一種從蕨菜中提取原蕨苷以及制備高純度原蕨苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從蕨菜中提取純化制備高純度原蕨苷的方法，該方法先從蕨菜中得到蕨菜水提液，再采用聚酰胺6樹脂、XAD2柱、Chem Elut 1020硅藻土固相萃取柱三重凈化制備得到原蕨苷粗品，再將該粗品進(jìn)一步通過制備HPLC純化，有效地將目標(biāo)化合物原蕨苷與蕨菜中的多種雜質(zhì)相分離，最終得到了純度98％以上的高純度原蕨苷，可作為原蕨苷的標(biāo)準(zhǔn)品使用，具有廣闊的市場前景。同時，本發(fā)明方法簡便，并且在較優(yōu)的工藝參數(shù)下，原蕨苷的收率可達(dá)25％，生產(chǎn)成本較低，具有良好的潛在經(jīng)濟(jì)價值。
【專利說明】
一種從蕨菜中提取原蕨苷以及制備高純度原蕨苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及從蕨菜中提取純化制備高純度原蕨苷的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蕨菜，又叫拳頭菜、貓爪、龍頭菜、鹿蕨菜、蕨兒菜、貓爪子、拳頭菜、蕨苔、鍋蓮，是 蕨的嫩芽。英文名：Pteridium aqui 1 inum，屬于鳳尾蕨科。喜生于淺山區(qū)向陽地塊，多分布 于稀疏針闊混交林。在我國西北、華北、東北、西南及華中各省區(qū)都有廣泛的分布。其食用記 載最早始于《詩經(jīng)》："陟坡南山，言采其蕨"，據(jù)《本草綱目》記載:蕨味甘寒，具清熱、滑腸、降 氣、驅(qū)風(fēng)、化痰等功效，主治食膈、氣膈、腸風(fēng)熱毒等病癥。
[0003] 然而，目前研究發(fā)現(xiàn)，蕨菜中存在一種被稱為原蕨苷(ptaquiloside，PTA，CAS: 87625-62-5)的化合物，它是蕨菜中的主要致癌物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)如下所示：
[0004]
[0005] 在體內(nèi)和體外的研究都表明，原蕨苷具有細(xì)胞和基因毒性與尿道和胃腸道中的腫 瘤發(fā)生直接相關(guān)。同時流行病學(xué)研究也證明人群在蕨類生長密集的地區(qū)居住時間與患胃癌 死亡的風(fēng)險正相關(guān)，而在童年時暴露于原蕨苷的人群在成年后發(fā)生惡性腫瘤的幾率是未暴 露人群的兩倍以上(〇R=2.34)。此外研究還發(fā)現(xiàn)除了直接食用蕨菜外，通過被原蕨苷污染 的牛奶、畜禽肉、甚至地下水均可受到原蕨苷影響。目前，原蕨苷被世界癌癥組織評級為2B 類致癌物，而原蕨苷在蕨類植物的嫩芽中含量最高。
[0006] 目前，蕨菜產(chǎn)業(yè)已有一定的規(guī)模，為了食品的安全，有必要對蕨菜中的原蕨苷含量 進(jìn)行監(jiān)控和控制。然而，目前國內(nèi)尚沒有高純度原蕨苷標(biāo)準(zhǔn)品的銷售，這對蕨菜產(chǎn)品的質(zhì)量 控制造成了困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種從蕨菜中提取原蕨苷的方法，它包括以下步 驟：
[0008] (1)取蕨菜干粉，水提取，離心，取上清液，得蕨菜粗提液；（2)將粗提液過聚酰胺樹 脂柱純化，得洗脫液；
[0009] (3)將洗脫液過大孔吸附樹脂柱，再依次用水、甲醇洗脫，取甲醇洗脫液，回收溶 劑，將殘留物用水溶解，得溶解液；
[0010] (4)將溶解液依次過大孔吸附樹脂柱，固相萃取柱，乙酸乙酯洗脫，取乙酸乙酯洗 脫液，回收溶劑，得原蕨苷粗品。
[0011] 在本發(fā)明一種具體的實施方式中，本蕨菜干粉是將新鮮蕨菜經(jīng)經(jīng)40°C干燥72h，并 粉碎成分經(jīng)200目過篩后得到的。
[0012]進(jìn)一步地，步驟⑴中，所述蕨菜干粉和水的質(zhì)量體積比為lg: l〇mL~lg: 100mL。 [0013]進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述提取的溫度為4°C。
[0014]進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述提取是震蕩提取。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟⑴中，所述提取的時間是30-150min，優(yōu)選60min。
[0016] 進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述聚酰胺樹脂柱是聚酰胺-6樹脂。
[0017] 進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述大孔吸附樹脂柱為XAD2柱。
[0018] 進(jìn)一步地，步驟(4)中，所述大孔吸附樹脂柱為XAD2柱。
[0019]進(jìn)一步地，步驟(4)中，所述固相萃取柱為硅藻土固相萃取柱。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種從蕨菜中制備高純度原蕨苷的方法，它包括以下步驟：
[0021] 所述的方法，制備得到原蕨苷粗品，再以50%甲醇:水為流動相，制備型色譜柱分 離純化原蕨苷粗品，收集主峰的流出組分，即得高純度的原蕨苷;所述制備色譜柱優(yōu)選C18 色譜柱。
[0022]本發(fā)明的方法，先從蕨菜中得到蕨菜水提液，再采用聚酰胺6樹脂、XAD2柱、Chem Elut 1020硅藻土固相萃取柱三重凈化制備得到原蕨苷粗品，再將該粗品進(jìn)一步通過制備 HPLC純化，有效地將目標(biāo)化合物原蕨苷與蕨菜中的多種雜質(zhì)相分離，最終得到了純度98% 以上的高純度原蕨苷，可作為原蕨苷的標(biāo)準(zhǔn)品使用，具有廣闊的市場前景。同時，本發(fā)明方 法簡便，并且在較優(yōu)的工藝參數(shù)下，原蕨苷的收率可達(dá)25%，生產(chǎn)成本較低，具有良好的潛 在經(jīng)濟(jì)價值。
[0023] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0024] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0025] 圖1為原蕨苷經(jīng)制備HPLC純化的色譜圖。
[0026] 圖2為純品原蕨苷的色譜圖。
[0027]圖3純品原蕨苷的光譜圖。
[0028] 圖4為本發(fā)明高純度原蕨苷產(chǎn)品的質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1原蕨苷的提取和純化方法
[0030] 1、原蕨苷(PTA)的提取
[0031]原料采用新鮮的蕨菜。經(jīng)40°C干燥72h，并粉碎成分經(jīng)200目過篩后，按照料液比1: 10(40g蕨菜，400mL蒸餾水）（1:10至1:100均可，本實施例具體為1:10)，4°C震蕩提取60min。 提取物于4°C，5000rpm離心10min，取上清液進(jìn)一步純化。
[0032] 2、提取物中干擾物質(zhì)的去除
[0033]水提取物中除含原蕨苷外，還存在大量的復(fù)合物(一些多糖、蛋白質(zhì)、厥素 B等水溶 性物質(zhì)），會干擾后期原蕨苷的檢測，故將這些干擾物質(zhì)去除。特別是厥素 B，在一定的條件 下，原蕨苷會轉(zhuǎn)化為厥素 B。需要進(jìn)一步凈化除去干擾物質(zhì)。具體為：
[0034] (1)取200mL粗提液以重力法過柱（1 · 0 X 20cm玻璃小柱，5 · 00g聚酰胺6樹脂(購自 sigma)，干法裝柱），前100mL洗脫液直接用于進(jìn)一步凈化，后100mL洗脫液需二次過柱。合并 洗脫液(200mL)進(jìn)一步純化。
[0035] (2)洗脫液再以XAD2柱純化，即以2滴/s的速度使樣品過吸附柱(2.5 X 20cm玻璃小 柱，20mLAmberlite XAD2resin(購自sigma)，濕法裝柱），棄去流出液。吸附柱再用蒸餾水洗 脫三次，每次15mL，丟棄蒸餾水洗脫液。最后以甲醇洗脫吸附柱三次，每次15mL，合并甲醇洗 脫液。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，低壓，45°C，濃縮至近干。殘留物溶于10mL蒸餾水中移出，再以5mL蒸 餾水洗滌兩次，合并溶解液。
[0036] (3)合并的溶解液再過柱凈化（1.0 X 10cm玻璃小柱，1.00g聚酰胺6樹脂，干法裝 柱）。最初的2 m L洗脫液棄去，其余的洗脫液再經(jīng)Ch e m E1 u t 10 20娃藻土固相萃取柱(購自瓦 里安)進(jìn)一步進(jìn)化。用色譜純乙酸乙酯洗脫固相萃取柱，洗脫液收集在圓底燒瓶中，低壓，45 °C，濃縮近干。得到0.20g微黃色膠狀物即為PTA粗品。可充氮-20°C保存待用。
[0037] 3、PTA的制備HPLC純化
[0038]由于PTA粗品純度在20%，可用50%甲醇溶液溶解后以制備型HPLC進(jìn)行分離純化。 分離條件:流動相為50 %甲醇：水，制備型色譜柱(C-18，10uM，25 X 250mm，購自安捷倫），流 速:3mL/min，柱溫25°C，檢測波長254nm。結(jié)果如圖2所示收集主峰的流出組分。流出組分經(jīng) 減壓濃縮后凍干后得到0.04g PTA純品于-20°C保存待用。按原料中PTA含量為4000ug/g(干 重)計算，因此收率為25 %。
[0039] 該方法所得PTA純品經(jīng)HPLC檢測純度大于98%，檢測結(jié)果見圖3。
[0040] 實施例2原蕨苷的提取和純化方法
[0041] 按照實施例1的工藝，改變步驟1的料液比，最終結(jié)果如下表1所示：
[0042]表1步驟1的料液比
[0043]
[0044] 結(jié)合表1和實施例1的結(jié)果可以看出，在1:10~1:100的料液比范圍內(nèi)，本發(fā)明方法 均可以從蕨菜中有效得到高純度原蕨苷。
[0045] 實施例3原蕨苷的提取和純化方法
[0046] 按照實施例1的工藝，保持料液比為1:10,改變步驟1的提取時間，最終結(jié)果如下表 2所示：
[0047]表2步驟1的提取時間
[0048]

[0049] 結(jié)合表1和實施例1的結(jié)果可以看出，10-150min的提取時間范圍內(nèi)，本發(fā)明方法均 可以有效得到高純度原蕨苷，其中當(dāng)提取時間為60min時，收率較高，效果較佳。
[0050] 綜上所述，本發(fā)明的方法，先從蕨菜中得到蕨菜水提液，再采用聚酰胺6樹脂、XAD2 柱、Chem Elut 1020娃藻土固相萃取柱三重凈化制備得到原蕨苷粗品，再將該粗品進(jìn)一步 通過制備HPLC純化，有效地將目標(biāo)化合物原蕨苷與蕨菜中的多種雜質(zhì)相分離，最終得到了 純度98%以上的高純度原蕨苷，可作為原蕨苷的標(biāo)準(zhǔn)品使用，具有廣闊的市場前景。同時， 本發(fā)明方法簡便，并且在較優(yōu)的工藝參數(shù)下，原蕨苷的收率可達(dá)25%，生產(chǎn)成本較低，具有 良好的潛在經(jīng)濟(jì)價值。
【主權(quán)項】
1. 一種從蕨菜中提取原蕨苷的方法，其特征在于:它包括以下步驟： (1) 取蕨菜干粉，水提取，離心，取上清液，得蕨菜粗提液； (2) 將粗提液過聚酰胺樹脂柱純化，得洗脫液； (3) 將洗脫液過大孔吸附樹脂柱，再依次用水、甲醇洗脫，取甲醇洗脫液，回收溶劑，將 殘留物用水溶解，得溶解液； (4) 將溶解液依次過大孔吸附樹脂柱，固相萃取柱，乙酸乙酯洗脫，取乙酸乙酯洗脫液， 回收溶劑，得原蕨苷粗品。2. 根據(jù)權(quán)利看要求1所述的方法，其特征在于:步驟（1)中，所述蕨菜干粉和水的質(zhì)量體 積比為lg: 10mL~lg: lOOmL。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述提取的溫度為4°C。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述提取是震蕩提取。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟（1)中，所述提取的時間是30-150min， 優(yōu)選60min。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述聚酰胺樹脂柱是聚酰胺-6 樹脂。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)中，所述大孔吸附樹脂柱為XAD2 柱。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(4)中，所述大孔吸附樹脂柱為XAD2 柱。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，所述固相萃取柱為硅藻土固相 萃取柱。10. -種從蕨菜中制備高純度原蕨苷的方法，其特征在于:它包括以下步驟： 按照權(quán)利要求1-9任一項所述的方法，制備得到原蕨苷粗品，再以50%甲醇：水為流動 相，制備型色譜柱分離純化原蕨苷粗品，收集主峰的流出組分，即得高純度的原蕨苷;所述 制備色譜柱優(yōu)選C18色譜柱。
【文檔編號】C07H1/08GK106083953SQ201610428121
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】代娟, 袁亞, 魏香奕, 林琳
【申請人】成都醫(yī)學(xué)院