在于涉及淋巴結(jié)的多形性浸潤，突出的高內(nèi)皮靜脈(HEV) 和濾泡狀樹突細(xì)胞(FDC)網(wǎng)狀組織的血管周圍擴(kuò)張。認(rèn)為AITL是來源于濾泡輔助型(??Η)αβ Τ細(xì)胞的從頭(de-n 〇V〇)T細(xì)胞淋巴瘤，通常發(fā)現(xiàn)于生發(fā)中心。
[0332]在外周T細(xì)胞淋巴瘤和NK/T細(xì)胞淋巴瘤中，AITL是第二常見的實體，構(gòu)成病例的約 18.5%。其在中年至老年成人中發(fā)生，其中中位數(shù)年齡為65歲齡，并在男性和女性中約相等 的發(fā)病率。臨床上，患者通常具有晚期階段疾病，具有全身性淋巴結(jié)病，肝脾腫大和突出的 全身癥狀。通常存在皮疹及關(guān)聯(lián)的瘙癢。通常存在與自身免疫現(xiàn)象有關(guān)的多克隆高球蛋白 血癥。
[0333] AITL中描述了三種不同的形態(tài)學(xué)模式。AITL的早期病變(模式I)通常表現(xiàn)出保守 的架構(gòu)，具有特征性增生性濾泡。贅生性增殖定位于濾泡的外圍。在模式II中，結(jié)節(jié)構(gòu)架部 分被消除，保留少數(shù)的退化濾泡。被膜下淋巴竇得到保留甚至擴(kuò)張。副皮質(zhì)區(qū)含有樹枝狀的 HEV且存在B細(xì)胞濾泡外的FDC增殖。贅生性細(xì)胞為小至中等大小，具有最小的細(xì)胞學(xué)異型性 (cytologicatypia)。它們通常具有清澈到暗淡的細(xì)胞質(zhì)，并可以表現(xiàn)出不同的T細(xì)胞膜。多 形性炎癥背景通常是明顯的。
[0334]盡管AITL是T細(xì)胞惡性腫瘤，但存在B細(xì)胞和漿細(xì)胞的特征性擴(kuò)增，其可能反映了 贅生性細(xì)胞作為TFH細(xì)胞的功能。EBC陰性和EBV陽性B細(xì)胞兩者都存在。偶爾，非典型的B細(xì) 胞可以在形態(tài)學(xué)上和免疫表型上類似霍奇金/里德-斯特恩伯格樣細(xì)胞，有時導(dǎo)致與該實體 的診斷混淆。AITL中的B細(xì)胞增殖可以是廣泛的，且一些患者形成了次級EBV陽性的彌散性 大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)或更罕見地EBV陰性的B細(xì)胞腫瘤，通常伴隨漿細(xì)胞分化。
[0335] AITL的贅生性⑶4陽性T細(xì)胞表現(xiàn)出⑶10和⑶279(ro-l)的強(qiáng)表達(dá)和CXCL13陽性。 通過對HEV的粘附，B細(xì)胞活化，漿細(xì)胞分化和roc網(wǎng)狀組織的擴(kuò)張，CXCL13引起增加的B細(xì)胞 向淋巴結(jié)募集，這些都有助于aitl的形態(tài)學(xué)和臨床特征。濾泡周圍的腫瘤細(xì)胞中強(qiáng)烈的ro-1表達(dá)在區(qū)分AITL模式I與反應(yīng)性濾泡及副皮質(zhì)增生中是特別有用的。
[0336] PTCL-N0S的濾泡變體是具有??Η表型的另一種實體。與AITL對比，其不具有突出的 HEV或roc網(wǎng)狀組織的濾泡外擴(kuò)張。贅生性細(xì)胞可以形成濾泡內(nèi)聚集，模擬B細(xì)胞濾泡淋巴 瘤，而且還可以具有濾泡間生長模式或涉及擴(kuò)增的外套層(mantle zone)。臨床上，PTCL-N0S的濾泡變體與AITL不同，因為患者更經(jīng)常表現(xiàn)為部分淋巴結(jié)受累的早期疾病且可以缺 乏與AITL相關(guān)的全身癥狀。
[0337] 漸變性大細(xì)胞淋巴瘤(ANAPLASTIC LARGE CELL LYMPH0MA，ALCL)
[0338] ALCL可以細(xì)分為ALCL-"漸變性淋巴瘤激酶"（ALK)+或ALCL-ALK-。
[0339] ALCL-ALK+是外周T細(xì)胞淋巴瘤中被最好地定義的實體之一，特征性的"標(biāo)志細(xì)胞" 攜帶馬蹄鐵形核并表達(dá)ALK和CD30。其占所有外周T細(xì)胞和NK細(xì)胞淋巴瘤的約7%并在生命 的第一個三十年中最常見?；颊咄ǔ１憩F(xiàn)為淋巴結(jié)病，但結(jié)外部位(皮膚，骨，軟組織，肺， 肝)的累及和B癥狀是普遍的。
[0340] ALCL，ALK+表現(xiàn)出廣泛的形態(tài)學(xué)范圍，其中描述了 5種不同的模式，但是所有的變 體含有一些標(biāo)志細(xì)胞。標(biāo)志細(xì)胞具有怪異的馬蹄鐵或腎形核，和突出的核周嗜曙紅高爾基 區(qū)。腫瘤細(xì)胞以黏著的模式生長，具有竇受累的偏好。在小細(xì)胞變體中，較小的腫瘤細(xì)胞占 主導(dǎo)地位，而在淋巴組織細(xì)胞變體中豐富的組織細(xì)胞掩蔽了腫瘤細(xì)胞的存在，所述腫瘤細(xì) 胞中許多是小的。
[0341] 通過定義，所有的病例表現(xiàn)出ALK和⑶30陽性，其中在較小的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)通常 較弱。通常存在全T細(xì)胞標(biāo)志物的缺失，其中75%的病例缺乏⑶3的表面表達(dá)。
[0342] ALK表達(dá)是由染色體2p23上的ALK基因向許多配對基因之一重排組成的特征性復(fù) 發(fā)性遺傳改變的結(jié)果，導(dǎo)致嵌合蛋白的表達(dá)。最常見的配對基因，在75%的病例中發(fā)生，是 染色體5q35上的核仁磷酸蛋白（NPM1)，導(dǎo)致t (2; 5) (p23; q35)。在不同的轉(zhuǎn)位變體中，ALK的 細(xì)胞分布可以根據(jù)配對基因而變化。
[0343] ALCL-ALK-在2008WH0分類中被納入臨時類別。其定義為⑶30陽性T細(xì)胞淋巴瘤，其 形態(tài)學(xué)上不能與具有黏著生長模式的ALCL-ALK+區(qū)分，并存在標(biāo)志細(xì)胞，但缺少ALK蛋白表 達(dá)。
[0344] 與ALCL-ALK+(其在兒童和年輕人中更常見）不同，患者通常是年齡在40和65之間 的成年人。ALCL-ALK-可以涉及淋巴結(jié)和結(jié)外組織兩者，但后者比ALCL-ALK+中較不常見。通 過具有典型"標(biāo)志"特征的粘著性贅生性細(xì)胞的層，ALCL-ALK-的大多數(shù)病例表現(xiàn)出淋巴結(jié) 架構(gòu)的消失。與ALCL-ALK+不同，沒有識別小細(xì)胞形態(tài)學(xué)變體。
[0345] 不像其ALK+對應(yīng)物，ALCL-ALK-表現(xiàn)出更大的對表面T細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的保留，而 細(xì)胞毒性標(biāo)志物和上皮膜抗原(EMA)的表達(dá)較不可能。ALCL-ALK-和ALCL-ALK+中的基因表 達(dá)標(biāo)簽（signature)和復(fù)發(fā)性染色體不平衡不同，確認(rèn)了它們是分子水平和遺傳水平的不 同實體。
[0346] ALCL-ALK-在臨床上與ALCL-ALK+和PTCL-N0S兩者不同，其中在這三種不同的實體 中預(yù)后存在顯著差異。ALCL-ALK-的5年總體存活報道為49 %，其不像ALCL-ALK+(為70 % ) - 樣好，但同時比PTCL-N0S(32 % )明顯更好。
[0347] 腸病相關(guān)的T細(xì)胞淋巴瘤(EATL)
[0348] EATL是侵襲性的贅生物，認(rèn)為其來源于腸的上皮內(nèi)T細(xì)胞。2008WH0分類中認(rèn)證了 兩種形態(tài)學(xué)上，免疫組織化學(xué)和遺傳學(xué)上不同類型的EATL:I型(代表了大多數(shù)的EATL)和II 型(構(gòu)成10-20 %的病例）。
[0349] I型EATL通常與明顯的或臨床上無癥狀的麩質(zhì)敏感性腸病相關(guān)，且在北歐出身的 患者中由于該群體中腹腔疾病的高發(fā)病率而更常見。
[0350] 最常見地，EATL的病變存在于空腸或回腸(90%的病例），其中罕見表現(xiàn)在十二指 腸，結(jié)腸，胃，或胃腸道外的區(qū)域中。腸病變通常是多病灶的，伴有黏膜性潰瘍。EATL的臨床 過程是侵襲性的，其中大多數(shù)患者在1年內(nèi)死于疾病或疾病的并發(fā)癥。
[0351] EATL I型的細(xì)胞學(xué)譜是廣泛的，且一些病例可以含有漸變性(anaplastic)細(xì)胞。 存在多形性炎癥背景，其可以在某些病例中掩蓋贅生性組分。腫瘤臨近區(qū)域中的腸黏膜通 常表現(xiàn)出腹腔疾病的特征，具有絨毛的鈍化和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量(IEL)的增加，其可以代 表損傷前體細(xì)胞。
[0352] 通過免疫組織化學(xué)，贅生性細(xì)胞通常是CD3+CD4-CD8-CD7+CD5-CD56-0F1+，并含有 細(xì)胞毒性顆粒相關(guān)蛋白（TIA-1，粒酶B，穿孔蛋白）XD30部分表達(dá)在幾乎所有的病例中。 ⑶103,其是黏膜歸巢受體，可以在EATL中表達(dá)。
[0353] II型EATL，也稱為單型⑶56+腸 T細(xì)胞淋巴瘤，定義為由小和中等大小單型T細(xì)胞組 成的腸腫瘤，所述T細(xì)胞表達(dá)CD8和CD56兩者。通常存在腫瘤在黏膜內(nèi)的橫向擴(kuò)散，而沒有炎 性背景。大多數(shù)病例表達(dá)Y STCR，然而存在與αβτα?相關(guān)的病例。
[0354] Π 型EATL具有更比I型EATL更多的世界廣泛分布，并通常在亞裔或西班牙裔人群 中看到，其中腹腔病是罕見的。在歐洲血統(tǒng)EATL的個體中，II代表了腸 Τ細(xì)胞淋巴瘤的約 20 %，在病例的至少一個亞群中具有腹腔病的歷史。臨床過程是侵襲性的。
[0355] 肝脾Τ細(xì)胞淋巴瘤(HSTL)
[0356] HSTL是一種侵襲性系統(tǒng)贅生物，通常來源于內(nèi)在免疫系統(tǒng)的γ δ細(xì)胞毒性Τ細(xì)胞， 然而，在罕見的病例中其也可以來源于αβΤ細(xì)胞。它是最罕見的Τ細(xì)胞淋巴瘤的一種，并通常 以較強(qiáng)的男性主導(dǎo)性影響青少年和青年（中位數(shù)年齡，35歲）。
[0357] 結(jié)外ΝΚ/Τ細(xì)胞淋巴瘤鼻型
[0358]結(jié)外ΝΚ/Τ細(xì)胞淋巴瘤鼻型是侵襲性的疾病，通常具有破壞性的中線病變和壞死。 大多數(shù)病例是ΝΚ細(xì)胞衍生的，但一些病例來源于細(xì)胞毒性Τ細(xì)胞。其普遍地與埃巴病毒 (EBV)相關(guān)。
[0359]皮膚Τ細(xì)胞淋巴瘤
[0360]本發(fā)明的方法也可以用于治療皮膚Τ細(xì)胞淋巴瘤。
[0361]皮膚Τ細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)特征在于惡性Τ細(xì)胞向皮膚的迀移，其導(dǎo)致出現(xiàn)各種損 傷。這些損傷隨著疾病的進(jìn)展改變形狀，通常開始于表現(xiàn)為疹，并且最終形成斑和腫瘤，之 后轉(zhuǎn)移至身體的其它部位。
[0362] 皮膚Τ細(xì)胞淋巴瘤包括以下說明性的，非窮舉列表中提到的那些：蕈樣肉芽腫病 (mycosis fungoides)，佩吉特樣網(wǎng)狀細(xì)胞增多癥(pagetoid reticulosis)，塞扎里綜合癥 (S6zary syndrome)，肉芽腫性皮膚松弛(granulomatous slack skin)，淋巴瘤樣丘疹病 (lymphomatoid papulosis)，慢性苔癬樣糖疼（pityriasislichenoideschronica)，CD30+ 皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，繼發(fā)性皮膚CD30+大細(xì)胞淋巴瘤，非蕈樣肉芽腫CD30-皮膚大T細(xì)胞淋巴 瘤，多形性Τ細(xì)胞淋巴瘤（pleomorphic T-cel 1 lymphoma)，倫納特淋巴瘤（Lennert lymphoma)，皮下T細(xì)胞淋巴瘤和血管中心性淋巴瘤(angiocentric lymphoma)。
[0363] CTCL的征兆和癥狀根據(jù)特定的疾病不同，其中兩種最常見的類型是蕈樣肉芽腫病 和塞扎里綜合癥。典型的蕈樣肉芽腫病分為三個階段：
[0364]斑點(Patch)(萎縮性或非萎縮性）：非特異性皮炎，下軀干和臀部上的斑點；最小/ 沒有瘙癢；
[0365]斑塊(Plaque):強(qiáng)烈的瘙癢斑塊，淋巴結(jié)病;和
[0366]腫瘤:容易發(fā)生潰瘍。
[0367]塞扎里綜合癥由紅皮病和白血病定義。征兆和癥狀包括皮膚水腫，淋巴結(jié)病，手掌 和/或足底角化過度，脫發(fā)，指甲營養(yǎng)不良，瞼外翻(ectropion)和肝脾腫大。
[0368]在所有的原發(fā)性皮膚淋巴瘤中，65%是T細(xì)胞類型的。最常見的免疫表型是⑶4陽 性。對于這些疾病沒有共同的病理生理學(xué)，因為術(shù)語皮膚T細(xì)胞淋巴瘤包含了極其多種的病 癥。
[0369] 皮膚Τ細(xì)胞淋巴瘤（即蕈樣肉芽腫病）的形成的主要病因機(jī)制尚未闡明。蕈樣肉芽 腫病之前可以有Τ細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性皮膚疾病，其可以偶爾發(fā)展為致命的淋巴瘤。
[0370] 原發(fā)性皮膚 ALCL(C-ALCL)
[0371] C-ALCL通常不能通過形態(tài)學(xué)與ALC-ALK-區(qū)分。其定義為具有漸變性，多形性，或免 疫母細(xì)胞形態(tài)的大細(xì)胞的皮膚腫瘤，其中多于75%的細(xì)胞表達(dá)CD30。與淋巴瘤樣丘疹病 (LyP)-起，C-ALCL屬于原發(fā)性皮膚⑶30陽性T細(xì)胞淋巴增生性病癥的范圍，其以組包括蕈 樣肉芽腫病之后第二普遍的皮膚T細(xì)胞淋巴增生的組。
[0372] 免疫組織化學(xué)染色概況與ALCL-ALK-相當(dāng)相似，其中較大比例的病例對于細(xì)胞毒 性標(biāo)志物染色呈陽性。至少75%的腫瘤細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是⑶30陽性的。也可以表達(dá)⑶15,且當(dāng)淋巴 結(jié)受累發(fā)生時，與典型霍奇金淋巴瘤的區(qū)分可以是困難的。ALCL-ALK+的罕見病例可以表現(xiàn) 為局部的皮膚病變，并可以類似C-ALCL。
[0373] T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病
[0374] T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病(Τ-ALL)分別占所有兒童和成人群體的ALL的約15% 和25%?；颊咄ǔ＞哂懈甙准?xì)胞計數(shù)并且可以表現(xiàn)為臟器腫大，特別是縱隔擴(kuò)大和CNS受 累。
[0375] 本發(fā)明的方法可以用于治療T-ALL，其與表達(dá)包含TRBC的TCR的惡性T細(xì)胞相關(guān)。
[0376] T細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病
[0377] T細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病（T-cell-prolymphocytic leukemia,Τ-PLL)是具有侵襲 行為的成熟T細(xì)胞白血病，并對于血液，骨髓，淋巴結(jié)，肝，脾和皮膚受累具有偏好。T-PLL主 要影響超過30歲的成人。其它名字包括T細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病，"多瘤(knobby)"型T細(xì) 胞白血病，和T-幼淋巴細(xì)胞白血病/T細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病。
[0378] 在外周血中，T-PLL由中等大小的淋巴細(xì)胞組成，具有單個核和嗜堿性胞質(zhì)，偶爾 具有泡或突出。核通常是圓形到橢圓形形狀，其中偶爾患者具有更不規(guī)則核輪廓的細(xì)胞，所 述核輪廓與塞扎里綜合癥中看到的腦狀核形相似。小細(xì)胞變體構(gòu)成所有T-PLL病例的20%， 而塞扎里細(xì)胞樣(腦狀)變體在5%的病例中見到。
[0379] T-PLL具有成熟（胸腺后）T淋巴細(xì)胞的免疫表現(xiàn)，且贅生性細(xì)胞通常對于全T抗原 ⑶2,⑶3和⑶7陽性并對于TdT和⑶la陰性。免疫表型⑶4+/⑶8-存在于60%的病例中，⑶4+/ ⑶8+免疫表型存在于25%，而⑶4-/⑶8+免疫表型存在于15%的病例中。
[0380] 藥物組合物
[0381] 本發(fā)明的方法可以包括施用藥物組合物形式的試劑的步驟。
[0382] 試劑可以與藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑，賦形劑或佐劑一起施用。藥學(xué)載體，賦 形劑或稀釋劑的選擇可以關(guān)于預(yù)定的施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)藥實踐選擇。作為載體，賦形劑 或稀釋劑(在載體，賦形劑或稀釋劑外），藥物組合物可以包括任意適合的結(jié)合劑，潤滑劑， 懸浮劑，包被劑，增溶劑，和其它載體試劑。
[0383] 施用
[0384] 試劑的施用可以使用多種途徑的任一種完成，所述途徑使得活性成分生物可利 用。例如，可以通過□服和腸胃外途徑，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，經(jīng)皮，肌肉內(nèi)，經(jīng)由局部遞送 例如通過導(dǎo)管或支架實現(xiàn)試劑的施用。
[0385] 典型地，內(nèi)科醫(yī)生將確定對于個體受試者最適合的實際劑量，并它將隨著具體患 者的年齡，體重和反應(yīng)而變化。試劑是使得其足以降低或耗竭表達(dá)TRBC1或TRBC2的克隆性T 細(xì)胞的數(shù)量。
[0386] 用途
[0387] 本發(fā)明還提供試劑，用于根據(jù)第一個方面的方法治療T細(xì)胞淋巴瘤中的用途。試劑 可以是上文定義的任意試劑。
[0388] 本發(fā)明還涉及如上文定義的試劑在制備用于根據(jù)第一個方面的方法治療T細(xì)胞淋 巴瘤的藥物中的用途。
[0389] 試劑盒
[0390] 本發(fā)明進(jìn)一步提供包含如上文所定義的試劑的試劑盒，用于根據(jù)第一個方面的方 法治療T細(xì)胞淋巴瘤中的用途。
[0391] 試劑盒還可以包含適合用于確定惡性T細(xì)胞的TRBC的試劑。例如，試劑盒可以包含 對于TRBC1或TRBC2特異性的PCR引物或抗體。
[0392] 用于確定T細(xì)胞淋巴瘤和/或白血病的方法
[0393] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于確定受試者中T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括確定 來自受試者的樣品中TRBC1或TRBC2陽性的T細(xì)胞比例的步驟。
[0394] T細(xì)胞淋巴瘤涉及個體惡性T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增。因此，可以通過確定來源于患者 的樣品中TRBC1或TRBC2T細(xì)胞的比例鑒定受試者中T細(xì)胞淋巴瘤的存在。
[0395] 樣品可以是外周血樣品，淋巴樣品或直接取自腫瘤的樣品，例如活組織檢查樣品。
[0396] TRBC1或TRBC2陽性的總T細(xì)胞的比例（其指示T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的存在）可以 是例如細(xì)胞總?cè)后w的80，85，90，95，98或99%。
[0397] 方法可以涉及通過活組織檢查或樣品中T細(xì)胞的不同群體確定浸潤。本文中，樣品 中T細(xì)胞總?cè)后w的80，85，90，95，98或99 %是TRBC1或TRBC2的情況下，指示T細(xì)胞淋巴瘤或白 血病的存在。
[0398] 可以通過確定樣品中表達(dá)⑶3，⑶4，⑶8和/或⑶45的細(xì)胞的數(shù)量，確定樣品中的總 T細(xì)胞。也可以使用這些標(biāo)志物的組合。
[0399] 可以使用本領(lǐng)域已知的方法確定樣品中表達(dá)TRBC 1或TRBC2的總T細(xì)胞的比例，例 如流式細(xì)胞術(shù)，免疫組織化學(xué)或熒光顯微術(shù)。
[0400] 本發(fā)明將通過實施例的方式進(jìn)一步描述，其是為了起到幫助本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員實施本發(fā)明，而不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 實施例
[0401 ] 實施例1-區(qū)分表達(dá)TRBC1和TRBC2的細(xì)胞
[0402] J0VI抗體先前已經(jīng)由Viney等人公開(Hybridoma; 1992; 11(6) ;701_713)且是商品 化的(Abcam，ab5465)。本發(fā)明人確定了 J0VI-1能夠基于TRBC1或TRBC2的特異性表達(dá)區(qū)分細(xì) 胞。
[0403]本發(fā)明人生成了提供TCR的完全可變和恒定區(qū)的兩種質(zhì)粒載體，其差異僅在于 TRBC1或TRBC2的表達(dá)。這些質(zhì)粒用于通過293T-細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染生成逆轉(zhuǎn)錄病毒上清。該上 清用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)Jurkats TCR敲除T細(xì)胞(在TCRbeta鏈基因座處具有突變的T-ALL細(xì)胞系， 所述突變阻止該鏈的表達(dá)，從而整個表面TCR/CD3復(fù)合物的表達(dá)）。這導(dǎo)致除了 TRBC1或 TRBC2的表達(dá)外相同的細(xì)胞系的生成。這些細(xì)胞系的染色揭示表面TCR/CD3復(fù)合物的充分表 達(dá)，且僅表達(dá)TRBC1的細(xì)胞使用J0VI-1抗體染色（圖4)。
[0404] 實施例2-正常供體⑶4+和⑶8+T細(xì)胞含有不同的TRBC1陽性和TRBC-1陰性群體
[0405]發(fā)明人在正常供體的原代人T細(xì)胞上測試了 J0VI-1抗體。這些分析揭示了所有的 供體具有一定比例的表達(dá)TRBC1的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞兩者和一定比例的不表達(dá)TRBC1的每 種。約20-50 %的正常CD4+和CD8+T細(xì)胞是TRBCl+ve (圖6和7)。
[0406] 實施例3-表達(dá)TCR的克隆性T細(xì)胞系是TRBC1陽性或陰性的
[0407] 細(xì)胞系來源于患者中原始克隆性腫瘤群體。表達(dá)TCR的T細(xì)胞系的染色揭示T細(xì)胞 表達(dá)TRBC1或TRBC2,確定了這作為克隆性的標(biāo)志物。在測試的三種T細(xì)胞系中，Jurkats細(xì)胞 (已知為TRBC1+)而不是HPB-ALL或HD-Mar-2 (已知為TRBC2+)細(xì)胞被J0VI-1染色，支持TRBC1 或2的排他性表達(dá)(圖8)。
[0408]實施例4-患有T幼淋巴細(xì)胞白血病的患者中的原代克隆性T細(xì)胞是TRBC1陽性或陰 性的
[0409 ] -致地，從患有T幼淋巴細(xì)胞白血病（T-PLL)的患者的外周血提取的克隆性T細(xì)胞 是TRBC1陽性或TRBC1陰性。
[0410]實施例5-對于TCBC1獨特的殘基的突變效果
[0411]生成了編碼除了TCRi3鏈恒定區(qū)中的雜交TRBC1/2突變外相同的TCR的質(zhì)粒載體。分 析表明，J0VI-1識別TCRi3恒定鏈位置3和4處的殘基的差異，表明這些殘基對于抗體識別是 可接近的，且可能是生成區(qū)分TRBC1與TRBC2或TRBC2與TRBC1的試劑的最好靶點（圖5)。
[0412] 實施例6-對表達(dá)TRBC1而不是TRBC2TCR的T細(xì)胞的特異性溶解
[0413] 將野生型Jurkat T細(xì)胞(CD34-，TRBC1+)與使用和CD34標(biāo)志物基因共表達(dá)的TRBC2 轉(zhuǎn)導(dǎo)的ΤΟ?αβ敲除Jurkat T細(xì)胞(CD34+TRBC2+)混合。將這些細(xì)胞與J0VI-1單獨孵育，或與 J0VI1和補(bǔ)體孵育1小時。洗滌細(xì)胞并對于CD34，膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色。通過流式細(xì)胞術(shù)分 析細(xì)胞。
[0414] 如通過膜聯(lián)蛋白-V陰性和71AAD暗淡群體限定的活群體中⑶34表達(dá)示于圖9中。觀 察到了對TRBC1T細(xì)胞(⑶34-)的選擇性殺傷（圖9)。
[0415] 野生型Jurkat T細(xì)胞是天然TRBC1+且不表達(dá)截短的⑶34標(biāo)志物基因。如上文所 述，本發(fā)明人通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)τα?αβ敲除的Jurkat T細(xì)胞衍生TRBC2+Jurkat 系，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼TRBC2TCR以及截短的CD34標(biāo)志物基因。然后將這些T細(xì)胞混合 在一起。接著，本發(fā)明人將該T細(xì)胞與J0VI-1單獨或與J0VI1和補(bǔ)體孵育1小時。便利地，本發(fā) 明人可以通過⑶34標(biāo)志物基因的染色區(qū)分TRBC1和2群體，并從而避免無法檢測TRBC1TCR (由于長時間暴露于抗TCR mAb的TCR內(nèi)化）。洗滌細(xì)胞并對于CD34，膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色。 通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。通過在活細(xì)胞（即，膜聯(lián)蛋白V陰性和7-AAD暗淡的細(xì)胞)上設(shè)門， 本發(fā)明人可以確定在補(bǔ)體的存在下，TRBC1T細(xì)胞被J0VI-1選擇性殺傷(圖9)。
[0416] 實施例7-多克隆埃巴病毒(EBV)特異性T細(xì)胞可以分為兩個大約相等的TRBC1/2群 體
[0417] 從正常血液供體取出外周血T細(xì)胞。分離了單核細(xì)胞且大多數(shù)的細(xì)胞冷藏保存。使 用EBV的實驗室株(B95-8)感染少量細(xì)胞。幾周里，永生化的EBV感染的細(xì)胞系，稱為成淋巴 細(xì)胞樣細(xì)胞系(LCL)出現(xiàn)。此類細(xì)胞系已知呈遞大量不同的EBV抗原。將先前冷藏保存的單 核細(xì)胞解凍并在IL2的存在下重復(fù)地使用該LCL系每周刺激持續(xù)4周。該過程從外周血單核 群體選擇性擴(kuò)增EBV特異性T細(xì)胞。還已知此類過程導(dǎo)致多克隆系，其中>90 %的T細(xì)胞為EBV 特異性并代表了供體的EBV免疫系統(tǒng)。通過表現(xiàn)出高程度殺傷自體LCL而非異體LCL或K562 細(xì)胞，檢查了該系的特異性（圖l〇a)。接著使用JOVI-1染色該細(xì)胞系并表明含有TRBC1和 TRBC2T細(xì)胞的大致相等混合物（圖10b)。
[0418]因此，如果施用耗竭TRBC1或TRBC2區(qū)室的治療劑，那么將保留足夠的EBV免疫力。 由于EBV免疫力認(rèn)為是免疫應(yīng)答的模式系統(tǒng)，假設(shè)合理假定對其它病原體的免疫力將得到 同等保留。
[0419]實施例8-循環(huán)外周τ細(xì)胞淋巴瘤的J0VI-1染色
[0420]假說是T細(xì)胞淋巴瘤(為克隆性的）將表達(dá)TRBC1或TRBC2T細(xì)胞受體，而多克隆的正 常T細(xì)胞將包含T細(xì)胞的群體，所述T細(xì)胞為具有TRBC1或TRBC2的那些的混合物。為了證明這 個，獲得了來自患者的T細(xì)胞淋巴瘤的血液樣品，所述患者的淋巴瘤為外周血中循環(huán)的。分 離了外周血單核細(xì)胞并使用一組抗體染色，其包括CD5和J0VI1。首先鑒定了總T細(xì)胞群體 (其含有淋巴瘤和正常T細(xì)胞兩者）。該群體由具有正常（明亮)CD5表達(dá)的T細(xì)胞和具有中等/ 暗淡CD5表達(dá)的T細(xì)胞組成。前者代表了正常T細(xì)胞，而后者代表了淋巴瘤。接著，調(diào)查了 J0VI-1結(jié)合且結(jié)果示于圖12中。
[0421] CD5中等和暗淡群體(腫瘤)都為TRBC2陽性。
[0422] 實施例9-闡明J0VI-1的VH/VL序列
[0423] 使用5'RACE用與小鼠 IgG CH1的恒定區(qū)和小鼠 kappa的恒定區(qū)退火的引物，我們從 雜交瘤J0VI-1分離了單個功能性VH序列和單個功能性VL序列。VH和VL的序列分別為SEQ ID 1和2(見上文hVH和VL注釋的序列示于圖11中。
[0424] 將這些VH和VL序列分別與小鼠 IgG重鏈和kappa輕鏈以符合讀碼框的方式克隆回 去。另外，將VH和VL融合以形成單鏈可變片段（scFv)，將這融合到小鼠 IgG2a的鉸鏈-CH2-CH3區(qū)以創(chuàng)建scFV-FV。scFV的氨基酸序列在發(fā)明詳述中作為SEQIDNo.3給出。通過轉(zhuǎn)染到 293T細(xì)胞中，生成了重組抗體和重組scFv-Fc。與來自雜交瘤的J0VI-1-起，對以下細(xì)胞進(jìn) 行了染色：具有TCR敲除的Jurkats ;野生型Jurkats ;使用與eBFP2共表達(dá)的TRBC1轉(zhuǎn)導(dǎo)的 Jurkat TCR敲除和使用與eBFP2共表達(dá)的TRBC2轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat TCR敲除。來源于J0VI的重組 抗體和scFv-Fc兩者都結(jié)合TRBC2，確認(rèn)了我們鑒定了正確的VH/VL，且J0VI-1VH/VL可以折 疊為scFv。該結(jié)合數(shù)據(jù)示于圖13中。
[0425] 實施例10-基于J0VI-1的CAR的功能
[0426] 將JOVI-lscFv克隆到CAR形式中。為了闡明哪種間隔區(qū)長度將產(chǎn)生最優(yōu)的基于 J0VI-1的CAR，使用人Fc間隔區(qū)，人⑶8莖部間隔區(qū)或來源于IgGl鉸鏈的間隔區(qū)生成了第三 代CAR(圖4)。使用這些CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)來自正常供體的原代人T細(xì)胞并比較對Jurkats和TRC敲除的 Jurkats的殺傷。具有JOVI-lscFv的CAR(其具有IgGl鉸鏈間隔區(qū)或CD8莖部間隔區(qū)）殺傷 Jurkats而不殺傷TCR敲除的Jurkats (圖5 )，證明了預(yù)期的特異性。由于使用CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的正常 供體T細(xì)胞應(yīng)當(dāng)具有TRB1/2T細(xì)胞的混合物，預(yù)期該培養(yǎng)物將"自凈化(self-purge)"。事實 上，觀察到了這點。圖6中示出了 CAR T細(xì)胞培養(yǎng)物的J0VI-1染色，其成為100 % TRBC2陰性 的。
[0427] 材料和方法
[0428] 證明J0VI-1的特異性
[0429]生成了三順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒盒（cassette)，其編碼良好表征的人TCR以及便利的 標(biāo)志物基因。使用從頭基因合成從重疊的寡核苷酸生成了TCRa和β鏈的編碼序列。將這些鏈 以符合讀碼框的方式與口蹄疫2Α肽連接以允許共表達(dá)。通過PCR從cDNA克隆截短的CD34標(biāo) 志物基因并使用內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列（IRES)與TCR共表達(dá)。將該盒引入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。 通過重疊 PCR，使用引入所需突變的引物，通過剪接生成了該構(gòu)建體的變體。通過Sanger測 序確認(rèn)了構(gòu)建體的準(zhǔn)確性(>6抑〇;^)。]\^1^76系是良好表征的]\^士11:1'細(xì)胞系衍生物， 其具有TCRa和β鏈兩者敲除。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用以上逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)該Jurkat系。
[0430] Jurkats，外周血T細(xì)胞和細(xì)胞系的染色和分析
[0431] 從ECACC獲得了 Jurkats并如上文詳細(xì)描述的那樣工程化改造。其它T細(xì)胞系也從 ECACC獲得。外周血通過靜脈穿刺從正常供體抽取。血液經(jīng)蔗聚糖處理(ficolled)以分離單 核細(xì)胞。細(xì)胞使用J0VI-1以及識別所有TCR和CD3的商品化單克隆抗體染色。在工程化T細(xì)胞 的情況下，細(xì)胞使用識別CD34的抗體染色。在外周血單核細(xì)胞的情況下，細(xì)胞使用識別CD4 和CD8的抗體染色。購買的抗體與適合的熒光團(tuán)綴合，使得使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞同時可 以獲得獨立的熒光信號。
[0432] 證明對TRBC1T細(xì)胞的特異性溶解
[0433] 將野生型Jurkat T細(xì)胞（TRBC1-TCR)和具有引入的TRBC2TCR的JurkatT細(xì)胞TCR K0以1:1的比率混合在一起。接著，在補(bǔ)體的存在或不存在下將Jurkat的該混合物與lug/ml 的J0VI-1單克隆抗體孵育。四小時后，細(xì)胞使用膜聯(lián)蛋白-V和7AAD和CD34染色。便利地，標(biāo) 志物基因 CD34可以區(qū)分野生型（TRBC1)和轉(zhuǎn)基因（TRBC2)Jurkats。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì) 胞群體。通過在流式細(xì)胞事件上設(shè)門選擇性研究活細(xì)胞，所述事件為對于膜聯(lián)蛋白-V呈陰 性和對于7AAD呈暗淡。以這種方式，研究了轉(zhuǎn)基因（TRBC2)對野生型(TRBC1) T細(xì)胞的存活。
[0434] 實施例11-調(diào)查T細(xì)胞淋巴增殖性病癥的克隆性
[0435] 測試了四位患者:三位患有T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞淋巴增殖性病癥(T-LGL);和一 位患有外周T細(xì)胞淋巴瘤(PCTL)以確認(rèn)惡性細(xì)胞一致為TRBC1陽性或陰性。
[0436] 從患有T淋巴細(xì)胞增生性病癥的患者收集了全血或骨髓。通過蔗聚糖(Ficoll)梯 度離心分離獲得外周血單核細(xì)胞。新鮮獲得的PBMC形成團(tuán)塊(pelleted)并使用適合的預(yù)綴 合抗體染色20分鐘。接著，洗滌細(xì)胞并在磷酸鹽緩沖鹽水中重懸用于在BD LSR Fortessa II上立即流式細(xì)胞分析。通過FSc/SSc特性和未能攝取死細(xì)胞區(qū)分染料鑒定活淋巴細(xì)胞。通 過使用抗TCRalpha/beta抗體染色鑒定T細(xì)胞?；谕ㄟ^臨床實驗室分析先前鑒定的免疫表 型，對每個樣品使用適合的細(xì)胞表面染劑鑒定腫瘤和正常T細(xì)胞群體。
[0437] 結(jié)果示于圖18至21。
[0438] 在患者A(T-LGL，圖18)中，正常T細(xì)胞為⑶7明亮且含有混合的⑶4/CD8細(xì)胞，和 TRBC1或TRBC1-細(xì)胞的混合群體。相比之下，惡性細(xì)胞為⑶7-或⑶7暗淡，一致為⑶8+⑶4-， 且一致為TRBC1-。
[0439] 在患者B(T-LGL，圖19)中，通過CD4-，CD8+，CD7+CD57+鑒定惡性細(xì)胞，且為克隆性 的TRBC1-(高亮的小圖）。正常CD4+CD8-和CD4-CD8+T細(xì)胞含有TRBC1+和TRBC1-群體。
[0440] 在患者C(T-LGL，圖20)中，正常CD4+和CD8+T-細(xì)胞群體為30-40%TRBCl +。通過 ⑶4_，⑶8+，⑶7+⑶57+鑒定惡性細(xì)胞并為克隆性的TRBC1 +(高亮的小圖，注意84%的細(xì)胞為 TRBC1-，剩下的16 %似乎是污染性"正常" T細(xì)胞）。正常CD4+CD8-和CD4-CD8+T細(xì)胞含有 TRBC1+和 TRBC1-群體。
[0441] 在患者D(PTCL-N0S，圖21)中，骨髓中的惡性細(xì)胞，基于FSC高⑶5暗淡⑶4暗淡鑒 定，一致為TRBC1+，而CD4+CD8-和CD4-CD8+T細(xì)胞含有TRBC1+和TRBC1-群體兩者。
[0442] 實施例12-使用噬菌體展示生成區(qū)分T細(xì)胞受體β鏈恒定域的兩種同種型的單克隆 人抗體
[0443] 為了生成區(qū)分TRBC2和TRBC1的抗體，合成了覆蓋兩種TRBC同種型之間差異區(qū)域的 肽片段。在TRBC2和TRBC1之間的四個氨基酸差異中，發(fā)現(xiàn)兩個在恒定域的起點。合成了代表 這些區(qū)域的肽(見以下)并用于抗體生成。
[0444] TRBC2VLEDLKNVFPPEVAV(SEQ ID No.36)
[0445] TRBC1VLEDLNKVFPPEVAV(SEQ ID No.37)
[0446] 以生物素化的，非生物素化的，和半胱氨酸修飾的形式(通過添加 C末端半胱氨酸） 制備了這些肽。接著，根據(jù)制備商推薦的條件，將TRBC1和TRBC2的半胱氨酸修飾形式綴合到 經(jīng)修飾的牛血清白蛋白（Imm-Link BSA, Innova 462-001)或卵白蛋白（Imm-Link Ovalbumin, Innova 461-001)。
[0447] 結(jié)果
[0448] 抗體·菌體展示選擇
[0449] 如（Schofield等人，2007Genome Biol 8,R254)所描述的，構(gòu)建了人·菌體展示文 庫并進(jìn)行了噬菌體選擇。為了從抗體文庫鑒定TRBC1和TRBC2特異性抗體，進(jìn)行了多輪噬菌 體展示選擇。平行使用了兩種噬菌體選擇策略，以最大化生成一大組特異性結(jié)合物的機(jī)會。 這些策略稱為固相和溶液相選擇（圖21)。在固相選擇中，允許噬菌體抗體結(jié)合至固定化在 固體表面上的靶抗原(Schofield等人，2007，如上文）。在溶液相選擇中，噬菌體抗體結(jié)合溶 液中的生物素化的抗原，然后通過鏈霉親合素或中性親合素包被的順磁珠捕獲噬菌體抗 體-抗原復(fù)合物。在固相選擇策略中，采用了兩種不同的固定化或抗原呈現(xiàn)方法。使用第一 種方法，通過直接吸附將綴合有牛血清白蛋白（BSA)或卵白蛋白（0A)的TRBC肽固定化到 Maxisorp?免疫管上。使用第二種方法，將生物素化的TRBC肽間接固定化到用鏈霉親合素或 中性親合素預(yù)包被的Maxisorp?免疫管上。
[0450] 為了選擇對于期望的肽特異性的抗體，所有的選擇在過量的相反肽的存在下進(jìn) 行。例如，所有的TRBC1選擇在10倍摩爾過量的非生物素化的TRBC2的存在下進(jìn)行。該方法稱 為"去選擇(deselection)"且預(yù)期其耗竭識別兩種TRBC肽上共享的表位的抗體，因為這些 優(yōu)先結(jié)合溶液中過量的TRBC2。為了避免富集結(jié)合載體蛋白（BSA或0A)或固定化配對物(來 自Thermo fisher scientific的鏈霉親合素或中性親合素），組合采用兩種策略。
[0451] 第一種策略是在選擇的輪數(shù)之間切換綴合或固定化的配對物。對于直接固定化的 肽，第一輪選擇在BSA-肽上進(jìn)行而對于第2輪使用0A-肽綴合物。相似地，對于第1輪將生物 素化的TRBC肽固定化在鏈霉親合素上，而中性親合素用于第二輪的固定化。
[0452] 第二種策略是通過在第1輪中進(jìn)行"去選擇"以耗竭對綴合/固定化配對物的任意 結(jié)合物的噬菌體庫。對于直接固定化的肽，通過在溶液中10倍摩爾過量的游離BSA存在下進(jìn) 行噬菌體-肽結(jié)合步驟進(jìn)行"去選擇"。在固定化于鏈霉親合素上的生物素化的肽的情況下， 將噬菌體文庫與鏈霉親合素包被的順磁珠預(yù)孵育。在向抗原管添加噬菌體之前去除珠，從 而限制鏈霉親合素結(jié)合物進(jìn)入選擇中。使用的不同選擇條件總結(jié)于圖21中。對于選擇條件 的詳細(xì)信息見表3。
[0453]使用肽或支持蛋白的各自呈現(xiàn)在ELISA中測試了從第2輪選擇輸出制備的多克隆 噬菌體。這包括直接固定化為BSA或0A綴合物的TRBC肽，或間接固定化在鏈霉親合素或中性 親合素上的生物素化的肽。包括的對照蛋白為鏈霉親合素，中性親合素，BSA和不相關(guān)的抗 原。使用小鼠抗Ml3抗體（GE healthcare)，接著是用銪標(biāo)記的抗小鼠 Fc抗體（Perkin Elmers)，使用時間分辨熒光檢測噬菌體結(jié)合(圖22)。該結(jié)果證明了多克隆噬菌體群體對相 應(yīng)TRBC肽的優(yōu)先結(jié)合(如與相反TRBC肽比較）。例如，從TRBC 1選擇制備的多克隆噬菌體表現(xiàn) 出對TRBC1比TRBC2明顯更高的結(jié)合信號，且反之亦然。對固定化或綴合配對物以及不相關(guān) 的抗原存在限制的結(jié)合或無結(jié)合。
[0454] 單鏈抗體(scFv)亞克隆和單克隆篩選
[0455] 將來自第2輪和第3輪選擇輸出的scFv群體亞克隆到pSANG10-3F表達(dá)載體中并轉(zhuǎn) 化到大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中。將1128個個體轉(zhuǎn)化子(564個克隆/TRBC肽)挑取到12x 96 孔培養(yǎng)板中（94個克隆/板)并使用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)抗體表達(dá)。對過夜誘導(dǎo)后分泌到培養(yǎng) 基上清中的重組單克隆抗體測試對固定化于中性親合素包被的NuncMaxisorp? 96孔板上 的生物素化TRBC1和TRBC2的結(jié)合。在從TRBC1選擇篩選的564個克隆中，255個克隆發(fā)現(xiàn)對于 TRBC1特異性（對于TRBC1為>10000TRF單位而對于TRBC2為〈1000TRF單位）。從TRBC2選擇篩 選的564個克隆鑒定了 138個TRBC2特異性結(jié)合物(對于TRBC2為>10000TRF單位而對于TRBC1 為〈2000TRF單位）。圖24示出了從對TRBC1 (圖24A)或TRBC2(圖24B)選擇產(chǎn)生的來自單個96 孔板的代表性結(jié)合概況。使用不同選擇條件生成的特異性結(jié)合物的細(xì)節(jié)總結(jié)于表5中。
[0456] 從TRBC1和TRBC2選擇分別挑取了 142個和138個特異性結(jié)合物用于序列分析和進(jìn) 一步表征。通過Sanger測序使用BigDye? terminator ν3 · 1循環(huán)測序試劑盒（Life technologies)生成了 cherry挑取(cherry-pi eked)克隆的序列。分析了 DNA序列以確定蛋 白序列并鑒定了VH和VL域的CDR。對VH和VL CDR3區(qū)的分析鑒定了74個獨特的TRBC1和42個 獨特的TRBC2克?。ㄆ渲歇毺囟x為VH CDR3和VL CDR3序列的任意組合）JRBC1-特異性克 隆和它們的VH CDR3和VL CDR3序列總結(jié)于以上表1中。TRBC2-特異性克隆和它們的VH CDR3 和VL⑶R3序列總結(jié)于以上表2中。
[0457] 表3A.固相TRBC選擇的細(xì)節(jié)
[0458]
[0459] 表3B.溶液相TRBC選擇的細(xì)節(jié)
[0460]
[0461 ] 表4:選擇輸出數(shù)量 [0462]
[0463]
[0464] 表5:單克隆篩選的細(xì)節(jié)
[0465]
[0466] 實施例13-通過兔的肽免疫的TRBC多克隆抗體產(chǎn)生
[0467] 為了生成區(qū)分TRBC2和TRBC1的抗體，合成了覆蓋兩種TRBC同種型之間差異的主要 區(qū)域的2種肽并用于兔的免疫。使用了以下肽序列：
[0468] TRBC1:VLEDLNKVFPPEVAVC(SEQ ID No.38)
[0469] TRBC2:VLEDLKNVFPPEVAVC(SEQ ID No.39)
[0470] 合成了 15mg的TRBC1和TRBC2肽。通過肽上存在的C末端半胱氨酸將鑰孔蟲戚血蘭 素 （Keyhole Lympet Hemocyanin)綴合至TRBC1和TRBC2肽。對于每種肽，使用KLH綴合的 TRBC1或TRBC2肽免疫2只New England兔共三次。在第三次免疫后，處死兔并取血，并收集血 清用于純化。將從兔獲得的粗制血清通過偶聯(lián)了用于免疫的肽的交聯(lián)珠瓊脂樹脂柱，以收 集對于肽的共有片段和TRBC同種型特異性表位特異性的抗體。然后進(jìn)一步純化初步純化的 上清，通過具有固定化的備選肽的柱，以去除對于肽的共有片段特異性的抗體。
[0471 ] ELISA 設(shè)置
[0472] 包被試劑:A:肽TRBC1
[0473] B:肽TRBC2
[0474] 包被濃度:4ug/ml，100μΙ/孔
[0475] 包被緩沖液:磷酸鹽緩沖水，ρΗ7.4
[0476] 二抗:過氧化物酶綴合的抗兔I gG (H&L)(山羊)抗體
[0477] 結(jié)果示于圖25和26中。通過該方法制備包含TRBC1或TRBC2特異性抗體的多克隆血 清是可能的。
【主權(quán)項】
1. 嵌合抗原受體(CAR)，其包含選擇性結(jié)合TCR beta恒定區(qū)1 (TRBC1)或TRBC2的抗原結(jié) 合域。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的CAR，其選擇性結(jié)合TRBC1。3. 根據(jù)權(quán)利要求2的CAR，其中所述抗原結(jié)合域具有可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)，其 包含以下互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R): VH CDR1:SEQ ID No.7; VH CDR2:SEQ ID No.8; VH CDR3:SEQ ID No.9; VL CDR1:SEQ ID No.10; VL CDR2:SEQ ID No.ll;和 VL CDR3:SEQ ID Νο·12〇4. 根據(jù)權(quán)利要求2的CAR，其中所述抗原結(jié)合域包含具有如SEQ ID No. 1所示的序列的 可變重鏈(VH)和具有如SEQ ID No.2所示的序列的可變輕鏈(VL)。5. 根據(jù)權(quán)利要求2的CAR，其中所述抗原結(jié)合域包含具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸 序列的scFv。6. 根據(jù)權(quán)利要求2的CAR，其包含選自SEQ ID No.4、5和6的氨基酸序列。7. 根據(jù)權(quán)利要求1的CAR，其選擇性結(jié)合TRBC2。8. 編碼根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的CAR的核酸序列。9. 包含根據(jù)權(quán)利要求8的核酸序列的載體。10. 包含根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項的CAR的細(xì)胞。11. 根據(jù)權(quán)利要求10的T細(xì)胞。12. 用于制備根據(jù)權(quán)利要求10或11的細(xì)胞的方法，其包括使用根據(jù)權(quán)利要求8的核酸序 列或根據(jù)權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟。13. 根據(jù)權(quán)利要求10或11的細(xì)胞，用于在治療受試者中T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的方法中 的用途，所述方法包括以下步驟： 將包含TCRB1或TCRB2選擇性CAR的細(xì)胞施用至所述受試者，以引起惡性T細(xì)胞以及與所 述惡性T細(xì)胞表達(dá)相同TRBC的正常T細(xì)胞的選擇性耗竭，但不引起表達(dá)所述惡性T細(xì)胞不表 達(dá)的TRBC的正常T細(xì)胞的耗竭。14. 根據(jù)權(quán)利要求13的用途的細(xì)胞，其中所述方法還包括調(diào)查來自所述受試者的惡性T 細(xì)胞的TCR beta恒定區(qū)（TCRB)以確定其是否表達(dá)TRBC1或TRBC2的步驟。15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14的用途的細(xì)胞，其中所述T細(xì)胞淋巴瘤或白血病選自外周T細(xì) 胞淋巴瘤，非特指型(PTCL-N0S);血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤(AITL)，間變性大細(xì)胞淋巴 瘤(ALCL)，腸病相關(guān)的T細(xì)胞淋巴瘤(EATL)，肝脾T細(xì)胞淋巴瘤(HSTL)，結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤 鼻型，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，原發(fā)性皮膚ALCL，T細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病和T細(xì)胞急性淋巴母細(xì) 胞白血病。16. 用于診斷受試者中T細(xì)胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括確定分離自所述受試者的 樣品中呈TRBC1或TRBC2陽性的總T細(xì)胞的百分比的步驟。17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中TRBC 1或TRBC2陽性T細(xì)胞的百分比大于約80 %指示T 細(xì)胞淋巴瘤或白血病的存在。18. 根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法，其中所述樣品是外周血樣品或活組織檢查。19. 根據(jù)權(quán)利要求16至18任一項的方法，其中使用結(jié)合CD3的試劑在所述樣品中鑒定或 從所述樣品分離總T細(xì)胞。
【文檔編號】C07K16/28GK106068276SQ201580011306
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2015年3月5日 公開號201580011306.X, CN 106068276 A, CN 106068276A, CN 201580011306, CN-A-106068276, CN106068276 A, CN106068276A, CN201580011306, CN201580011306.X, PCT/2015/50643, PCT/GB/15/050643, PCT/GB/15/50643, PCT/GB/2015/050643, PCT/GB/2015/50643, PCT/GB15/050643, PCT/GB15/50643, PCT/GB15050643, PCT/GB1550643, PCT/GB2015/050643, PCT/GB2015/50643, PCT/GB2015050643, PCT/GB201550643
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