卡比多巴的藥物組合物及其治療肝癌的醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了卡比多巴的藥物組合物及其治療肝癌的醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的卡比多巴的藥物組合物中含有卡比多巴和一種從羌活的干燥根及根莖中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，卡比多巴和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對肝癌具有治療效果；二者聯(lián)合作用時(shí)，對肝癌的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療肝癌的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
卡比多己的藥物組合物及其治療肝癌的醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，設(shè)及卡比多己的新用途，具體設(shè)及一種卡比多己的藥 物組合物及其治療肝癌的醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 卡比多己為(s)-a-甲基-α-阱基-3,4-二徑基苯丙酸一水合物。
[0003] 卡比多己具有較強(qiáng)的外周多己脫簇酶抑制劑。不易透過血腦屏障，與左旋多己合 用時(shí)，僅抑制外周多己脫簇酶的活性，減少多己胺在外周組織的生成，減輕其外周不良反 應(yīng)，進(jìn)而使進(jìn)入中樞的左旋多己增多，提高腦內(nèi)多己胺的濃度，增強(qiáng)左旋多己的療效，所W 是左旋多己的重要輔助用藥?？ū榷嗉簡斡脽o效，臨床上通常將卡比多己與左旋多己按1: 10或1:4比例配伍制成復(fù)方制劑。
[0004] 迄今為止，尚未見卡比多己及其藥物組合物與肝癌的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種卡比多己的藥物組合物，該藥物組合物中含有卡比多 己和一種從弟活的干燥根及根莖中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，卡比多己和該天然產(chǎn) 物可W協(xié)同治療肝癌。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得W實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[000引
[0009] -種卡比多己的藥物組合物，包括卡比多己、如上所述的化合物（I)和藥學(xué)上可W 接受的載體。
[0010] 如上所述的化合物（I)的制備方法，包含W下操作步驟：（a)將弟活的干燥根及根 莖粉碎，用65~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋 和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步 驟(a)中正下醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8 個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫 得到4個(gè)組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1 的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到化合物(I)。
[0011] 進(jìn)一步地，步驟(a)中用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0012] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013] 如上所述的化合物(I)在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 如上所述的卡比多己的藥物組合物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
[001引本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 本發(fā)明提供的卡比多己的藥物組合物中含有卡比多己和一種從弟活的干燥根及 根莖中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，卡比多己和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對肝癌具有 治療效果;二者聯(lián)合作用時(shí)，對肝癌的治療效果進(jìn)一步提高，可W開發(fā)成治療肝癌的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0018] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0019]分離方法：（a)將弟活的干燥根及根莖(3kg)粉碎，用75%乙醇熱回流提取(20LX3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(化），依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水飽 和的正下醇(化X3次)萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b) 步驟(a)中正下醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙 醇洗脫8個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70% 乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50 :1 (8個(gè)柱體積）、25 :1 (8個(gè)柱體積）、 15:1(8個(gè)柱體積)和5:1(10個(gè)柱體積)的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(C) 中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1(8個(gè)柱體積）、5:1(10個(gè)柱體積)和2: 1(5個(gè)柱體積）的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基娃 燒鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體 積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (375mg，HPLC歸一化純度大于98 % )。
[0020] 結(jié)構(gòu)確證:無色結(jié)晶，皿斗51-15顯示^+扣+為111八377.2289，結(jié)合核磁特征可得 分子式為C22H32O日，不飽和度為7。核磁共振氨譜數(shù)據(jù)SH(ppm，pyridine-d日，500MHz): H-1 (6.46，dd，J = 4.8，10.細(xì)z)，H-2a(3.39，m)，H-化（3.10，m)，H-3(6.85，m)，H-5a(3.23，d，J = 15.細(xì) z)，H-5b(2.98，dd，J=15.6,9.3Hz)，H-6C.06，dd，J = 9.3，1.4Hz)，H-7(1.87，m)，H-8 (1.46，m)，H-9a(2.13，dd J=16.1，2.6Hz)，H-9b(1.67，dd，J=16.1，7.3Hz)，H-lia.80， m)，H-12(0.93，d，J = 5.7Hz)，H-13(1.13，d，J = 5.7Hz)，H-14(1.19，d，J = 6.Wz)，H-2' (2.82，m)，H-3'（5.26，m)，H-4'（1.23，d，J = 6.3Hz)，H-5'（1.09，d，J = 7.1Hz)，H-2"(1.97， s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)扣(卵m，pyridine-d日，125MHz) :132.4(CH，1-C)，29.6(邸2,2-0131.7 (CH，3-C)，132.4(C，4-C)，28.3(afe，5-C)，77.4(CH，6-C)，52.7(CH，7-C)，22.4(CH，8-C)， 32.5(afe，9-C)，158.6(C，10-C)，26.4(CH，ll-C)，22.1(ai3，12-C)，23.8(CH3，13-C)，18.4 (C 曲，14-C)，171.2(C，15-C)，204.6(C，r-C)，47.6(CH，2'-C)，72.4(CH，3'-C)，17.3(Ol3， 4'-〇，12.7(邸3,5'-〇，170.3似1"-〇,21.4(咖，2"-〇。紅外波譜中的1756畑1-1吸收帶與 UV譜中的236nm吸收帶表明該化合物含有α，β-不飽和內(nèi)醋結(jié)構(gòu)，紅外波譜中的1715cnfi與 1680cm-i吸收帶表明結(jié)構(gòu)中存在酬基與雙鍵片段。i3C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有22個(gè)碳 信號，包括六個(gè)甲基，Ξ個(gè)亞甲基，八個(gè)次甲基(兩個(gè)連氧碳和兩個(gè)締控碳），W及五個(gè)季碳 (Ξ個(gè)幾基碳和兩個(gè)締控碳），W上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表明該化合物為雙環(huán)結(jié)構(gòu)。iH- NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示五個(gè)甲基質(zhì)子信號δκ 0.93(3H，d，J = 5.7Hz)、1.13(3H，d，J = 5.7Hz)、1.19(3H，d，J = 6.細(xì)z)、1.23(3H，d，J = 6.3Hz)、1.09(3H，d，J = 7.1Hz)，一個(gè)乙酷基 甲基質(zhì)子信號δκ 1.97(3H，s)，兩個(gè)締控質(zhì)子信號δH6.46αH，dd，J = 4.8，10.細(xì)z)與6.85 (lH，m)，兩個(gè)連氧次甲基質(zhì)子信號 δκ 5.06( lH，dd，J = 9.3,1.4Hz)與 5.26( 1Η，πιΚ1η-1η COSY譜中存在Η-1/Η2-2/Η-3、出-5/護(hù)6/護(hù)7/護(hù)8/出-9、護(hù)7/護(hù)11/出-12、護(hù)11/出-13、^及護(hù) 8/出-14相關(guān)信號，結(jié)合HMBC譜中顯示的出-2和出-9與C-1，出-2、出-5和H-6與C-4相關(guān)信號可 W構(gòu)建吉馬燒型倍半祗骨架。而1H-1h COSY譜中出-5 7H-2 7H-3 7出-4'相關(guān)信號與HMBC譜 中H-2 '與C-r、C-3 '和C-5 '，H-3 '與C-2 '、C-4 '和C-r W及曲-2"與C-r相關(guān)信號可W構(gòu)建 另一部分片段，并且運(yùn)一部分結(jié)構(gòu)中存在的乙酷基通過氧原子與C-3'相連。另外HMB村普中 H-3、此-5和H-6與C-15相關(guān)信號暗示C-6與C-15之間存在一個(gè)內(nèi)醋環(huán)結(jié)構(gòu)。N0ESY譜中，假設(shè) H-8為β構(gòu)型，那么H-8與H-10的相關(guān)信號表明H-10也為β構(gòu)型，因此，0-3'-0-乙酷基-2'-甲 基下酬基應(yīng)該為α構(gòu)型。此外H-9b與Η-8存在相關(guān)信號，所WH-9a與H-2a W及H-9a與H-5a相 關(guān)信號可判斷判斷H-2a、H-5a、H-9a皆為α構(gòu)型，同時(shí)H-2a與H-5a相關(guān)信號表明Δ3(4)雙鍵為 Ε構(gòu)型。綜合氨譜、碳譜、ΗΜΒ幻普和N0ESY譜，W及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該 化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。碳原子編 號如下：
[0021]
ο
[0022] 實(shí)施例2:對肝癌的治療作用
[0023] 1、材料和方法
[0024] 1.1細(xì)胞及動(dòng)物
[0025] 實(shí)驗(yàn)室符合DB44/61-94清潔級標(biāo)準(zhǔn)。人肝癌細(xì)胞株Be^7402來源于廣州醫(yī)學(xué)院微 生物免疫學(xué)教研室。裸鼠（BALB/C-nu/nu)由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中屯、提供，雄性，鼠齡4- 6周，體質(zhì)量20-25g，平均(23.28 ± 1.62)飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中。
[0026] 1.2試劑與樣品
[0027] 卡比多己購自中國藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實(shí)施例1。卡 比多己、化合物(I)及其組合物先用少量DMS0超聲溶解，再用純化水溶解稀釋灌胃。
[002引1.3小鼠分組及模型制備
[0029] 移植瘤裸鼠動(dòng)物模型復(fù)制:將凍存于液氮罐中肝癌細(xì)胞株Bel-7402取出，復(fù)蘇，體 外培養(yǎng)于RPM11640中，加入體積分?jǐn)?shù)為0.1的小牛血清，青霉素10萬單位/L，鏈霉素 lOOmg/ L，單層培養(yǎng)于C〇2恒溫解育箱內(nèi)，細(xì)胞為上皮樣貼壁生長，每兩Ξ天傳代1次，取對數(shù)生長期 細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用體積分?jǐn)?shù)為0.1的小牛血清的RPM11640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至含瘤1 X 1010L -1，在裸鼠左前上肢蔽窩皮下接種0.2血。
[0030] 分組:24只接種肝癌細(xì)胞株的裸鼠單純隨機(jī)分成正常對照組、卡比多己組（lOmg· kg-i)、化合物（I)組（lOmg · kg-i)、卡比多己與化合物（I)組合物組【5mg · kg-i卡比多己+ 5mg · kg-i化合物(I)】，共4組。所有裸鼠自接種肝癌細(xì)胞株第3天起開始灌胃給藥，正常對照 組為等量生理鹽水灌胃，隔日1次，灌胃20次。停藥1周后，脫頸處死:完整取出瘤塊，檢測瘤 體質(zhì)量。按W下公式計(jì)算腫瘤抑制率：
[0031] 腫瘤抑制率=(對照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/對照組平均瘤質(zhì)量X 100%。
[0032] 1.4微血管密度的測定
[0033] 采用二步法染色:標(biāo)本經(jīng)甲醒固定后，進(jìn)行3um連續(xù)切片:將石蠟切片脫蠟至水:高 壓煮沸抗原修復(fù)3min，體積分?jǐn)?shù)為0.03的H202室溫解育lOmin，滴加兔抗人第Μ因子相關(guān)抗 體，4攝氏度過液，滴加1:200生物素標(biāo)記的羊抗兔I gG，37攝氏度解育30min，二氨基聯(lián)苯胺 顯色5min，W0.01mol/L憐酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照，W血管瘤為陽性對照。微血 管密度的測J 定參照 C1 inica 1 importance of the determination of tumor angiogenesisin breast carcinoma：much more than a new prognostictool的方法。在 低倍視野下檢查微血管染色情況：W新生血管內(nèi)皮染為棟黃色為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，取癌巢間 質(zhì)血管最多的視野，在200倍視野下，按雙盲法由3位觀察者分別計(jì)數(shù)3個(gè)視野:觀察染成棟 色的單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞叢，并W此作為一個(gè)血管:血管腔和腔內(nèi)紅細(xì)胞不作為計(jì)數(shù)，如有肌層 的血管或管腔巧0著者應(yīng)排除，取3人計(jì)數(shù)平均值作為該例的微血管密度。
[0034] 1.5裸鼠生存質(zhì)量評價(jià)
[0035] 通過裸鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)狀況、對刺激的反應(yīng)、體質(zhì)量下降幅度、食欲和尿、便6項(xiàng) 指標(biāo)的觀察，評價(jià)裸鼠生存質(zhì)量和藥物毒副反應(yīng)。
[0036] 1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0037] 由本課題組應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，腫瘤抑制率、微血管密度均值采 用F分析進(jìn)行組間比較，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0038] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0039] 2.1對肝癌移植瘤裸鼠生存質(zhì)量的影響
[0040] 治療方案結(jié)束時(shí)：卡比多己與化合物（I)組合物組6只裸鼠均存活：卡比多己組和 化合物（I)組有5只存活，正常對照組只有4只存活。所有死亡裸鼠均已解剖排除了由于實(shí)驗(yàn) 操作不當(dāng)致死的可能，裸鼠死亡是由腫瘤本身惡化或藥物毒副反應(yīng)所致。
[0041] 卡比多己與化合物（I)組合物組裸鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)狀況、對刺激的反應(yīng)、體質(zhì)量 下降幅度、食欲和尿便等未見明顯異常:其次為化合物(I)組，再次為卡比多己組，最次為正 常對照組
[0042] 2.2對裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用
[0043] 與正常對照組比較，卡比多己與化合物（I)組合物組對腫瘤抑制作用明顯較強(qiáng)，表 現(xiàn)為平均瘤質(zhì)量減少(P<〇.01)，腫瘤抑制率較高(P<〇.01);與正常對照組比較，卡比多己 組、化合物（I)組平均瘤質(zhì)量減少(P<〇.05)，腫瘤抑制率較高(P<0.05);裸鼠肝癌移植瘤 的形成得到抑制。結(jié)果見表1。
[0044] 2.3對腫瘤血管形成的影響
[0045] 與正常對照組比較，卡比多己與化合物（I)組合物組對腫瘤抑制作用明顯較強(qiáng)，表 現(xiàn)為微血管密度降低(P<〇.01);與正常對照組比較，卡比多己組、化合物（I)組微血管密度 降低(P<〇.05);裸鼠腫瘤血管的形成得到抑制。結(jié)果見表1。
[0046] 表1對裸鼠肝癌移植瘤和腫瘤血管形成的影響
[0047]
[004引上述結(jié)果表明，卡比多己、化合物（I)、卡比多己與化合物（I)組合物均能顯著抑制 肝癌移植瘤的生長，而且，卡比多己與化合物（I)組合物的抑制效果比卡比多己、化合物（I) 單獨(dú)抑制效果更好，可W開發(fā)成防治肝癌的藥物。
[0049]上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種卡比多己的藥物組合物，其特征在于:包括卡比多己、如權(quán)利要求1所述的化合 物(I)和藥學(xué)上可W接受的載體。3. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將弟 活的干燥根及根莖粉碎，用65~85 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用 石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下 醇萃取物；（b)步驟(a)中正下醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用 70%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b) 中70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲 燒-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比 為10:1、5:1和2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基 硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱 體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用75%乙醇熱 回流提取，合并提取液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求2所述的卡比多己的藥物組合物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07D307/00GK106083771SQ201610421947
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610421947.9, CN 106083771 A, CN 106083771A, CN 201610421947, CN-A-106083771, CN106083771 A, CN106083771A, CN201610421947, CN201610421947.9
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】崔坤峰