一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，該方法經(jīng)過(guò)孢子的制備,孢子懸浮液的制備,以及在菌株液體培養(yǎng)時(shí),在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入β?谷甾醇和甜菜堿，從而增加極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的產(chǎn)量；采取本發(fā)明，一是優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件使激活蛋白產(chǎn)量提高四倍多，二是培養(yǎng)基成分均源自植物，來(lái)源方便安全，價(jià)格便宜，便于規(guī)?；a(chǎn)；三是研究了搖瓶發(fā)酵的動(dòng)態(tài)參數(shù)，獲得了適宜菌株生長(zhǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基；研究了接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值、搖瓶裝液量和溫度等對(duì)發(fā)酵的影響，確定了極細(xì)鏈格孢菌產(chǎn)激活蛋白培養(yǎng)基組成，以及最適搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件。
【專利說(shuō)明】
一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的増產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，尤其涉及在極細(xì)鏈格孢菌培 養(yǎng)基中加入β-谷留醇與甜菜堿，提高其激活蛋白產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 極細(xì)鏈格孢菌(Alternaria tenuissima)作為自然生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的 重要成員，既可引起植物病害，又可作為有用的生物資源為人類所利用。其在生物防治、生 物除草劑、環(huán)境廢棄物處理、品種選育等方面顯現(xiàn)出可利用的廣闊前景。研究表明，細(xì)極鏈 格孢菌對(duì)環(huán)境污染物具有較強(qiáng)的降解作用，能產(chǎn)生酸性蛋白酶和β-l，3葡聚糖酶，分解硫化 橡膠并能在合成纖維上存活;此外，還能產(chǎn)生具有抗病增產(chǎn)功能的多種蛋白激發(fā)子【邱德 文，微生物蛋白農(nóng)藥研究進(jìn)展，中國(guó)生物防治，2004，20(2):91-94】。
[0003] 激活蛋白有較強(qiáng)的誘導(dǎo)植物抗病，促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及抗旱、抗逆的生物活性。不同 來(lái)源的激活蛋白在理化性質(zhì)上略有差異，但生物活性相近或相似。該類激活蛋白主要通過(guò) 激活植物體內(nèi)分子免疫系統(tǒng)，提高植物自身免疫力;激發(fā)植物體內(nèi)的一系列代謝調(diào)控，促進(jìn) 植物根莖葉生長(zhǎng)，從而達(dá)到提高作物產(chǎn)量的目的。隨著可持續(xù)農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展以及化學(xué)農(nóng) 藥抗性和污染問(wèn)題的日益嚴(yán)重，生物農(nóng)藥越來(lái)越受到重視，并成為綜合防治的主要部分。植 物激活蛋白農(nóng)藥是基于誘導(dǎo)增強(qiáng)植物抗病性、抗逆性而研制的新型蛋白質(zhì)農(nóng)藥，產(chǎn)品安全 無(wú)毒，對(duì)植物有顯著抗病增產(chǎn)作用，同時(shí)能提高作物品質(zhì)【邱德文，楊秀芬，蛋白質(zhì)農(nóng)藥研究 與產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展，中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2006,8(6): 1-4】，生產(chǎn)上可以減少或不使用化學(xué)農(nóng)藥， 生產(chǎn)的產(chǎn)品可以達(dá)到綠色產(chǎn)品和有機(jī)食品的要求，特別是在有機(jī)蔬菜和果品生產(chǎn)中將發(fā)揮 重要作用，符合當(dāng)前我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，有利于提高農(nóng)產(chǎn)品附加值，具有非常廣闊的市 場(chǎng)前景和良好的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
[0004] 極細(xì)鏈格孢菌是一種好氧微生物，一般在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上采用菌絲塊接種培 養(yǎng)，這種方法獲得的激活蛋白產(chǎn)量低。培養(yǎng)出的種子往往形成較大的團(tuán)塊，不利于進(jìn)一步發(fā) 酵培養(yǎng)。而采用孢子懸浮液的方法可以彌補(bǔ)上述不足。如金鑫等人在馬鈴薯液體培養(yǎng)基上 培養(yǎng)極細(xì)鏈格孢菌，60h后獲得激活蛋白1.39 g/L(金鑫，產(chǎn)激活蛋白極細(xì)鏈格孢菌發(fā)酵工 藝優(yōu)化和中試生產(chǎn)技術(shù)，碩士學(xué)位論文，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，2007)，經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基 和培養(yǎng)條件后，激活蛋白產(chǎn)量為5.17 g/L【金鑫，提高蛋白激發(fā)子產(chǎn)量的培養(yǎng)基及發(fā)酵條 件的優(yōu)化.微生物學(xué)雜志，2009,29(2): 6-11】。
[0005] 極細(xì)鏈格孢菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)速度較快，產(chǎn)生較多的菌絲，之后到達(dá)靜止期、衰 亡期。由于激活蛋白是一類初級(jí)代謝產(chǎn)物，本發(fā)明為了增大激活蛋白的產(chǎn)量，設(shè)想延長(zhǎng)極細(xì) 鏈格孢菌的生長(zhǎng)期。細(xì)胞衰老必然會(huì)涉及膜結(jié)構(gòu)的變化，其中谷留醇在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中起 著支架的作用，能阻止細(xì)胞雙層膜由流動(dòng)相向凝膠相的轉(zhuǎn)變，保持細(xì)胞膜完整性，從而延緩 細(xì)胞的衰老【吳時(shí)敏，吳謀成，植物留醇的研究進(jìn)展與趨向，中國(guó)油脂，2002,27(2):73-75】。 甜菜堿有維持細(xì)胞滲透壓的作用。當(dāng)受鹽堿或水分脅迫時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中積累大量有機(jī)滲透調(diào) 節(jié)劑如甜菜堿，而將細(xì)胞質(zhì)中的無(wú)機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑擠向液泡，使細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)液泡環(huán)境維 持滲透平衡，這樣避免了細(xì)胞質(zhì)高濃度無(wú)機(jī)離子對(duì)酶和代謝的毒害(王歡，BADH基因轉(zhuǎn)化羊 草的研究，碩士學(xué)位論文，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008)。甜菜堿的溶解度很高，不帶凈電荷，其高 濃度對(duì)許多酶及其他生物大分子沒(méi)有影響，甚至有保護(hù)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)現(xiàn)狀，往培養(yǎng)基中加入了 β-谷留醇和甜菜堿，與現(xiàn)有技術(shù)相 比，使激活蛋白的產(chǎn)量增加了四倍以上，同時(shí)公開了適合極細(xì)鏈格孢菌發(fā)酵產(chǎn)激活蛋白的 培養(yǎng)基和產(chǎn)孢條件，提供了 一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法。
[0007] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于 具體步驟如下：（1)孢子的制備:在無(wú)菌操作臺(tái)中，火焰保護(hù)下用接種針將-90~-70°c凍存 管中保存的極細(xì)鏈格孢菌菌絲，涂布在PSA培養(yǎng)基平板上，放入培養(yǎng)皿中并將培養(yǎng)皿邊緣用 封口膜封死，在20~35°C的恒溫條件下，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直到其變黑產(chǎn)孢；（2)孢子懸 浮液的制備:在無(wú)菌操作臺(tái)中，取出培養(yǎng)皿中的PSA培養(yǎng)基平板，在PSA培養(yǎng)基平板上打取菌 絲塊，將一定量的已滅菌的0.05%吐溫-20的蒸餾水均勻的傾注在菌絲塊表面，將孢子與菌 絲分離并懸浮在無(wú)菌水中，之后將菌懸液過(guò)濾后得到孢子懸浮液儲(chǔ)存在無(wú)菌環(huán)境中備用； (3)極細(xì)鏈格孢菌液的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中，將制備好的孢子懸浮液接入裝有75~200mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL器皿中，每瓶接種3~20 mL，將接種后的器皿放入旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床中， 轉(zhuǎn)速為120~200 r/min，培養(yǎng)溫度為20~35°C，培養(yǎng)50~70h后即得；（4)激活蛋白的提取和 含量測(cè)定:將500mL器皿中培養(yǎng)的極細(xì)鏈格孢菌液抽濾到定性濾紙上，將抽濾好的菌餅連同 濾紙一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重，將干燥后的菌餅研磨成粉末，加入激活蛋白提取 緩沖液，振蕩均勻，在2~6°C冰箱中放置10~30 min，在沸水浴中加熱10~30 min，之后 12000~14000 r/min離心10~20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用雙縮脲方法測(cè)定 激活蛋白粗提液中激活蛋白的含量。
[0008] 所述的一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于按質(zhì)量組份，發(fā)酵培 養(yǎng)基為：1~5 g/L β-谷甾醇，1~5 g/L甜菜堿，12~18 g/L蔗糖，2~8 g/L玉米淀粉，15~ 25 g/L土豆淀粉，7~13 g/L谷氨酸，2~8 g/L胰蛋白胨，7~13 g/L黃豆粉，2~8 g/L硝酸 鉀。
[0009] 所述的一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于按質(zhì)量組份，發(fā)酵培 養(yǎng)基優(yōu)選為:4 g/L β-谷甾醇，2 g/L甜菜堿，15 g/L鹿糖，5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀 粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黃豆粉，5 g/L硝酸鉀。
[0010] 所述的一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基起始 pH5.5~8.5，用HC1或NaOH調(diào)成不同的pH值。
[0011] 所述的一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于激活蛋白提取緩沖液 為0.02 mol/L Tris緩沖液，用HC1 調(diào)pH到8.0。
[0012] 所述的一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于極細(xì)鏈格孢菌激活蛋 白的生物活性的測(cè)試方法為:將提取的極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白用蒸餾水稀釋成1~20 yg/ mL的蛋白液，將小麥種子用蛋白液浸泡7~9h，每處理20粒種子，置于鋪有至少兩層濕紗布 的培養(yǎng)皿中，以蒸餾水浸泡為空白實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理均重復(fù)2~4次，期間噴水使紗布保濕，至 少2天后觀察記錄小麥的發(fā)芽率，若各處理發(fā)芽率明顯高于空白對(duì)照，則認(rèn)為該蛋白處理有 激活蛋白活性。
[0013] 采取本發(fā)明，具有如下有益效果:一是優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件使激活蛋白產(chǎn)量 提高四倍多，從原來(lái)(馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基)的1.35 g/L提高到10.85 g/L以上;二是培養(yǎng)基成 分均源自植物，來(lái)源方便安全，價(jià)格便宜，便于規(guī)?；a(chǎn);三是研究了搖瓶發(fā)酵的動(dòng)態(tài)參 數(shù)，獲得了適宜菌株生長(zhǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基;研究了接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值、搖瓶裝液量 和溫度等對(duì)發(fā)酵的影響，確定了極細(xì)鏈格孢菌產(chǎn)激活蛋白培養(yǎng)基組成，以及最適搖瓶發(fā)酵 培養(yǎng)條件。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1是本發(fā)明在極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的生物活性測(cè)定中，八個(gè)實(shí)驗(yàn)組激活蛋白 產(chǎn)量(g/L)和種子發(fā)芽率(％)的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限 定。
[0016] -、實(shí)施例一。具體包括如下步驟： (1)孢子的制備:在無(wú)菌操作臺(tái)中，火焰保護(hù)下用接種針將-90~-70°C凍存管中保存的 極細(xì)鏈格孢菌菌絲，涂布在PSA培養(yǎng)基平板上，放入培養(yǎng)皿中并將培養(yǎng)皿邊緣用封口膜封 死，在20~35°C的恒溫條件下，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直到其變黑產(chǎn)孢。
[0017] (2)孢子懸浮液的制備：在無(wú)菌操作臺(tái)中，用6mm打孔器在PSA培養(yǎng)基上打取菌絲 塊，將5 mL的已滅菌的0.05%吐溫-20的蒸餾水均勻的傾注在菌絲塊表面，用已滅菌的玻璃 涂布棒輕輕掃過(guò)菌落表面，將孢子與菌絲分離并懸浮在無(wú)菌水中，之后將菌懸液用兩層紗 布過(guò)濾后得到孢子懸浮液儲(chǔ)存在無(wú)菌玻璃三角瓶中備用。
[0018] (3)極細(xì)鏈格孢菌液的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中，在四個(gè)500 mL三角燒瓶中中分別加 入75mL，100mL，150mL，200mL發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶接種孢子懸浮液8mL，將接種后的三角燒瓶放 入旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為120~200 r/min(優(yōu)選180 r/min)，培養(yǎng)溫度為20~35°C (優(yōu)選28°C)，培養(yǎng)50~70h(優(yōu)選60 h)后提取激活蛋白。
[0019] 其中的發(fā)酵培養(yǎng)基為：1~5g/L (優(yōu)選3 g/υβ-谷留醇(優(yōu)選3 g/L)，1~5 g/L(優(yōu) 選3 g/L)甜菜堿，12~18 g/L(優(yōu)選15 g/L)蔗糖，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)玉米淀粉，15~25 g/L(優(yōu)選20 g/L)土豆淀粉，7~13 g/(優(yōu)選10 g/L)L谷氨酸，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)胰蛋白 胨，7~13 g/L(優(yōu)選10 g/L)黃豆粉，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)硝酸鉀;且發(fā)酵培養(yǎng)基用HC1或 NaOH調(diào)成起始pH7.0。
[0020] (4)激活蛋白的提取和含量測(cè)定:將500mL搖瓶培養(yǎng)的極細(xì)鏈格孢菌液抽濾到定性 濾紙上，將抽濾好的菌餅連同濾紙一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重，將干燥后的菌餅在 研缽中研磨成粉末，加入激活蛋白提取緩沖液（0.02 mol/L Tris緩沖液，用HC1調(diào)pH到 8.0)，振蕩均勻，在2~6°C冰箱中放置10~30 min，在沸水浴中加熱10~30 min，之后12000 ~14000 r/min離心10~20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用雙縮脲方法測(cè)定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0021] (5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明75mL，100mL，150mL，200mL裝液量，激活蛋白產(chǎn)量分別為9.9g/L， 9 · 74g/L，9 · 72g/L，8 · 62g/L;所以培養(yǎng)基裝液量在75 mL比較適宜。
[0022]二、實(shí)施例二。具體包括如下步驟： (1)孢子的制備:在無(wú)菌操作臺(tái)中，火焰保護(hù)下用接種針將-90~-70°c凍存管中保存的 極細(xì)鏈格孢菌菌絲，涂布在PSA培養(yǎng)基平板上，放入培養(yǎng)皿中并將培養(yǎng)皿邊緣用封口膜封 死，在20~35°C的恒溫條件下，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直到其變黑產(chǎn)孢。
[0023] (2)孢子懸浮液的制備：在無(wú)菌操作臺(tái)中，用6mm打孔器在PSA培養(yǎng)基上打取菌絲 塊，將5 mL的已滅菌的0.05%吐溫-20的蒸餾水均勻的傾注在菌絲塊表面，用已滅菌的玻璃 涂布棒輕輕掃過(guò)菌落表面，將孢子與菌絲分離并懸浮在無(wú)菌水中，后將菌懸液用兩層紗布 過(guò)濾后儲(chǔ)存在無(wú)菌玻璃三角瓶中備用。
[0024] (3)極細(xì)鏈格孢菌液的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中，將制備好的孢子懸浮液接入裝有 100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的五個(gè)500 mL三角燒瓶中，接入不同體積(3%、5%、10%、15%、20%)的孢子懸 浮液，將接種后的三角燒瓶放入旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為120~200 r/min(優(yōu)選180 r/min)，培養(yǎng)溫度為20~35°C(優(yōu)選28°C)，培養(yǎng)50~70h(優(yōu)選60 h)后提取激活蛋白。
[0025]其中的發(fā)酵培養(yǎng)基為：1~5g/L (優(yōu)選3 g/L)i3-谷留醇(優(yōu)選3 g/L)，l~5 g/L(優(yōu) 選3 g/L)甜菜堿，12~18 g/L(優(yōu)選15 g/L)蔗糖，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)玉米淀粉，15~25 g/L(優(yōu)選20 g/L)土豆淀粉，7~13 g/(優(yōu)選10 g/L)L谷氨酸，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)胰蛋白 胨，7~13 g/L(優(yōu)選10 g/L)黃豆粉，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)硝酸鉀;且發(fā)酵培養(yǎng)基用HC1或 NaOH調(diào)成起始pH7.0。
[0026] (4)激活蛋白的提取和含量測(cè)定:將500mL搖瓶培養(yǎng)的極細(xì)鏈格孢菌液抽濾到定性 濾紙上，將抽濾好的菌餅連同濾紙一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重，將干燥后的菌餅在 研缽中研磨成粉末，加入激活蛋白提取緩沖液（0.02 mol/L Tris緩沖液，用HC1調(diào)pH到 8.0)，振蕩均勻，在2~6°C冰箱中放置10~30 min，在沸水浴中加熱10~30 min，之后12000 ~14000 r/min離心10~20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用雙縮脲方法測(cè)定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0027] (5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3%、5%、10%、15%、20%的接種量，激活蛋白產(chǎn)量分別為6.84 g/L， 7.9 g/L，9.66 g/L，9.64 g/L，9.32 g/L;所以10%的接種量的發(fā)酵結(jié)果激活蛋白產(chǎn)量最大。 [0028]三、實(shí)施例三。具體包括如下步驟： (1)孢子的制備:在無(wú)菌操作臺(tái)中，火焰保護(hù)下用接種針將-90~-70°c凍存管中保存的 極細(xì)鏈格孢菌菌絲，涂布在PSA培養(yǎng)基平板上，放入培養(yǎng)皿中并將培養(yǎng)皿邊緣用封口膜封 死，在20~35°C的恒溫條件下，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直到其變黑產(chǎn)孢。
[0029] (2)孢子懸浮液的制備：在無(wú)菌操作臺(tái)中，用6mm打孔器在PSA培養(yǎng)基上打取菌絲 塊，將5 mL的已滅菌的0.05%吐溫-20的蒸餾水均勻的傾注在菌絲塊表面，用已滅菌的玻璃 涂布棒輕輕掃過(guò)菌落表面，將孢子與菌絲分離并懸浮在無(wú)菌水中，后將菌懸液用兩層紗布 過(guò)濾后儲(chǔ)存在無(wú)菌玻璃三角瓶中備用。
[0030] (3)極細(xì)鏈格孢菌液的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中，將制備好的孢子懸浮液接入裝有 1 OOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的五個(gè)500 mL三角燒瓶中，接入1 OmL的孢子懸浮液，將接種后的三角燒瓶 放入旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床中，分別設(shè)置轉(zhuǎn)速為120 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，培 養(yǎng)溫度為20~35°C(優(yōu)選28°C)，培養(yǎng)50~70h(優(yōu)選60 h)后提取激活蛋白。
[0031]其中的發(fā)酵培養(yǎng)基為：1~5g/L (優(yōu)選3 g/L)i3-谷留醇(優(yōu)選3 g/L)，1~5 g/L(優(yōu) 選3 g/L)甜菜堿，12~18 g/L(優(yōu)選15 g/L)蔗糖，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)玉米淀粉，15~25 g/L(優(yōu)選20 g/L)土豆淀粉，7~13 g/(優(yōu)選10 g/L)L谷氨酸，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)胰蛋白 胨，7~13 g/L(優(yōu)選10 g/L)黃豆粉，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)硝酸鉀;且發(fā)酵培養(yǎng)基用HC1或 NaOH調(diào)成起始pH7.0。
[0032] (4)激活蛋白的提取和含量測(cè)定:將500mL搖瓶培養(yǎng)的極細(xì)鏈格孢菌液抽濾到定性 濾紙上，將抽濾好的菌餅連同濾紙一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重，將干燥后的菌餅在 研缽中研磨成粉末，加入激活蛋白提取緩沖液（0.02 mol/L Tris緩沖液，用HC1調(diào)pH到 8.0) ，振蕩均勻，在2~6°C冰箱中放置10~30 min，在沸水浴中加熱10~30 min，之后12000 ~14000 r/min離心10~20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用雙縮脲方法測(cè)定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0033] (5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)速 120 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，激活蛋白產(chǎn) 量分別為6.42 g/L，8.1 g/L，9.66 g/L，9.62 g/L;所以轉(zhuǎn)速為 180 r/min比較適宜。
[0034] 四、實(shí)施例四。具體包括如下步驟： (1)孢子的制備:在無(wú)菌操作臺(tái)中，火焰保護(hù)下用接種針將-90~-70°c凍存管中保存的 極細(xì)鏈格孢菌菌絲，涂布在PSA培養(yǎng)基平板上，放入培養(yǎng)皿中并將培養(yǎng)皿邊緣用封口膜封 死，在20~35°C的恒溫條件下，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直到其變黑產(chǎn)孢。
[0035] (2)孢子懸浮液的制備：在無(wú)菌操作臺(tái)中，用6mm打孔器在PSA培養(yǎng)基上打取菌絲 塊，將5 mL的已滅菌的0.05%吐溫-20的蒸餾水均勻的傾注在菌絲塊表面，用已滅菌的玻璃 涂布棒輕輕掃過(guò)菌落表面，將孢子與菌絲分離并懸浮在無(wú)菌水中，后將菌懸液用兩層紗布 過(guò)濾后儲(chǔ)存在無(wú)菌玻璃三角瓶中備用。
[0036] (3)極細(xì)鏈格孢菌液的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中，將制備好的孢子懸浮液接入裝有 1 OOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的五個(gè)500 mL三角燒瓶中，接入1 OmL的孢子懸浮液，將接種后的三角燒瓶 放入旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為120~200 r/min(優(yōu)選180 r/min)180 r/min，分別在 20°C，25°C，28°C，31°C，35°C的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)50~70h(優(yōu)選60 h)后提取激活蛋白。 [0037]其中的發(fā)酵培養(yǎng)基為：1~5g/L (優(yōu)選3 g/L)i3-谷留醇(優(yōu)選3 g/L)，1~5 g/L(優(yōu) 選3 g/L)甜菜堿，12~18 g/L(優(yōu)選15 g/L)蔗糖，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)玉米淀粉，15~25 g/L(優(yōu)選20 g/L)土豆淀粉，7~13 g/(優(yōu)選10 g/L)L谷氨酸，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)胰蛋白 胨，7~13 g/L(優(yōu)選10 g/L)黃豆粉，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)硝酸鉀;且發(fā)酵培養(yǎng)基用HC1或 NaOH調(diào)成起始pH7.0。
[0038] (4)激活蛋白的提取和含量測(cè)定:將500mL搖瓶培養(yǎng)的極細(xì)鏈格孢菌液抽濾到定性 濾紙上，將抽濾好的菌餅連同濾紙一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重，將干燥后的菌餅在 研缽中研磨成粉末，加入激活蛋白提取緩沖液（0.02 mol/L Tris緩沖液，用HC1調(diào)pH到 8.0) ，振蕩均勻，在2~6°C冰箱中放置10~30 min，在沸水浴中加熱10~30 min，之后12000 ~14000 r/min離心10~20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用雙縮脲方法測(cè)定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0039] (5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)溫度20 °C，25 °C，28 °C，31 °C，35°C，激活蛋白產(chǎn)量分別為 8.28 g/L，9.04 g/L，9.66 g/L，9.24 g/L，8.1 g/L;所以培養(yǎng)溫度28°C較為適宜。
[0040]五、實(shí)施例五。具體包括如下步驟： (1)孢子的制備:在無(wú)菌操作臺(tái)中，火焰保護(hù)下用接種針將-90~-70°C凍存管中保存的 極細(xì)鏈格孢菌菌絲，涂布在PSA培養(yǎng)基平板上，放入培養(yǎng)皿中并將將培養(yǎng)皿邊緣用封口膜封 死，在20~35°C的恒溫條件下，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直到其變黑產(chǎn)孢。
[0041] (2)孢子懸浮液的制備：在無(wú)菌操作臺(tái)中，用6mm打孔器在PSA培養(yǎng)基上打取菌絲 塊，將5 mL的已滅菌的0.05%吐溫-20的蒸餾水均勻的傾注在菌絲塊表面，用已滅菌的玻璃 涂布棒輕輕掃過(guò)菌落表面，將孢子與菌絲分離并懸浮在無(wú)菌水中，后將菌懸液用兩層紗布 過(guò)濾后儲(chǔ)存在無(wú)菌玻璃三角瓶中備用。
[0042] (3)極細(xì)鏈格孢菌液的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中，將制備好的孢子懸浮液接入裝有 1 OOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的七個(gè)500 mL三角燒瓶中，接入1 OmL的孢子懸浮液，將接種后的三角燒瓶 放入旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為120~200 r/min(優(yōu)選180 r/min)180 r/min，培養(yǎng)溫 度為20~35°C(優(yōu)選28°C)，培養(yǎng)50~70h(優(yōu)選60 h)后提取激活蛋白。
[0043]其中的發(fā)酵培養(yǎng)基為：1~5g/L (優(yōu)選3 g/L)i3-谷甾醇(優(yōu)選3 g/L)，l~5 g/L(優(yōu) 選3 g/L)甜菜堿，12~18 g/L(優(yōu)選15 g/L)蔗糖，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)玉米淀粉，15~25 g/L(優(yōu)選20 g/L)土豆淀粉，7~13 g/(優(yōu)選10 g/L)L谷氨酸，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)胰蛋白 胨，7~13 g/L(優(yōu)選10 g/L)黃豆粉，2~8 g/L(優(yōu)選5 g/L)硝酸鉀;且發(fā)酵培養(yǎng)基用HC1或 NaOH調(diào)成起始分別設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值為5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5。
[0044] (4)激活蛋白的提取和含量測(cè)定:將500mL搖瓶培養(yǎng)的極細(xì)鏈格孢菌液抽濾到定性 濾紙上，將抽濾好的菌餅連同濾紙一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重，將干燥后的菌餅在 研缽中研磨成粉末，加入激活蛋白提取緩沖液（0.02 mol/L Tris緩沖液，用HC1調(diào)pH到 8.0)，振蕩均勻，在2~6°C冰箱中放置10~30 min，在沸水浴中加熱10~30 min，之后12000 ~14000 r/min離心10~20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用雙縮脲方法測(cè)定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0045] (5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明？!1值5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，激活蛋白產(chǎn)量分別為5.76 8/1， 7.68 g/L，9.58 g/L，9.66 g/L，9.7 g/L，8.42 g/L，8.06 g/L;所以培養(yǎng)基起始ρΗ6·5-7·5 較為適宜。
[0046] 六、制得的極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的生物活性測(cè)定： 1、本實(shí)驗(yàn)分為8組(所述發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH7.0): (D發(fā)酵培養(yǎng)基為1 g/L 谷甾醇，5 g/L甜菜堿，15 g/L蔗糖，5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黃豆粉，5 g/L硝酸鉀； :'1)發(fā)酵培養(yǎng)基為2 g/L β-谷甾醇，4 g/L甜菜堿，15 g/L蔗糖，5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黃豆粉，5 g/L硝酸鉀； 議發(fā)酵培養(yǎng)基為3 g/L β-谷甾醇，3 g/L甜菜堿，15 g/L蔗糖，5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黃豆粉，5 g/L硝酸鉀； 發(fā)酵培養(yǎng)基為4 g/L β-谷甾醇，2 g/L甜菜堿，15 g/L蔗糖，5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黃豆粉，5 g/L硝酸鉀； 發(fā)酵培養(yǎng)基為5 g/L β-谷甾醇，1 g/L甜菜堿，15 g/L蔗糖，5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黃豆粉，5 g/L硝酸鉀； @發(fā)酵培養(yǎng)基為15 g/L蔗糖，5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黃豆粉，5 g/L硝酸鉀； (?)發(fā)酵培養(yǎng)基為200 g/L馬鈴薯，20 g/L蔗糖； 空白組為蒸餾水。
[0047] 2、上述中的ip~(2)組按照以下步驟分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)提取激活蛋白，測(cè)定生物活性， 具體如下： (1)孢子的制備:在無(wú)菌操作臺(tái)中，火焰保護(hù)下用接種針將-90~-70°C凍存管中保存的 極細(xì)鏈格孢菌菌絲，涂布在PSA培養(yǎng)基平板上，之后放入培養(yǎng)皿中將培養(yǎng)皿邊緣用封口膜封 死，在20~35°C的恒溫條件下，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直到其變黑產(chǎn)孢。
[0048] (2)孢子懸浮液的制備：在無(wú)菌操作臺(tái)中，用6mm打孔器在PSA培養(yǎng)基上打取菌絲 塊，將5 mL的已滅菌的0.05%吐溫-20的蒸餾水均勻的傾注在菌絲塊表面，用已滅菌的玻璃 涂布棒輕輕掃過(guò)菌落表面，將孢子與菌絲分離并懸浮在無(wú)菌水中，后將菌懸液用兩層紗布 過(guò)濾后儲(chǔ)存在無(wú)菌玻璃三角瓶中備用。
[0049] (3)極細(xì)鏈格孢菌液的培養(yǎng):在無(wú)菌操作臺(tái)中，將制備好的孢子懸浮液接入裝有 100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角燒瓶中，每瓶接種10mL，將接種后的三角燒瓶放入旋轉(zhuǎn)式恒 溫?fù)u床中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為120~200 r/min(優(yōu)選180 r/min)180 r/min，培養(yǎng)溫度為20~35°C (優(yōu)選28°C)，培養(yǎng)50~70h(優(yōu)選60 h)后提取激活蛋白。
[0050] (4)激活蛋白的提取和含量測(cè)定:將500mL搖瓶培養(yǎng)的極細(xì)鏈格孢菌液抽濾到定性 濾紙上，將抽濾好的菌餅連同濾紙一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重，將干燥后的菌餅在 研缽中研磨成粉末，加入激活蛋白提取緩沖液（0.02 mol/L Tris緩沖液，用HC1調(diào)pH到 8.0)，振蕩均勻，在2~6°C冰箱中放置10~30 min，在沸水浴中加熱10~30 min，之后12000 ~14000 r/min離心10~20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用雙縮脲方法測(cè)定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0051] (5)將〔|)~(|)組提取的激活蛋白分別用蒸餾水稀釋成1~20 yg/mL(優(yōu)選3yg/mL) 的蛋白液，將小麥種子分別用蛋白液浸泡7~9 h(優(yōu)選8 h)，其它條件保持相同，每處理20 粒種子，置于鋪有兩層濕紗布的培養(yǎng)皿中于5°C培養(yǎng)，以蒸餾水浸泡為空白實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理 均重復(fù)2~4次;期間噴水使紗布保濕，至 少2天，一般3天后觀察記錄各組小麥的發(fā)芽率，結(jié)果如附圖1所示。 (6)從附圖1結(jié)果分析，各處理批次發(fā)芽率相差無(wú)幾，但明顯高于空白組，表明培養(yǎng)基中 加入β-谷留醇與甜菜堿與否，不影響激活蛋白的活性。
[0052] (7)從附圖1結(jié)果分析，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為:4 g/L β-谷留醇，2 g/L甜菜堿， 15 g/L鹿糖，5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黃 豆粉，5 g/L硝酸鉀。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于具體步驟如下：（1)孢子的制 備:在無(wú)菌操作臺(tái)中，火焰保護(hù)下用接種針將-90~-70°c凍存管中保存的極細(xì)鏈格孢菌菌 絲，涂布在PSA培養(yǎng)基平板上，放入培養(yǎng)皿中并將培養(yǎng)皿邊緣用封口膜封死，在20~35 °C的 恒溫條件下，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直到其變黑產(chǎn)孢;（2)孢子懸浮液的制備:在無(wú)菌操作臺(tái) 中，取出培養(yǎng)皿中的PSA培養(yǎng)基平板，在PSA培養(yǎng)基平板上打取菌絲塊，將一定量的已滅菌的 0.05%吐溫-20的蒸餾水均勻的傾注在菌絲塊表面，將孢子與菌絲分離并懸浮在無(wú)菌水中， 之后將菌懸液過(guò)濾后得到孢子懸浮液儲(chǔ)存在無(wú)菌環(huán)境中備用；（3)極細(xì)鏈格孢菌液的培養(yǎng)： 在無(wú)菌操作臺(tái)中，將制備好的孢子懸浮液接入裝有75~200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL器皿中， 每瓶接種3~20 mL，將接種后的器皿放入旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速為120~200 r/min，培養(yǎng) 溫度為20~35°C，培養(yǎng)50~70h后即得；（4)激活蛋白的提取和含量測(cè)定：將500mL器皿中培 養(yǎng)的極細(xì)鏈格孢菌液抽濾到定性濾紙上，將抽濾好的菌餅連同濾紙一起在烘箱中55~65°C 干燥至恒重，將干燥后的菌餅研磨成粉末，加入激活蛋白提取緩沖液，振蕩均勻，在2~6°C 冰箱中放置10~30 min，在沸水浴中加熱10~30 min，之后12000~14000 r/min離心10~ 20 min，取上清即得激活蛋白粗提液，使用雙縮脲方法測(cè)定激活蛋白粗提液中激活蛋白的 含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于按質(zhì)量 組份，發(fā)酵培養(yǎng)基為：1~5 g/L β-谷甾醇，1~5 g/L甜菜堿，12~18 g/L鹿糖，2~8 g/L玉 米淀粉，15~25 g/L土豆淀粉，7~13 g/L谷氨酸，2~8 g/L胰蛋白胨，7~13 g/L黃豆粉，2 ~8 g/L硝酸鉀。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于按質(zhì)量 組份，發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為:4 g/L β-谷留醇，2 g/L甜菜堿，15 g/L蔗糖，5 g/L玉米淀粉，20 g/L土豆淀粉，10 g/L谷氨酸，5 g/L胰蛋白胨，10 g/L黃豆粉，5 g/L硝酸鉀。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培 養(yǎng)基起始PH5.5~8.5，用HC1或NaOH調(diào)成不同的pH值。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于激活蛋 白提取緩沖液為0.02 mol/L Tris緩沖液，用HC1調(diào)pH到8.0。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白的增產(chǎn)方法，其特征在于極細(xì)鏈 格孢菌激活蛋白的生物活性的測(cè)試方法為:將提取的極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白用蒸餾水稀釋 成1~20 yg/mL的蛋白液，將小麥種子用蛋白液浸泡7~9h，每處理20粒種子，置于鋪有至少 兩層濕紗布的培養(yǎng)皿中，以蒸餾水浸泡為空白實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理均重復(fù)2~4次，期間噴水使紗 布保濕，至少2天后觀察記錄小麥的發(fā)芽率，若各處理發(fā)芽率明顯高于空白對(duì)照，則認(rèn)為該 蛋白處理有激活蛋白活性。
【文檔編號(hào)】C12N3/00GK106085869SQ201610437036
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月20日
【發(fā)明人】龔國(guó)華, 徐迪凡, 宋會(huì)鳴, 黃曉華
【申請(qǐng)人】浙江龍游東方阿納薩克作物科技有限公司