抗cd47單克隆抗體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗體藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及抗CD47單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的抗CD47單抗能有效抑制腫瘤生長；阻斷人SIRPα與人CD47信號可以促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，阻止腫瘤細胞逃避腫瘤免疫的防御系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫瘤的作用。阻斷腫瘤細胞表面CD47與巨噬細胞表面的SIRPα的結(jié)合，可以阻斷腫瘤細胞的“別吃我”信號，促進巨噬細胞對腫瘤細胞的識別攝取，促進腫瘤細胞被吞噬。腫瘤細胞表面的CD47與巨噬細胞表面SIRPα的結(jié)合是一種普遍的“別吃我”信號，抗CD47抗體可以作為腫瘤免疫系統(tǒng)中的非常有前景的靶點，在人類腫瘤治療方面發(fā)揮強大而有效的作用。
【專利說明】
抗CD47單克隆抗體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及抗體藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及抗CD47單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] CD47
[0003]⑶47，也稱作整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白（IAP)，最初從人胎盤與整合素 aVfo共純化及從血 小板與β3整合素共免疫沉淀而為人所知，是一種廣泛表達于細胞表面的跨膜糖蛋白，屬于 免疫球蛋白超家族。
[0004] ⑶47是細胞表面至關(guān)重要的標(biāo)記物，分子量在47-55kD之間，在結(jié)構(gòu)上包括一個氨 基端細胞外可變區(qū)域，一個由3-5個高度疏水的跨膜片段構(gòu)成的跨膜區(qū)域和一個親水的羧 基端胞質(zhì)尾區(qū)。其與多種配體諸如整聯(lián)蛋白、SIRPa(信號調(diào)節(jié)蛋白a)、SIRPy和血小板反應(yīng) 蛋白相互作用。
[0005] SIRPa
[0006] 信號調(diào)節(jié)蛋白a(SIRPa)也是一種跨膜蛋白，主要表達于巨噬細胞、樹突狀細胞和 神經(jīng)細胞表面。其胞外區(qū)含有3個免疫球蛋白超家族樣區(qū)域，其中N末端的區(qū)域介導(dǎo)與CD47 的結(jié)合，而其細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有典型的免疫受體酪氨酸抑制性序列（ITIM)。當(dāng)與CD47結(jié)合 后，SIRPa的Ι??Μ被磷酸化，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，抑制巨噬細胞的吞噬作用。
[0007] ⑶47/SIRPa參與腫瘤免疫的逃逸機制
[0008] 在先天免疫系統(tǒng)中，CD47作為自身標(biāo)志物、通過結(jié)合由髓樣細胞諸如巨噬細胞、中 性粒細胞和樹突細胞表達的SIRPa而傳遞抑制性"別吃我"信號而發(fā)揮功能。因此，CD47在生 理條件下廣泛表達的作用是保護健康細胞免于被先天免疫系統(tǒng)消除。然而，腫瘤細胞則通 過過表達⑶47而有效逃脫免疫監(jiān)視。
[0009] 近年來，CD47和⑶47-SIRPa信號系統(tǒng)受到廣泛關(guān)注。其中，最令人矚目的是其作為 腫瘤治療的潛在藥靶。已有研究證實，CD47表達在大部分人類癌癥(例如，NHL、AML、乳腺癌、 結(jié)腸癌、成膠質(zhì)細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、膀胱癌和前列腺癌）中上調(diào)，并且提高的CD47 表達水平與侵襲性疾病和差的存活相關(guān)。坦福大學(xué)的Weissman系統(tǒng)地研究了多種實體瘤中 CD47的表達水平，結(jié)果表明，所有人類實體瘤細胞中的CD47都呈高表達，其平均表達水平是 對應(yīng)正常細胞的3.3倍左右。而且，他們發(fā)現(xiàn)實體瘤病人⑶47mRNA的水平與預(yù)后指數(shù)呈負相 關(guān)。
[0010]進一步針對原位免疫缺陷性小鼠異種移植動物模型的實驗發(fā)現(xiàn)，抗CD47單克隆抗 體的施用能夠抑制大型腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，而對于小型腫瘤則可以治愈。Willingham等人 還在原位小鼠乳腺癌模型實驗中證實了抗CD47單克隆抗體的有效性和安全性。該項研究不 僅證實了高表達⑶47是腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視的普遍機制，也為通過阻斷⑶47-SIRPa信號 通路來治療腫瘤提供了有重要價值的借鑒。
[0011] 治療性抗⑶47抗體
[0012]⑶47在多類腫瘤中高表達并作為"別吃我"信號抑制吞噬作用，意味著靶向⑶47- SI RPa通路可作為多類腫瘤的治療方法。
[0013] RAUH等人通過體內(nèi)外實驗證實阻斷性抗⑶47單克隆抗體能促進巨噬細胞對腫瘤 細胞進行吞噬，抑制急性粒細胞白血病(AML)在小鼠體內(nèi)形成，并消除已在體內(nèi)移植成功的 AML，還可靶向清除白血病干細胞（LSChCHAO等人對急性淋巴細胞白血病的研究發(fā)現(xiàn)抗 CD47單克隆抗體聯(lián)合利妥昔單抗不僅可消除原始移植部位的腫瘤，還能消除血液循環(huán)及向 肝、脾、淋巴結(jié)等部位擴散的腫瘤，達到長期生存且抑制腫瘤復(fù)發(fā)的效果，而單獨使用抗 CD47單克隆抗體或抗CD20單克隆抗體只能抑制NHL的生長速度卻不能完全消除NHL。
[0014] 為進一步證實抗⑶47單克隆抗體對腫瘤的作用，WILLINGHAM等人用有免疫活性的 小鼠建立移植瘤模型，抗鼠及抗人CD47單克隆抗體均可顯著抑制腫瘤的生長，并證實抗C D47抗體可消除多種實體瘤腫并抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，此外抗C D47單克隆抗體對腫瘤干 細胞(CSC)及其分化亞型也有抗瘤作用，并能將致瘤性的TAM、轉(zhuǎn)變成抗瘤性的效應(yīng)因子并 增強其吞噬作用。抑制小鼠 CD47的表達還能增強腫瘤細胞對放療的敏感性，而對正常組織 具有保護作用，這一作用可能與誘導(dǎo)宿主免疫細胞產(chǎn)生保護性自噬反應(yīng)有關(guān)。
[0015] 抗CD47單克隆抗體治療腫瘤與多種機制有關(guān)。首先，抗CD47單克隆抗體通過阻斷 腫瘤細胞上的CD47與巨噬細胞上的SIRPa結(jié)合而使腫瘤細胞被吞噬。其次，與抗體依賴性的 細胞介導(dǎo)的細胞毒作用和補體依賴性的細胞毒作有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)抗CD47抗體可誘導(dǎo)NK細胞 參與的抗頭頸腫瘤細胞的細胞毒作用。再次，通過直接誘導(dǎo)凋亡而清除腫瘤細胞。最后，對 有免疫活性的小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)抗CD47單克隆抗體可激活CD8+T細胞，引起獲得性T細胞免 疫反應(yīng)，進一步殺傷腫瘤細胞。
[0016] 隨著人們對腫瘤分子發(fā)生機制研究的不斷深入，分子免疫治療逐漸成為除手術(shù)及 化學(xué)藥物治療之外的另一有效的治療手段。目前生物治療在腫瘤治療中的作用逐年提高， 生物治療在防止腫瘤復(fù)發(fā)、治療晚期癌癥及其并發(fā)癥等諸多方面具有諸多優(yōu)勢。因此，存在 對于能夠靶向CD47的抗體和治療的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供抗CD47單克隆抗體及其應(yīng)用，本發(fā) 明提供的抗CD47單克隆抗體能夠結(jié)合人CD47及猴CD47,可呈劑量依賴性阻斷人SIRPa與人 CD47的結(jié)合;促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用。通過阻斷SIRPa與人CD47的結(jié)合信號， 阻止腫瘤細胞逃避腫瘤免疫的防御系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫瘤的作用。
[0018] 本發(fā)明提供的抗CD47單克隆抗體具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)：
[0019] (I)所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3 SSEQIDN0:4SSEQIDN0:5SSEQIDN0:6SSEQIDN0:7K*;
[0020] (II)所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12或SEQ ID NO :13或SEQ ID NO :14所示；
[0021 ] (III) (I)或（II)所述氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、 且與（I)或（Π )所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列;或 [0022] (IV)與（I)或（II)所述序列至少有80%同源性的氨基酸序列。本發(fā)明中，抗⑶47 的單克隆抗體中，
[0023]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述抗CD47單克隆抗體的氨基酸序列經(jīng)取代、 缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列中，所述多個為2個、3個、4個、5個、6個、7 個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、 23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個或32個。
[0024]所述取代發(fā)生于高變區(qū)；
[0025] 所述重鏈可變區(qū)的高變區(qū)為HVR-H1，HVR-H2，HVR-H3;
[0026] SEQ ID N0:2的高變區(qū)HVR-H1 序列如SEQ ID N0:45所示；HVR-H2序列如SEQ ID N0:46所示;HVR-H3序列如SEQ ID N0:47所示；
[0027] SEQ ID N0:5的高變區(qū)HVR-H1 序列如SEQ ID N0:48所示；HVR-H2序列如SEQ ID N0:49所示;HVR-H3序列如SEQ ID N0:50所示；
[0028] SEQIDN0:6的高變區(qū)HVR-H1序列如SEQIDN0:51所示；HVR-H2序列如SEQID N0:52所示;HVR-H3序列如SEQ ID N0:53所示；
[0029] 所述輕鏈可變區(qū)的高變區(qū)為HVR-L1，HVR-L2，HVR-L3;
[0030] SEQIDN0:9的高變區(qū)HVR-L1序列如SEQIDN0:54所示；HVR-L2序列如SEQID N0:55所示;HVR-L3序列如SEQ ID N0:56所示；
[0031] SEQ ID NO: 12的高變區(qū)HVR-L1序列如SEQ ID NO: 57所示；HVR-L2序列如SEQ ID N0:58所示;HVR-L3序列如SEQ ID N0:59所示；
[0032] SEQIDN0:13的高變區(qū)HVR-L1序列如SEQIDN0:60所示；HVR-L2序列如SEQID N0:61 所示;HVR-L3序列如SEQ ID N0:62所示。
[0033] 其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1~7任一項所示；
[0034] 其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:8~14任一項所示。
[0035]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述抗CD47單克隆抗體具有：
[0036] (i)氨基酸序列為SEQIDN0:l，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQ ID N0:8的輕鏈可變區(qū)；
[0037] (ii)氨基酸序列為SEQ ID N0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQ ID NO:9的輕鏈可變區(qū)；
[0038] (iii)氨基酸序列為SEQ ID N0:l，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為 SEQ ID N0:10的輕鏈可變區(qū)；
[0039] (iv)氨基酸序列為SEQ ID N0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQ ID NO: 11的輕鏈可變區(qū)；
[0040] (V)氨基酸序列為SEQ ID N0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQ ID NO: 12的輕鏈可變區(qū)；
[00411 (VI)氨基酸序列為SEQ ID N0:l，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQ ID N0:13的輕鏈可變區(qū)；
[0042] (VII)氨基酸序列為SEQ ID N0:l，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為 SEQ ID N0:14的輕鏈可變區(qū)。
[0043]本發(fā)明提供的抗⑶47單克隆抗體的重鏈類型為IgGl，IgG3或IgM;其輕鏈類型為κ
[0044] 本發(fā)明還提供了編碼所述抗⑶47單克隆抗體的核苷酸。
[0045] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述核苷酸具有
[0046] (I)如SEQ ID N0:15-21所示的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；如SEQ ID N0:22-28所 示的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列;或
[0047] (II)如SEQ ID N0:15-21所示的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列的互補序列；如SEQ ID NO: 22-28所示的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的互補序列;或
[0048] (III)與（I)或（II)的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與 (I)或（II)的核苷酸序列不同的序列;或
[0049] (IV)與（I)或（II)或（III)所述序列至少有80%同源性的序列。
[0050] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述核苷酸具有與（I)或（II)或（III)或（IV)所 示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸獲得的、且與（I)或（II)或（III)或 (IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
[0051 ]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述核苷酸具有與（I)或（II)或（III)或（IV)所 示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸獲得的核苷酸序列，所述多個為2 個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、 19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個或32個。
[0052]本發(fā)明還提供了一種表達載體，包括本發(fā)明提供的編碼抗CD47單克隆抗體的核苷 酸。
[0053]本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，轉(zhuǎn)化本發(fā)明所述的表達載體。
[0054]本發(fā)明還提供了一種抗原，其具有如SEQ ID N0: 29~32任一項所示的氨基酸序 列。
[0055]本發(fā)明還提供了產(chǎn)生本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0056]本發(fā)明提供的抗CD47單克隆抗體的制備方法包括：
[0057] 步驟1:以本發(fā)明提供的抗原免疫小鼠后，獲得小鼠的脾細胞；
[0058] 步驟2:融合所述脾細胞和骨髓瘤細胞，篩選能夠與CD47結(jié)合的雜交瘤細胞株，經(jīng) 體外培養(yǎng)，制得抗CD47單克隆抗體。
[0059]本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體經(jīng)化學(xué)標(biāo)記或生物標(biāo)記制得的結(jié)合物。
[0060]所述化學(xué)標(biāo)記為同位素、免疫毒素和/或化學(xué)藥物；
[0061 ]所述生物標(biāo)記為生物素、親和素或酶標(biāo)記。
[0062] 本發(fā)明還提供了所述抗CD47單克隆抗體或的結(jié)合物與固體介質(zhì)或半固體介質(zhì)偶 聯(lián)制得的偶聯(lián)物。
[0063] 本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備檢測CD47表達的產(chǎn)品 中的應(yīng)用。
[0064] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物。
[0065] -種疾病的診斷方法，以本發(fā)明提供的試劑盒檢測⑶47表達，根據(jù)⑶47的表達量 判斷是否患有疾??；
[0066]所述疾病為白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎 癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和/或黑素瘤。
[0067]本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備阻斷CD47與SIRPa結(jié)合 的制劑中的應(yīng)用。
[0068]本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備提高巨噬細胞對腫瘤 細胞吞噬指數(shù)的制劑中的應(yīng)用。
[0069] 本發(fā)明實施例中，腫瘤細胞為人外周血白血病T細胞。
[0070] 本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備促進腫瘤細胞凋亡的 制劑中的應(yīng)用。
[0071] 本發(fā)明的實施例中，腫瘤細胞為人外周血白血病Τ細胞。
[0072]所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備防治疾病的藥物中的應(yīng)用； [0073]所述疾病為白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎 癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和/或黑素瘤。
[0074]本發(fā)明還提供了一種藥物，包括本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、其結(jié)合物和/或偶 聯(lián)物。
[0075] -種疾病的防治方法，給予本發(fā)明所述的藥物;所述疾病為白血病、淋巴瘤、乳腺 癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和/或黑素 瘤。
[0076]本發(fā)明提供的抗⑶47單抗能有效抑制腫瘤生長;阻斷人SIRPa與人⑶47信號可以 促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，阻止腫瘤細胞逃避腫瘤免疫的防御系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫 瘤的作用。阻斷腫瘤細胞表面CD47與巨噬細胞表面的SIRPa的結(jié)合，可以阻斷腫瘤細胞的 "別吃我"信號，促進巨噬細胞對腫瘤細胞的識別攝取，促進腫瘤細胞被吞噬。腫瘤細胞表面 的CD47與巨噬細胞表面SIRPa的結(jié)合是一種普遍的"別吃我"信號，抗CD47抗體可以作為腫 瘤免疫系統(tǒng)中的非常有前景的靶點，在人類腫瘤治療方面發(fā)揮強大而有效的作用。
【附圖說明】
[0077]圖1示SDS-PAGE電泳檢測純化的人和猴的CD47;泳道M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；圖卜A: 泳道1:人CD47-連接肽-hIgGIFc;泳道2:人CD47-連接肽-His;圖1-B，泳道1:鼠 CD47-連接 肽-hIgGIFc;泳道2:鼠 CD47-連接肽-His;
[0078]圖2示SDS-PAGE電泳檢測陽性抗體(PAB)，泳道Μ:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；泳道1:非還 原ΡΑΒ;泳道2:還原ΡΑΒ;
[0079]圖3示非還原SDS-PAGE電泳檢測純化的候選抗體;泳道Μ:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記;泳道 1:059-1.11.1純化抗體;泳道2:059-1.20.1純化抗體;泳道3:059-1.30.1純化抗體;泳道4: 059-1.43.1純化抗體；泳道5:059-1.51.2純化抗體；泳道6:059-1.82.1純化抗體；泳道7 : 059-1.100.5純化抗體；
[0080] 圖4示總RNA電泳檢測;M:DL2000分子量標(biāo)記，泳道1-7:分別為059-1.11.1、059-1 · 20 · 1、059-1 · 30 · 1、059-1 · 43 · 1、059-1 · 51 · 2、059-1 · 82 · 1、059-1 · 100 · 5總RNA電泳條帶；
[0081] 圖5示PCR擴增候選抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)瓊脂糖電泳檢測結(jié)果；
[0082] 圖6 示抗體059-1 · 20 · 1、059-1 · 30 · 1、059-1 · 43 · 1、059-1 · 82 · 1阻斷人 CD47 與 SIRPa 的結(jié)果圖；
[0083] 圖7 示抗體059-1 · 20 · 1、059-1 · 30 · 1、059-1 · 43 · 1、059-1 · 82 · 1與 jurkat 細胞表面 CD47結(jié)合的FACS測定實驗；
[0084] 圖8示抗體059-1 · 20 · 1、059-1 · 30 · 1、059-1 · 43 · 1、059-1 · 82 · 1 促進小鼠腹腔原代 巨噬細胞對Jurkat細胞的吞噬。
【具體實施方式】
[0085] 本發(fā)明提供了抗CD47單克隆抗體及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容， 適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來 說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例 進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進 行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0086] "抗體"是指由能特異結(jié)合抗原的一種或多種多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)。抗體的一種形式 構(gòu)成了抗體的基本結(jié)構(gòu)單元。這種形式是四聚物，它由兩對完全相同的抗體鏈構(gòu)成，每一對 都有一個輕鏈和一個重鏈。在每對抗體鏈中，輕鏈和重鏈的可變區(qū)聯(lián)合在一起共同負責(zé)結(jié) 合抗原，而恒定區(qū)則負責(zé)抗體的效應(yīng)器功能。
[0087]抗體重鏈或輕鏈的"可變區(qū)"是該鏈的N端成熟區(qū)域。目前已知的抗體類型包括κ和 λ輕鏈，以及α，γ (IgGl，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，#Ρμ重鏈或它們的其它類型等價物。全長的免 疫球蛋白"輕鏈"（大約25kDa或大約214個氨基酸)包含一個由ΝΗ2-末端上大約110個氨基酸 形成的可變區(qū)，以及一個C00H-末端上的κ或λ恒定區(qū)。全長的免疫球蛋白"重鏈"（大約50kDa 或大約446個氨基酸），同樣包含一個可變區(qū)（大約116個氨基酸），以及重鏈恒定區(qū)之一，例 如γ (大約330個氨基酸）。
[0088] "抗體"包括任何同型體的抗體或免疫球蛋白，或保持與抗原特異結(jié)合的抗體片 段，包括但不限于Fab，F(xiàn)v，SCFv和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體以及包含抗體的 抗原結(jié)合部分和非抗體蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)?？贵w可以被標(biāo)記和檢測，例如，可以通過放射 性同位素、能產(chǎn)生可檢測物的酶、熒光蛋白質(zhì)、生物素等等進行標(biāo)記并被檢測?？贵w還可以 結(jié)合于固相載體，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。
[0089]本發(fā)明提供了一種抗⑶47單克隆抗體具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)：
[0090] (I)所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3 SSEQIDN0:4SSEQIDN0:5SSEQIDN0:6SSEQIDN0:7K*;
[0091] (II)所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12或SEQ ID NO :13或SEQ ID NO :14所示；
[0092] (III) (I)或（II)所述氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、 且與（I)或（Π )所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列;或
[0093] (IV)與（I)或（II)所述序列至少有80%同源性的氨基酸序列。
[0094] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述抗CD47單克隆抗體的氨基酸序列經(jīng)取代、 缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列中，所述多個為2個、3個、4個、5個、6個、7 個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、 23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個或32個。
[0095]所述取代發(fā)生于高變區(qū)；
[0096] 所述重鏈可變區(qū)的高變區(qū)為HVR-H1，HVR-H2，HVR-H3;
[0097] SEQ ID N0:2的高變區(qū)HVR-H1 序列如SEQ ID N0:45所示；HVR-H2序列如SEQ ID N0:46所示;HVR-H3序列如SEQ ID N0:47所示；
[0098] SEQ ID N0:5的高變區(qū)HVR-H1 序列如SEQ ID N0:48所示；HVR-H2序列如SEQ ID N0:49所示;HVR-H3序列如SEQ ID N0:50所示；
[0099] SEQIDN0:6的高變區(qū)HVR-H1序列如SEQIDN0:51所示；HVR-H2序列如SEQID N0:52所示;HVR-H3序列如SEQ ID N0:53所示；
[0100] 所述輕鏈可變區(qū)的高變區(qū)為HVR-L1，HVR-L2，HVR-L3;
[0101] SEQIDN0:9的高變區(qū)HVR-L1序列如SEQIDN0:54所示；HVR-L2序列如SEQID N0:55所示;HVR-L3序列如SEQ ID N0:56所示；
[0102] SEQ ID NO: 12的高變區(qū)HVR-L1序列如SEQ ID NO: 57所示；HVR-L2序列如SEQ ID N0:58所示;HVR-L3序列如SEQ ID N0:59所示；
[0103] SEQIDN0:13的高變區(qū)HVR-L1序列如SEQIDN0:60所示；HVR-L2序列如SEQID N0:61 所示;HVR-L3序列如SEQ ID N0:62所示。
[0104] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述抗CD47單克隆抗體具有：
[0105] (i)氨基酸序列為SEQIDN0:l，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQ ID N0:8的輕鏈可變區(qū)；
[0106] (ii)氨基酸序列為SEQ ID N0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQ ID NO:9的輕鏈可變區(qū)；
[0107] (iii)氨基酸序列為SEQ ID N0:l，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為 SEQ ID N0:10的輕鏈可變區(qū)；
[0108] (iv)氨基酸序列為SEQ ID N0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQ ID NO: 11的輕鏈可變區(qū)；
[0109] (V)氨基酸序列為SEQ ID N0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQ ID NO: 12的輕鏈可變區(qū)；
[0110] (VI)氨基酸序列為SEQ ID N0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQ ID NO: 13的輕鏈可變區(qū)；
[0111] (VII)氨基酸序列為SEQ ID N0:l，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為 SEQ ID N0:14的輕鏈可變區(qū)；
[0112]本發(fā)明提供的抗⑶47單克隆抗體其重鏈類型為IgGl，IgG3或IgM;其輕鏈類型為κ。
[0113] 具體的，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，輕 鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0114] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0115] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0116] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0117] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0118] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0119] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。
[0120] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0121] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0122] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0123] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0124] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0125] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0126] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0127] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0128] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0129] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0130] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0131] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0132] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0133] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0134] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0135] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0136] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0137] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0138] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0139] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0140] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0141] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0142] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0143] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0144] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0145] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0146] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0147] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0148] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0149] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0150] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0151] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0152] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0153] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0154] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0155] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0156] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0157] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0158] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0159] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0160] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0161] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0162] 在本發(fā)明的實施例中，抗CD47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0163] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0164] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0165] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0166] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0167] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0168] 或，抗⑶47的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0169] 本發(fā)明的抗體059-1.8 2.1的重鏈恒定區(qū)為鼠 I gG3，輕鏈恒定區(qū)為鼠 κ鏈的恒定區(qū)， 059-1.30.1、059-1.43.1和059-1.20.1都為鼠 IgGl，輕鏈恒定區(qū)為鼠 κ鏈的恒定區(qū)，〇59_ 1.11. 1、059-1.51.2、059-1.100.5的重鏈恒定區(qū)為鼠 IgM，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:1-7中的一個，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:8-14中的一個。
[0170] 本發(fā)明提供的抗⑶47單抗能夠結(jié)合人⑶47及猴⑶47;在某些實施方案中，抗體與 其靶點之間的親和力用Ka、Kd(解離常數(shù)）、KD(平衡解離常數(shù))來表征，本發(fā)明提供抗體的 KD值不高于30nM。
[0171] 本發(fā)明提供的抗CD47單抗可呈劑量依賴性阻斷人SIRPa與人CD47的結(jié)合;其阻斷 效果通過EC50值表示，本發(fā)明提供抗體的EC50值不低于850nM。
[0172] 本發(fā)明提供的抗CD47單抗能夠結(jié)合細胞表面CD47;該效果的檢測通過FACS法進 行，其結(jié)果通過MFI (熒光強度)表示，本發(fā)明提供抗體與細胞表面CD47結(jié)合的MFI值不低于 9547,最高可達18533。
[0173] 本發(fā)明提供的抗CD47單抗能夠促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，該效果通過 熒光成像法測定，結(jié)果以吞噬指數(shù)表示。本發(fā)明提供抗體對jurkat細胞的吞噬指數(shù)可達79。
[0174] 本發(fā)明提供的抗CD47單抗還能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，該效果通過流失細胞儀檢 測細胞凋亡率表示，結(jié)果表明，本發(fā)明提供抗體能夠誘導(dǎo)jurkat細胞的凋亡，凋亡率可達 48% 〇
[0175] Jurkat細胞屬急性T細胞白血病細胞系，屬多種惡性腫瘤細胞中的一種，與其他惡 性腫瘤相同，jurkat細胞表面⑶47呈高表達。本發(fā)明通過對jurkat的實驗證明，本發(fā)明提供 的CD47單抗能夠通過阻斷SIRPa與人CD47的結(jié)合信號，阻止腫瘤細胞逃避腫瘤免疫的防御 系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫瘤的作用。
[0176] 本發(fā)明提供的單抗中，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，輕鏈可變區(qū) 的氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示；重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:10所示;重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，輕 鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:11所示;重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所 示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，的單克隆抗體與人⑶47、猴⑶47皆具有 良好的親和力，其能夠阻斷CD47與SIRPa的結(jié)合，能夠與細胞表面CD47結(jié)合，促進巨噬細胞 吞噬腫瘤細胞，并誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。
[0177] 其中，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如 SEQ ID N0:11所示的單克隆抗體阻斷CD47與SIRPa的結(jié)合的效果最佳;其與腫瘤細胞表面 CD47結(jié)合的效果也最佳，其誘導(dǎo)巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的效果也最佳。但在誘導(dǎo)腫瘤細胞 凋亡方面，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0: 3所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:10所示的單克隆抗體則具有更優(yōu)的效果。
[0178] 本發(fā)明還提供了編碼所述抗⑶47單克隆抗體的核苷酸。
[0179]在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述核苷酸具有
[0180] (I)如SEQ ID N0:15-21所示的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；如SEQ ID N0:22-28所 示的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列;或
[0181] (II)如SEQ ID N0:15-21所示的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列的互補序列；如SEQ ID NO: 22-28所示的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的互補序列;或
[0182] (III)與（I)或（II)的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與 (I)或（II)的核苷酸序列不同的序列;或
[0183] (IV)與（I)或（II)或（III)所述序列至少有80%同源性的序列。
[0184] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述核苷酸具有與（I)或（II)或（III)或（IV)所 示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸獲得的、且與（I)或（II)或（III)或 (IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
[0185] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述核苷酸具有與（I)或（II)或（III)或（IV)所 示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸獲得的核苷酸序列，所述多個為2 個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、 19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個或32個。
[0186] 本發(fā)明還提供了一種表達載體，包括本發(fā)明提供抗⑶47單克隆抗體重鏈可變區(qū) 和/或輕鏈可變區(qū)的核苷酸。
[0187] 本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，轉(zhuǎn)化本發(fā)明所述的表達載體。
[0188] 本發(fā)明還提供了一種抗原，其具有如SEQ ID N0:29~32任一項所示的氨基酸序 列。
[0189] 本發(fā)明還提供了產(chǎn)生本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0190] 本發(fā)明提供的抗CD47單克隆抗體的制備方法包括：
[0191]步驟1:以本發(fā)明提供的抗原免疫小鼠后，獲得小鼠的脾細胞；
[0192] 步驟2:融合所述脾細胞和骨髓瘤細胞，篩選能夠與CD47結(jié)合的雜交瘤細胞株，經(jīng) 體外培養(yǎng)，制得抗CD47單克隆抗體。
[0193] 本發(fā)明中，步驟1中所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0:29或31所示。
[0194] 本發(fā)明中，抗原與佐劑混合后對小鼠進行免疫。
[0195] 抗原與佐劑的體積比為1:1。
[0196] 所述免疫具體為首次免疫后二周進行第二次免疫，3天后區(qū)血清效價大于1: 200000的小鼠進行加強免疫。
[0197] 首次免疫、第二次免疫和加強免疫的劑量以抗原質(zhì)量計皆為10yg。
[0198] 免疫采用兩點注射。
[0199] 首次免疫的佐劑為弗氏完全佐劑，第二次免疫和加強免疫的佐劑為弗氏不完全佐 劑。
[0200] 免疫采用的小鼠為BALB/C小鼠。
[0201]骨髓瘤細胞為 P3X63Ag8.653。
[0202]以脾細胞與骨髓瘤細胞的個數(shù)比為5:1進行融合。
[0203] 所述篩選采用HAT培養(yǎng)基篩選。
[0204]所述與CD47結(jié)合具體為能與CD47蛋白結(jié)合且能夠與表面表達CD47蛋白的細胞結(jié) 合。
[0205]經(jīng)鑒定，采用本發(fā)明提供方法制備的⑶47單抗，重鏈的類型為IgG3、IgM或IgGl類， 輕鏈的類型為κ。
[0206] 本發(fā)明所述抗⑶47單克隆抗體經(jīng)化學(xué)標(biāo)記或生物標(biāo)記制得的結(jié)合物。
[0207] 所述化學(xué)標(biāo)記為同位素、免疫毒素和/或化學(xué)藥物；
[0208] 所述生物標(biāo)記為生物素、親和素或酶標(biāo)記。
[0209] 所述酶標(biāo)記優(yōu)選為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。
[0210] 所述免疫毒素優(yōu)選為黃曲霉毒素、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思 子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴蓮根毒素、PAP、造草素、白樹毒素或絲瓜毒素。
[0211]本發(fā)明還提供了所述抗CD47單克隆抗體或的結(jié)合物與固體介質(zhì)或半固體介質(zhì)偶 聯(lián)制得的偶聯(lián)物。
[0212] 所述固體介質(zhì)或非固體介質(zhì)選自膠體金、聚苯乙烯平板或珠粒。
[0213] 本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備檢測CD47表達的產(chǎn)品 中的應(yīng)用。
[0214]實驗表明，本發(fā)明提供的⑶47單抗能夠與⑶47蛋白相結(jié)合，也可與表面表達⑶47 的細胞相結(jié)合。故而，本發(fā)明提供的CD47單抗能夠用于CD47蛋白或表面表達CD47的細胞的 檢測。并且，由于腫瘤細胞表面標(biāo)志物CD47的高表達，本發(fā)明提供的抗體能夠制備用于腫瘤 表面標(biāo)志物⑶47檢測的試劑盒。其中，CD47蛋白的檢測采用ELISA法，表面表達⑶47的細胞 的檢測采用FACS法。
[0215] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物。
[0216] 檢測⑶47蛋白的試劑盒中，還包括包被緩沖液、洗滌液、封閉液和/或顯色液。
[0217] 所述包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液。
[0218] 所述洗滌液中包括PBS、Tween、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀。
[0219] 所述封閉液中包括PBS和BSA。
[0220] 所述顯色液包括TMB溶液、底物緩沖液和終止液。
[0221 ]所述底物緩沖液包括檸檬酸和磷酸氫二鈉。
[0222] 所述終止液為過氧化氫水溶液。
[0223] 檢測表面表達⑶47的細胞的試劑盒中，還包括PBS、羊抗鼠 IgG Fc和TITC二抗。
[0224] 本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備阻斷CD47與SIRPa結(jié)合 的制劑中的應(yīng)用。
[0225] 所述表面表達⑶47的細胞為腫瘤細胞。
[0226] 所述腫瘤細胞選自白血病細胞、淋巴瘤細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、腸 癌細胞、食管癌細胞、卵巢癌細胞、宮頸癌細胞、腎癌細胞、膀胱癌細胞、胰腺癌細胞、神經(jīng)膠 質(zhì)瘤細胞和/或黑素瘤細胞。
[0227] -種疾病的診斷方法，以本發(fā)明提供的試劑盒檢測CD47表達，根據(jù)CD47的表達量 判斷是否患有疾??；
[0228]所述疾病為白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎 癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和/或黑素瘤。
[0229] 本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備阻斷CD47與SIRPa結(jié)合 的制劑中的應(yīng)用。
[0230] 本發(fā)明所述的抗CD47單抗阻斷CD47與SIRPa結(jié)合的EC50值為850nM~2340nM。
[0231] 本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備提高巨噬細胞對腫瘤 細胞吞噬指數(shù)的制劑中的應(yīng)用。
[0232] 本發(fā)明所述的抗CD47單抗提高巨噬細胞對腫瘤細胞吞噬指數(shù)的劑量以抗體濃度 計為 lOyg/mL。
[0233] 本發(fā)明實施例中，腫瘤細胞為人外周血白血病T細胞。
[0234] 本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備促進腫瘤細胞凋亡的 制劑中的應(yīng)用。
[0235] 本發(fā)明的實施例中，腫瘤細胞為人外周血白血病T細胞。
[0236]本發(fā)明所述的抗⑶47單抗促進腫瘤細胞凋亡的劑量為10yg/mL。
[0237]所述抗CD47單克隆抗體、其結(jié)合物和/或偶聯(lián)物在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用； [0238]所述疾病為白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎 癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和/或黑素瘤。
[0239] 本發(fā)明還提供了一種藥物，包括本發(fā)明所述抗CD47單克隆抗體、結(jié)合物和/或偶聯(lián) 物。
[0240] -種疾病的防治方法，給予本發(fā)明所述的藥物;所述疾病為白血病、淋巴瘤、乳腺 癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和/或黑素 瘤。
[0241] 本發(fā)明提供的藥物能夠通過阻斷可以阻斷腫瘤細胞的"別吃我"信號，促進巨噬細 胞對腫瘤細胞的識別攝取，促進腫瘤細胞被吞噬。
[0242] 本發(fā)明提供的藥物的劑型為注射液劑或注射粉針劑。
[0243] 所述注射液中，抗體的濃度為10yg/mL。
[0244] 本發(fā)明提供的抗CD47單抗能有效抑制腫瘤生長;阻斷人SIRPa與人CD47信號可以 促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，阻止腫瘤細胞逃避腫瘤免疫的防御系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫 瘤的作用。阻斷腫瘤細胞表面CD47與巨噬細胞表面的SIRPa的結(jié)合，可以阻斷腫瘤細胞的 "別吃我"信號，促進巨噬細胞對腫瘤細胞的識別攝取，促進腫瘤細胞被吞噬。腫瘤細胞表面 的CD47與巨噬細胞表面SIRPa的結(jié)合是一種普遍的"別吃我"信號，抗CD47抗體可以作為腫 瘤免疫系統(tǒng)中的非常有前景的靶點，在人類腫瘤治療方面發(fā)揮強大而有效的作用。
[0245] 本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0246] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0247] 實施例1抗原蛋白及陽性對照抗體的制備
[0248] 1.1抗原基因合成及表達載體構(gòu)建：
[0249]融合人源和猴源⑶47蛋白胞外區(qū)氨基酸序列與連接肽-hIgGIFc或連接肽_7his氨 基酸序列，氨基酸序列設(shè)計如SEQ ID N0:29,30,31，32所示：
[0250] 上述設(shè)計的人和猴CD47蛋白胞外區(qū)融合蛋白（CD47ECD-連接肽-hIgGIFc或 CD47ECD-連接肽-7his)所對應(yīng)的氨基酸序列進行密碼子人工優(yōu)化，如SEQ ID N0: 33，34， 35，36在5 '端加上Hind IΠ 酶切位點和Kozak序列GCCGCCACC，3 '端加上終止密碼子TAG和 EcoR I酶切位點，并委托金斯瑞公司合成優(yōu)化后的DNA，克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提 供)載體中，獲得人和猴pUC57simple-CD47-連接肽-hIgGIFc和或CD47ECD-連接肽-7his質(zhì) 粒。
[0251] 酶切（Hind III和EcoR I)人和猴的質(zhì)粒pUC57simple-CD47-連接肽-hIgGIFc、 pUC57 s imp 1 e-CD47ECD-連接肽-7hi s和載體pcDNA3 · 1，電泳回收得到的融合基因片段CD47-連接肽-hIgGIFc和CD47ECD-連接肽-7his，并與pcDNA3.1載體進行連接反應(yīng)重組構(gòu)建獲得 表達質(zhì)粒：
[0252] pcDNA3 · 1-人 CD47-連接肽-hIgGIFc;
[0253] pcDNA3 · 1-人 CD47ECD-連接肽-7his;
[0254] pCDNA3 · 1-猴 CD47-連接肽-hIgGIFc;
[0255] pcDNA3 · 1-猴 CD47ECD-連接肽-7his;
[0256] 陽性抗體基因合成及表達載體構(gòu)建
[0257] pAb抗體序列如下：
[0258] PABHjnSEQIDN0:37,38K*:
[0259] PABL，如SEQ ID NO :39,40所示：
[0260] 上述的抗體序列所對應(yīng)的氨基酸序列進行密碼子人工優(yōu)化，在5'端加上Hind III 酶切位點和Kozak序列GCCGCCACC，3 '端加上終止密碼子TAG和EcoR I酶切位點，并委托金斯 瑞公司合成優(yōu)化后的DNA，克隆到pUC57s imp 1 e (金斯瑞公司提供）載體中，獲得 pUC57simple-PCABH，pUC57simple-PCABL 質(zhì)粒，將質(zhì)粒 pUC57simple-PCABH，pUC57simple-PCABL進行酶切后（Hind III和EcoR I)，電泳回收得到的基因片段PCABH，PCABL，并與 pcDNA3.1載體進行連接反應(yīng)重組構(gòu)建獲得pcDNA3. l-PCABH、pcDNA3.1-PCABL。
[0261] 1.2瞬轉(zhuǎn)表達
[0262] 對pcDNA3·1-PCABH、
[0263] pcDNA3.1-PCABL.
[0264] pcDNA3 · 1-人 CD47-連接肽-hIgGIFc;
[0265] pcDNA3 · 1-人 CD47ECD-連接肽-7his;
[0266] pcDNA3 · 1-猴 CD47-連接肽-hIgGIFc;
[0267] pcDNA3.1-猴CD47ECD-連接肽_7his;進行瞬時表達。
[0268] 使用Freestyle? 293F細胞在Freestyle培養(yǎng)基中進行瞬轉(zhuǎn)表達。轉(zhuǎn)染前24小時， 在125ml錐形瓶中接種0.6X106細胞/ml的293F細胞，37°C5%C0 2溫箱中130rpm搖床培養(yǎng)。轉(zhuǎn) 染時先取60微升的293fectin加入到lml的OPtiMEM中，充分混勻后，室溫孵育5分鐘；同時將 重組載體和按3:2:1的比例進行混合，總0嫩的量為3(^8，溶于11111的0?丨^^1中。然后將0嫩 和293fectin充分混合，總體積為2ml，室溫孵育15分鐘，然后將混合物全部加入細胞培養(yǎng)孔 中，混勻，37 °C 5 % C02溫箱中130rpm搖床培養(yǎng)7天。將培養(yǎng)液進行高速離心、微孔濾膜抽真空 過濾。
[0269] 1.3蛋白純化
[0270] 根據(jù)廠家提供的操作方法采用Protein A柱（蛋白純化液相色譜系統(tǒng)/AKTA Purifier 10，GE)進行純化，得到純化的人roL-1-mIgG2aFc融合蛋白。AKTA用超純水沖洗干 凈連接lml rProtianA Fast Flow預(yù)裝柱到AKTA上;清洗：用1M HAC清洗5個柱體積。平衡： 20mM PB 0.15M NaCl(pH 7.0)平衡5個柱體積。
[0271 ] 上樣:將細胞表達上清樣品lOOOrpm X 5min離心，取上清，8000rpm X 30min離心，取 20ml離心后上清上樣，流速0.2ml/min。平衡：20mM PB 0.15M NaCl(pH 7.0)平衡5個柱體 積，(K2ml/min。清洗：20mM PB 1M NaCl(pH 7.0)清洗 5 個柱體積。平衡：20mM PB 0.15M NaCl(pH 7.0)平衡5個柱體積。
[0272] 洗脫:20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0)洗脫，流速0.21111/1^11。群280至100mAu時開始 收集，降至lOOmAu時停止收集。用1M Tris將樣品pH調(diào)節(jié)至pH6~8，如圖1~2。
[0273] 實施例2單克隆雜交瘤的制備
[0274] 1、小鼠的免疫：
[0275] 以抗原與佐劑的體積為1:1的比例對免疫原人⑶47_hFc(實施例1制得)進行乳化， 首次免疫使用弗氏完全佐劑乳化抗原，2周后，開始第二次免疫，使用弗氏不完全佐劑乳化 抗原，皮下2點注射，每只小鼠注射的抗原的量為1 Oyg，每個注射點注射的體積為25yL。
[0276] 在第二次免疫后3天，對小鼠進行眼眶采血，取少量血液樣本進行血清效價檢測， 經(jīng)間接ELISA方法檢測血清效價滴度達到1:200000或者以上后，對小鼠進行加強免疫。
[0277] 共進行3組免疫，每組為5只小鼠。
[0278] 2、飼養(yǎng)細胞和骨髓瘤細胞的準(zhǔn)備
[0279]飼養(yǎng)細胞的準(zhǔn)備，剪開正常BALB/C小鼠（拉頸處死)的腹部皮膚。暴露腹膜。用注射 器吸取DMEM培養(yǎng)基后，注入小鼠腹腔中，洗滌吸取出腹腔巨噬細胞，收集于離心管中 1500rmp/min離心3min，取下層褐色沉淀重懸后備用。重復(fù)上述步驟獲取3只正常小鼠的腹 腔巨噬細胞。
[0280]骨髓瘤細胞準(zhǔn)備，提前一周復(fù)蘇P3X63Ag8.653,并用含IX 8-氮鳥嘌呤的完全培養(yǎng) 基培養(yǎng)，融合前兩天換用15 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，維持P3X63Ag8.653的密度為70 % -80 % 至融合當(dāng)天。
[0281] 3、細胞融合及HAT篩選：
[0282] 脾細胞的獲取和制備:取加強免疫后的小鼠2只（標(biāo)記為L1、L2)，采集L1、L2的免疫 血清后處死并浸泡于75%酒精中。剪開免疫小鼠的腹部側(cè)面的皮膚和腹膜，暴露脾臟。用剪 尖剔除周圍組織獲取脾臟，用研磨棒研磨后，經(jīng)細胞篩網(wǎng)過濾后制備成單細胞懸液。
[0283] 細胞融合前處理:收集培養(yǎng)瓶內(nèi)的P3X63Ag8.653，1000rpm/5min離心后棄上清，重 懸后進行活細胞計數(shù)。2000rpm/5min離心脾細胞懸液，棄上清后重懸并進行活細胞計數(shù)。記 錄P3X63Ag8.653活細胞數(shù)，脾細胞活細胞數(shù)。
[0284] 細胞融合：按脾細胞:P3X63Ag8.653 = 5:1的比例混合細胞，2000rpm/5min離心后 倒凈上清，震散細胞沉淀，在37 °C水浴中緩慢滴加 lmL預(yù)熱的50 % PEG1500溶液，并使管底在 37 °C水中劃圈搖動，上述操作時間控制在lmin左右，靜置反應(yīng)30 s，于管內(nèi)由慢到快地加入 37°C預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基，終止反應(yīng)。將終止反應(yīng)后的細胞懸液800rpm離心3min后棄去上清， 輕輕震散細胞沉淀。
[0285] HAT培養(yǎng)基篩選:配制含1 X HAT、1 X青-鏈霉素、15 %胎牛血清和85 %DMEM培養(yǎng)基 的HAT篩選培養(yǎng)基。用上述的HAT篩選培養(yǎng)基重懸鼠雜交瘤細胞和飼養(yǎng)細胞，并混合兩者。按 300μ1/孔將細胞懸液加到20塊96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)1周 后，用HT培養(yǎng)基進行第一次換液，并置于37 °C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);培養(yǎng)3天后，用HT培養(yǎng)基進 行第二次換液。
[0286] 4、陽性細胞株的篩選
[0287] 融合后2周，取細胞上清進行ELISA實驗，檢測細胞上清與人CD47_his蛋白的結(jié)合 情況，篩選出ELISA結(jié)果為陽性的細胞后，進行第二次Elisa實驗的復(fù)測;取復(fù)測結(jié)果為陽性 的細胞上清進行FACS實驗，檢測細胞上清與jurkat細胞表面CD47蛋白的結(jié)合情況。
[0288] 5、擴大培養(yǎng)
[0289] 將ELISA和FACS檢測為雙陽性的細胞株從96孔中轉(zhuǎn)入24孔中培養(yǎng)，待長滿后轉(zhuǎn)入 25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
[0290] 6、有限稀釋法亞克隆
[0291] 吹打混勾陽性細胞株，并吸取少量進行活細胞計數(shù)。吸取約100個細胞加入40mL完 全培養(yǎng)基中混勻，鋪板2塊;另吸取約100個細胞加入20mL完全培養(yǎng)基中混勻，鋪板1塊;另吸 取約1000個細胞加入20mL完全培養(yǎng)基中混勻，鋪板1塊;共以3個不同的細胞密度鋪板4塊， 分別為〇. 5細胞/孔，1細胞/孔，10細胞/孔。將96孔板置37 °C 5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0292] 7、克隆檢測和擴大培養(yǎng)
[0293] 取單克隆細胞孔上清進行ELISA和FACS實驗，分別檢測細胞克隆抗體與人、猴 CD47-his標(biāo)簽的結(jié)合及與jurkat細胞表面CD47蛋白的結(jié)合情況。將ELISA和FACS檢測為雙 陽性的細胞株(共 7株，分別標(biāo)記為059-1.11.1、059-1.20.1、059-1.30.1、059-1.43.1、059_ 1.51.2、059-1.82.1、059-1.100.5)從96孔中轉(zhuǎn)入24孔中培養(yǎng)，待長滿后轉(zhuǎn)入25cm 2培養(yǎng)瓶 中培養(yǎng)。
[0294] 8、亞類的鑒定
[0295] 包被羊抗鼠 IgG(Fc)，2μg/ml，每孔50yL，4°C過夜，BSA封閉，加入待測細胞上清，室 溫，2小時，加入酶標(biāo)亞類二抗IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG2c，IgG3，k，A(abcam)，顯色，450nm讀 數(shù)，判斷所測細胞株的亞類為IgG3或IgM或IgGl，κ。
[0296] 其中，抗體059-1.82.1的重鏈恒定區(qū)為鼠 IgG3，輕鏈恒定區(qū)為鼠 κ鏈的恒定區(qū)， 059-1.30.1、059-l. 43.1和059-1.20.1都為鼠 IgGl，輕鏈恒定區(qū)為鼠 κ鏈的恒定區(qū)，〇59-1.11. 1、059-1.51.2、059-1.100.5的重鏈恒定區(qū)為鼠 IgM，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1-7中的一個，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:8-14中的一個。
[0297] 在加液前每步用PBST洗滌3次。
[0298] 9、細胞凍存
[0299] 凍存液配制:90 %胎牛血清，10 % DMS0。
[0300] 重懸培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞，細胞計數(shù)后，以1500印111/1^11離心31^11后棄去上清，用含10% DMS0的胎牛血清進行吹打懸浮，以每管5 X 106細胞數(shù)凍存于凍存盒內(nèi)，-80°C過夜，次日轉(zhuǎn) 入液氮中。
[0301] 10、單克隆雜交瘤基因保存
[0302] 取陽性單克隆細胞株RNA抽提液提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于_80°C永久保存。 [0303]實施例3單克隆抗體制備及鑒定
[0304] 1.采用體外培養(yǎng)法制備抗體
[0305]對實施例2制得的雜交瘤細胞株進行復(fù)蘇，方法為將含有10%胎牛血清、1 %青鏈 霉素的DMEM培養(yǎng)基復(fù)蘇并使用小瓶培養(yǎng)，待細胞匯合度約90%后，進行傳代擴培，擴培至細 胞培養(yǎng)上清共約200mL。
[0306] 2.抗體純化
[0307]收集培養(yǎng)約7天左右的細胞上清，測量體積（約200mL)，加入NaCl使上清中NaCl為 2.5M，經(jīng)0.22μπι混合纖維素微孔濾膜真空過濾后，4°C保存，Protein A親和層析進行抗體純 化。上樣:含2.5M NaCl的細胞培養(yǎng)上清經(jīng)0.22μπι慮膜過濾后濃縮至30ml后直接上樣;流洗： pH 7.4 2.5M PBS流洗，沖至UV280基線為0;洗脫:pH3.5 0.1M檸檬酸溶液，每段2ml收集洗 脫液，每管加入1〇〇μ1 1M Tris溶液;濃縮收集液，使用PBS洗脫至初始成分比例小于0.1%。 跑SDS-PAGE膠核實純化抗體純度。（圖3)
[0308]實施例4單克隆抗體基因測序和重組抗體的制備 [0309] 1.單克隆抗體基因測序
[0310] 經(jīng)免疫、融合以及單克隆化后，基于親和力實驗結(jié)果選取059-1.11.1、059_ 1 · 20 · 1、059-1 · 30 · 1、059-1 · 43 · 1、059-1 · 51 · 2、059-1 · 82 · 1、059-1 · 100 · 5、單克隆抗體細胞 株進行總RNA提取，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板PCR擴增抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈 可變區(qū)。
[0311 ]抗體基因重鏈和輕鏈的序列分析。7株單克隆抗體總RNA采用Invitrogen公司的 Tn/o_reagent試劑盒（15596-026)試劑盒按照其說明書進行提取，提取結(jié)果見圖4。
[0312] 接著采用Takara公司的5'RACE FULL試劑盒(D315)，以總RNA為模板，試劑盒中的 隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，然后重鏈以恒定區(qū)設(shè)計引物(mlgG R)和試劑盒中的接 頭引物進行PCR擴增，輕鏈以恒定區(qū)設(shè)計引物(mlgK R)和試劑盒中的接頭引物進行PCR擴 增。mlgG R和mlgK R的序列如下：
[0313] mlgG R:CTCAGGGAARTARCCYTTGAC，（如SEQ ID 從)：41所示）；
[0314] mlgK R:TCACTGCCATCAATCTTCCAC，（如SEQ ID 從):42所示）；
[0315] 7個單克隆抗體細胞株的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)PCR擴增后電泳檢測如圖5，
[0316] 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR片段進行TA克隆后調(diào)單克隆進行PCR鑒定，鑒定引 物為M13-F和M13-R，鑒定正確熱菌株中選取部分樣品送至Invitrogen測序。最終確定重鏈 可變區(qū)蛋白序列為SEQ ID NO: 1~7;輕鏈可變區(qū)蛋白序列為SEQ ID N0:8~14;重鏈核苷酸 序列為SEQ ID NO: 15~21;輕鏈核苷酸序列為SEQ ID NO:22~28:
[0317] 鑒定引物M13-F，如下：
[0318] 5'TGTAAAACGACGGCCAGT3'，（如SEQ ID 從):43所示）；
[0319] 鑒定引物M13-R，如下：
[0320] 5，CAGGAAACAGCTATGACC3,，（如SEQ ID 從)：44所示）。
[0321]
[0322]
[0323] 實施例5親和力測定及競爭性ELISA檢測
[0324] 1.與人 CD47 結(jié)合測定(ELISA)
[0325] 包被:hCD47-his用ros稀釋成lμg/ml，加至酶標(biāo)板96孔中，每孔100yL，4°C下孵育 過夜。封閉：洗板三次后用1 %BSA+PBS封閉，每孔300yL，室溫條件下孵育2小時。加候選抗 體:洗板3次后，加入候選抗體的細胞培養(yǎng)上清或陽性對照或陰性對照。每孔100μΙ，室溫條 件下2小時。加二抗:洗板3次后，加入山羊抗小鼠 IgG Fc，HRP(1:10000)，每孔100yL，室溫條 件下反應(yīng)1小時。顯色:洗板4次后，加 TMB顯色液，每孔100yL，室溫下避光顯色10分鐘。終止： 直接加入l〇〇yL每孔的終止液終止反應(yīng)，。檢測:終止反應(yīng)后立即把酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在 450nm處測其0D值，保存原始數(shù)據(jù)整理如下表2:
[0326] 表2候選克隆與人CD47的ELISA檢測OD450值
[0327]
[0328] 2.與猴 CD47 結(jié)合測定(ELISA) 1 包被:猴CD47-his用PBS稀釋成lμg/ml，加至酶標(biāo)板96孔中，每孔100yL，4°C下孵育 過夜。封閉：洗板三次后用1 %BSA+PBS封閉，每孔300yL，室溫條件下孵育2小時。加候選抗 體:洗板3次后，加入候選抗體的細胞培養(yǎng)上清或陰性對照。每孔100μΙ，室溫條件下2小時。 加二抗:洗板3次后，加入山羊抗小鼠 IgG Fc，HRP( 1:10000)，每孔100yL，室溫條件下反應(yīng)1 小時。顯色:洗板4次后，加 TMB顯色液，每孔100yL，室溫下避光顯色10分鐘。終止:直接加入 100yL每孔的終止液終止反應(yīng)，。檢測：終止反應(yīng)后立即把酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm處 測其0D值，保存原始數(shù)據(jù)整理如下表3:
[0330] 表3候選克隆與猴CD47的ELISA檢測0D值
[0331]
[0332]
[0333] 3.與人⑶47蛋白的親和力測定
[0334] 使用Biacore T200儀器檢測人⑶47抗體的親和力常數(shù)，通過氨基共價結(jié)合將抗小 鼠 Fc抗體(GE Healthcare公司，BR-1008-38)偶聯(lián)在CM5生物傳感芯片(GE Healthcare公 司）上，芯片上的抗小鼠 Fc抗體捕獲候選單克隆抗體或陽性對照B6H12(商業(yè)化CD47抗體，購 自Abeam，貨號：ab3283)，不同濃度的人⑶47以30yL/min流速流過過芯片上的候選抗體，人 CD47與候選抗體進行結(jié)合，結(jié)合時間為120s，解離時間為300s.用BIAevalution軟件(GE Healthcare公司）進行動力學(xué)擬合，親和力最高為059_1· 82.1獲得親和力常數(shù)結(jié)果如下表 4：
[0335] 表4候選克隆與人CD47的親和力測定結(jié)果
[0336]
[0337] 實施例6劑量依賴性阻斷人CD47與人SIRP的結(jié)合(ELISA法）
[0338] 包被:人CD47-hFc用PBS稀釋成2μg/ml，加至酶標(biāo)板96孔中，每孔100yL，4°C下孵育 過夜。封閉：洗板3次后用1 %BSA+roS封閉，每孔300yL，室溫下孵育1小時。候選抗體與SIRP α-his的混合:純化的候選抗體分別用PBST稀釋成20μg/ml，以PBST溶液進行3倍梯度稀釋， 共稀釋7個梯度;人SIRPa-his蛋白用PBST稀釋成500ng/mL，l: 1混合不同稀釋梯度的候選抗 體和人SIRPa-his蛋白，室溫下孵育30min。加候選抗體與人SIRPa-his蛋白的混合物:每孔 lOOyL，室溫下反應(yīng)lh，對照孔加入IgG同種型對照與人SIRP-his蛋白的混合物。加二抗:洗 板3次后，加入抗His標(biāo)簽抗體，HRP(1:3000)，每孔1 OOyL，室溫條件下反應(yīng)1小時。顯色:洗板 4次后，加 TMB顯色液，每孔100yL，室溫下避光顯色10分鐘。終止:直接加終止液終止反應(yīng)，每 孔100此。檢測：終止反應(yīng)后立即把酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm處測其0D值，保存原始數(shù) 據(jù)。數(shù)據(jù)處理:將原始數(shù)據(jù)輸入到軟件SoftMax Pro 6.2.1中進行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果如表5、圖6 所示(圖中的數(shù)據(jù)為最終計算所得數(shù)據(jù)）。
[0339] 表5候選抗體阻斷⑶47與SIRP結(jié)合的結(jié)果
[0340]
[0341]
[0347] ~結(jié)果顯示，候選抗體與細胞表面CD47
有明顯的結(jié)合活性。
[0348] 實施例8⑶47抗體介導(dǎo)小鼠腹腔原代巨噬細胞對Jurkat細胞的吞噬實驗
[0349] 1 .C57鼠腹腔原代巨噬細胞制備
[0350] 弓丨頸殺死動物，手提鼠尾將全鼠浸入70%酒精中3~5秒。置動物于解剖臺上，用針 頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射 器注10ml Eagle液入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動。用 針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)。小心拔 出針頭，把液體注入離心管中，250g 4°C離心10分鐘，去上清，加 10ml Eagle培養(yǎng)基，計數(shù) 細胞。為獲取3 X 105貼附細胞/平方厘米，需接種2.5 X 106/ml。為純化培養(yǎng)細胞，去除其它白 細胞，接種數(shù)小時后，去除培養(yǎng)液，用Eagle液沖洗1~2次后，再加新Eagle培養(yǎng)液置37°C， 5%C0 2溫箱中培養(yǎng)。
[0351] 2.巨噬細胞吞噬實驗
[0352] 通過熒光成像法考察實施例5制備的CD47抗體對C57BL小鼠腹腔原代巨噬細胞對 Jurkat細胞吞噬作用的影響。提前一天用H(H26染料對小鼠巨噬細胞進行染色（4微摩、 5min)，以2萬細胞/孔接種于96孔板;次日用CFSE染料染色Jurkat細胞(2微摩、lOmin)，清洗 后Jurkat細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，以8萬細胞/孔接種于巨噬細胞上。接板Jurkat細胞 前2小時將巨噬細胞中有血清培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，將各種抗體以10微克/ml的濃度加 入到兩種混懸細胞中。培養(yǎng)2小時后，洗去未被吞噬的Jurkat細胞，熒光顯微鏡進行細胞成 像后，通過計算每100個巨噬細胞中吞噬多少Jurkat細胞，即吞噬指數(shù)，來定量分析⑶47抗 體促吞噬作用的優(yōu)劣。結(jié)果見圖8(吞噬效果圖）和表7(吞噬指數(shù)）36!112(商業(yè)化CD47抗體， 購自Abeam，貨號:ab3283)，與文獻報道一致，促吞噬作用較弱。實施例5四個篩選出的抗體 分子，都有良好促吞噬作用，尤其是059-1.30.1，059-1.43.1，和059-1.82.1 ·
[0353] 表7CD47抗體促進巨噬細胞對Jurkat細胞的吞噬 「03541
12 實施例9CD47抗體體外誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡實驗 2 收集對數(shù)生長的Jurkat細胞，無血清培養(yǎng)基清洗后，用5%FBS_1640制備單細胞懸 液，將細胞重懸至10 X l〇5/ml，按照5 X 105/孔，即500μ1/孔加入24孔板培養(yǎng)。實驗設(shè)計加入 ⑶47抗體的（終濃度為1 Oμg/ml)，50μ1 /孔，設(shè)置anti-Fas陽性對照孔，無需加入抗體的孔則 用相同體積的培養(yǎng)基補入。5h后收集細胞懸液到1.5ml EP管中，離心500g X 5min。棄上清， 各管加入100μΙ PBS重懸混勾細胞，膜聯(lián)蛋白_V(Roche Diagnostics)4°C避光染色30分鐘。 PBS清洗3次，各管加入500μ1 PBS重懸混勻細胞，流式上機前10-15min加入PI (終濃度為1μ g/ml)流式上機檢測膜聯(lián)蛋白-V陽性和膜聯(lián)蛋白-V、PI雙陽性細胞占總細胞比例即為 Jurkat細胞的凋亡率。結(jié)果見表8:
[0357] 表8CD47抗體誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡
[0358]
[0359]
[0360] B6H12不誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡，而測定四個059抗體都不同程度誘導(dǎo)Jurkat細胞的 凋亡，059-1.30.1作用最強。059-1.30.1在促進巨噬細胞吞噬和誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡均表 現(xiàn)最佳。
[0361]以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種抗CD47單克隆抗體，其特征在于，其具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)： (I) 所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示； (II) 所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 10或 SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12或SEQ ID NO :13或SEQ ID NO :14所示； (III) (I)或（II)所述氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的、且與 (I)或（II)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列;或 (IV) 與（I)或(II)所述序列至少有80%同源性的氨基酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD47單克隆抗體，其特征在于，所述多個為2個、3個、4個、5 個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21 個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個或32個。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD47單克隆抗體，其特征在于，所述取代發(fā)生于高變區(qū)； 所述重鏈可變區(qū)的高變區(qū)為HVR-H1，HVR-H2，HVR-H3; SEQIDN0:2的高變區(qū)HVR-H1序列如SEQIDN0:45所示；HVR-H2序列如SEQIDN0:46 所示;HVR-H3序列如SEQIDN0:47所示； SEQIDN0:5的高變區(qū)HVR-H1序列如SEQIDN0:48所示；HVR-H2序列如SEQIDN0:49 所示;HVR-H3序列如SEQIDN0:50所示； SEQIDN0:6的高變區(qū)HVR-H1序列如SEQIDN0:51所示；HVR-H2序列如SEQIDN0:52 所示;HVR-H3序列如SEQIDN0:53所示； 所述輕鏈可變區(qū)的高變區(qū)為HVR-L1，HVR-L2，HVR-L3; SEQ ID NO: 9的高變區(qū)HVR-L1序列如SEQ ID NO: 54所示；HVR-L2序列如SEQ ID NO: 55 所示;HVR-L3序列如SEQ ID NO :56所示； SEQ ID NO:12的高變區(qū)HVR-L1序列如SEQ ID NO:57所示；HVR-L2序列如SEQ ID NO:58 所示;HVR-L3序列如SEQ ID NO :59所示； SEQ ID NO:13的高變區(qū)HVR-L1序列如SEQ ID NO:60所示；HVR-L2序列如SEQ ID NO:61 所示;HVR-L3序列如SEQ ID NO :62所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD47單克隆抗體，其特征在于，其具有： (i) 氨基酸序列為SEQIDN0:l，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQID NO: 8的輕鏈可變區(qū)； (ii) 氨基酸序列為SEQ ID N0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQID NO: 9的輕鏈可變區(qū)； (iii) 氨基酸序列為SEQIDN0:l，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQID NO: 10的輕鏈可變區(qū)； (iv) 氨基酸序列為SEQ ID N0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQID NO: 11的輕鏈可變區(qū)； (V) 氨基酸序列為SEQIDN0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQID NO: 12的輕鏈可變區(qū)； (VI) 氨基酸序列為SEQ ID N0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQID NO: 13的輕鏈可變區(qū)； (VΠ )氨基酸序列為SEQIDN0:1，2,3,4,5,6,7的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列為SEQID NO :14的輕鏈可變區(qū)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4任一項所述的抗CD47單克隆抗體，其特征在于，其重鏈類型為 IgGl，IgG3或IgM;其輕鏈類型為κ。6. 編碼如權(quán)利要求1~5任一項所述的抗CD47單克隆抗體的核苷酸。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的核苷酸，其特征在于，具有 (I) 如SEQIDN0:15-21所示的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；如SEQIDN0:22-28所示的 輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列;或 (II) 如SEQ ID NO: 15-21所示的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列的互補序列；如SEQ ID NO: 22-28所示的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的互補序列;或 (III) 與（I)或（II)的核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與（I)或 (II)的核苷酸序列不同的序列;或 (IV) 與（I)或(II)或(III)所述序列至少有80%同源性的序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的核苷酸，其特征在于，具有與（I)或（II)或（III)或（IV)所 示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸而獲得的、且與（I)或（II)或（III) 或（IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。9. 根據(jù)權(quán)利要求6至8任一項所述的核苷酸，其特征在于，所述多個為2個、3個、4個、5 個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21 個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個或32個。10. -種表達載體，其特征在于，包括權(quán)利要求6~9任一項所述的核苷酸。11. 一種宿主細胞，其特征在于，轉(zhuǎn)化權(quán)利要求10所述的表達載體。12. -種抗原，其特征在于，具有如SEQ ID NO:29~32任一項所示的氨基酸序列。13. 產(chǎn)生權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體的雜交瘤細胞株。14. 權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括： 步驟1:以權(quán)利要求12所述的抗原免疫小鼠后，獲得小鼠的脾細胞； 步驟2:融合所述脾細胞和骨髓瘤細胞，篩選能夠與CD47結(jié)合的雜交瘤細胞株，經(jīng)體外 培養(yǎng)，制得抗CD47單克隆抗體。15. 權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體經(jīng)化學(xué)標(biāo)記或生物標(biāo)記制得的結(jié)合 物。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的結(jié)合物，其特征在于，所述化學(xué)標(biāo)記為同位素、免疫毒素和/ 或化學(xué)藥物;所述生物標(biāo)記為生物素、親和素或酶標(biāo)記。17. 權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體或權(quán)利要求15~16任一項所述的結(jié)合 物與固體介質(zhì)或半固體介質(zhì)偶聯(lián)制得的偶聯(lián)物。18. 權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體、權(quán)利要求15~16任一項所述的結(jié)合 物和/或權(quán)利要求17所述的偶聯(lián)物在制備檢測CD47表達的產(chǎn)品中的應(yīng)用。19. 一種試劑盒，其特征在于，權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體、權(quán)利要求 15~16任一項所述的結(jié)合物和/或權(quán)利要求17所述的偶聯(lián)物。20. 權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體、權(quán)利要求15~16任一項所述的結(jié)合 物和/或權(quán)利要求17所述的偶聯(lián)物在制備阻斷CD47與SIRPa結(jié)合的制劑中的應(yīng)用。21. 權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體、權(quán)利要求15~16任一項所述的結(jié)合 物和/或權(quán)利要求17所述的偶聯(lián)物在制備提尚巨細胞對腫瘤細胞吞指數(shù)的制劑中的應(yīng) 用。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤細胞為人外周血白血病T細胞。23. 權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體、權(quán)利要求15~16任一項所述的結(jié)合 物和/或權(quán)利要求17所述的偶聯(lián)物在制備促進腫瘤細胞凋亡的制劑中的應(yīng)用。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤細胞為人外周血白血病T細胞。25. 權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體、權(quán)利要求15~16任一項所述的結(jié)合 物和/或權(quán)利要求17所述的偶聯(lián)物在制備防治疾病的藥物中的應(yīng)用； 所述疾病為白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、 膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和/或黑素瘤。26. -種藥物，其特征在于，包括權(quán)利要求1~5任一項所述抗CD47單克隆抗體、權(quán)利要 求15~16任一項所述的結(jié)合物和/或權(quán)利要求17所述的偶聯(lián)物。27. -種疾病的診斷方法，其特征在于，以權(quán)利要求19所述的試劑盒檢測CD47表達，根 據(jù)CD47的表達量判斷是否患有疾??； 所述疾病為白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、 膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和/或黑素瘤。28. -種疾病的防治方法，其特征在于，給予權(quán)利要求26所述的藥物;所述疾病為白血 病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng) 膠質(zhì)瘤和/或黑素瘤。
【文檔編號】G01N33/68GK106084052SQ201610436519
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】馮曉, 金磊, 肖亮, 王濤, 秦鎖富
【申請人】長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司