一種黑粉菌的分離方法及所用培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黑粉菌的分離方法及所用培養(yǎng)基，分離方法包括：將樣品涂皿培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基成分中不含任何氮源，按質量百分比含：碳源0.4％?1％、碳酸鈣0.2％?0.6％、硫酸鎂0.01?0.05％、磷酸二氫鉀0.01?0.03％、瓊脂粉1.2?2％，pH值6.5?7.0；該培養(yǎng)基中還含有能抑制細菌而不抑制真菌的抗生素；培養(yǎng)好后挑取白色單菌落進行搖菌培養(yǎng)至肉眼看出渾濁，若顯微觀察無其他雜菌污染，則該菌就是分離得到的目的菌株。本發(fā)明很大程度上解決了材料限制和大量雜菌污染這兩大問題，對分離材料無特殊要求，并極大的提高了黑粉菌的分離純化工作效率。
【專利說明】
一種黑粉菌的分離方法及所用培養(yǎng)基
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種菌種分離技術，具體涉及一種黑粉菌的分離方法及所用培養(yǎng)基。
【背景技術】 [0002] 黑粉菌病害是農(nóng)作物的一類重要病害，例如小麥矮腥黑穗病、水稻稻粒 黑粉病、高粱黑穗病和玉米瘤黑粉病等等，可導致作物嚴重減產(chǎn)。另一方面，一些黑粉菌的 次級代謝物如甘露糖赤鮮糖醇脂和黑粉菌酸等是重要的天然表面活性劑，近幾年正在被研 究開發(fā)，應用前景廣闊。無論是對黑粉菌病害的研究還是對其次級代謝物的開發(fā)利用，對各 類黑粉菌的分離純化都是相關研究中最為基礎的工作。提高黑粉菌的分離純化工作效率， 可顯著縮短初始階段的研究時長，加快科研進展。
[0003] 目前國內外公開專利中還沒有專門分離黑粉菌的方法，而在一些研究論文中有分 離獲得黑粉菌的相關報道。大概分為兩大類：
[0004] 1)對無黑粉菌病癥的材料用一般真菌的分離方法得到黑粉菌：
[0005] 這類分離方法一般從自然界中采集無黑粉菌病癥的樣品，經(jīng)表面消毒或不消毒， 將樣品水液化(加水等液體研磨等)后將液汁涂布于PDA、YH)或YM等氮源豐富的常用真菌培 養(yǎng)基中；在合適的溫度中培養(yǎng)到酵母類真菌菌落長出，大量挑取疑似菌落，搖菌培養(yǎng)，一步 步分離得到純化的菌株;對所有分離得到的菌株進行分子鑒定等以確定是否是黑粉菌。例 如，羊宋貞等從冰箱中取樣后用PDA分離真菌，從74種真菌中得到一個黑粉菌菌株 Pseudozyma aphidis(羊宋貞，馮廣達，姚青，等.家庭冰箱中的微生物種類調查[J].生物技 術通報，2013，1 (2): 195-200)，而分離過程則一般需要挑取比74更大數(shù)量的菌落，最終才獲 得這一個黑粉菌菌株。再例如，嚴亞萍等對底泥和土壤樣品用YM培養(yǎng)基對酵母類真菌進行 分離，在分離得到的201株酵母類菌株中只有1株為黑粉菌(嚴亞萍，李治瀅，董明華，等.云 南陽宗海酵母菌種群結構及產(chǎn)胞外酶測試[J].微生物學報，2013,53(11): 1205-1212);同 樣，分離過程需要挑取比201個菌株更多數(shù)量的菌落進行一步步分離，并逐一鑒定。
[0006] 該方法的缺點是:a、一般的真菌分離過程目的性較差，只能從材料中盡可能多的 分離出所有疑似真菌，再從眾多真菌中一一鑒定哪個菌株是黑粉菌;整個分離過程無法聚 焦于目標黑粉菌。b、基于a這樣人為的判斷疑似菌落的方法，有可能會遺漏、錯過黑粉菌菌 落。c、此類方法針對性差，主要原因在于使用真菌常用培養(yǎng)基，如PDA、YM培養(yǎng)基等(一般都 加上抗生素，能抑制大部分細菌生長），很多數(shù)真菌都能在這些培養(yǎng)基上正常生長，并且在 這些培養(yǎng)基上生長的黑粉菌和其他酵母真菌的菌落一般都很相似，因此從眾多的真菌菌落 中再進一步篩選分離出黑粉菌，難度仍較大，工作量大。d、很多酵母真菌的生長速度一般比 黑粉菌的生長速度要快，另外原材料中所含有的很多霉菌都能在真菌培養(yǎng)基中快速生長 (霉菌的生長速度比酵母真菌的長速更快）；因此，培養(yǎng)基平皿里一般長滿了各種各樣的真 菌菌落，其中絲狀真菌（如霉菌)和一些酵母真菌的長勢都超過黑粉菌，在黑粉菌還沒長成 可見的菌落時已經(jīng)被其它菌的菌落所覆蓋，很難挑到黑粉菌菌株。e、需要對分離出來的大 量菌株進行分子鑒定，耗費大量人力和財力。
[0007] 從文獻報道來看，此類方法獲得的所有真菌中黑粉菌占0.5%左右，而在分離過程 中黑粉菌菌落的比例甚至更少。因此，想用上述方法從無黑粉菌病癥的材料中篩選黑粉菌， 效率非常低，成功率很低。
[0008] 2)選擇有黑粉菌病癥的材料篩選分離黑粉菌：
[0009] 這類方法需要選取有黑粉菌病癥的材料(病塊組織或其中的成熟黑孢子），對材料 進行消毒處理后，再將病塊內部組織或認為含有黑粉菌菌體或孢子的液體置于TOA或YEPS 等培養(yǎng)真菌常用的培養(yǎng)基上進行分離篩選黑粉菌，一步步分離純化后對所有分離得到的疑 似菌株一一進行鑒定。例如，從黑粉病植物組織中收集孢子粉，經(jīng)消毒后分離黑粉菌 (Martinez C, Roux C,Jauneau A,et al. The biological cycle of Sporisorium reilianum f.sp.zeae:an overview using microscopy[J].Mycologia,2002,94(3):505-514；Zahiri A R,Babu M R,Saville B J.Differential gene expression during teliospore germination in Ustilago maydis[J].Molecular genetics and genomics, 2005,273(5) :394-403;路秀麗，姚艷飛，王宰.高粱黑粉菌的分離鑒定[J].食品科學，2011 (17): 243-245 ;高雅，石太淵，張華，等.高粱絲黑穗病菌離體培養(yǎng)技術[J].食品與發(fā)酵工 業(yè)，2009(12) :97-99)。又例如，對茭白莖干(茭白莖干膨大即為黑粉菌Ustilago esculenta 侵染的結果)表面消毒后，用內部組織切片等至于PDA中培養(yǎng)，一步步分離出黑粉菌（曹乾 超，張雅芬，崔海峰，等.菰黑粉菌分離方法的研究[J].長江蔬菜，2015(22): 195-197)。 [0010]該方法比上述方法1)有更強的針對性，然而其缺點也非常明顯:a、原材料來源限 制性較大，要收集有黑粉菌病癥的材料需要等待植物的發(fā)病時間，受植物的生長季節(jié)和地 域限制;常見的黑粉菌病害可能較容易收集到病癥材料，而不常見的黑粉菌資源則難以收 集到;病癥材料的收集較費時費力。b、雖然對原材料有表面消毒，然而仍很難避免大量的內 生真菌污染，特別是遠距離(異地)采樣后無法立即處理的材料，材料內部受雜菌污染的可 能性大大增加；內生菌雜菌污染程度仍很嚴重，分離純化難度大。c、采樣技術要求高，需要 采樣人員熟悉相關植物黑粉菌發(fā)病特征、能準確把握植物組織內部黑粉菌孢子的發(fā)育狀 態(tài)，如果材料內部黑粉菌孢子尚未成熟或成熟量少，能長出黑粉菌菌落的概率變小，雜菌菌 落比例則相對增大。d、平皿中各種酵母類真菌菌落與黑粉菌菌落區(qū)分不大，挑取菌落的準 確率較低。因此，該方法受到材料取樣的限制性大，且雜菌污染仍是個難題。 e、需要對分離 出來的較大量的菌株進行分子鑒定，耗費較多的人力和財力。
[0011]總而言之，此類分離方法需要獲得黑粉病癥明顯的材料，一步步分離過程中也需 要挑取較大量的菌落，并對純化的較多菌株進行一一鑒定。材料的獲得難度較大，其他酵母 類真菌的污染也較多，此方法的整體效率仍較低。

【發(fā)明內容】

[0012] 本發(fā)明的目的是提供一種黑粉菌的分離方法，對黑粉菌具有較強針對性的篩選功 能，對材料無限制，極大的降低雜菌污染率。
[0013] 本發(fā)明的技術方案為:一種黑粉菌的分離方法，包括：
[0014] 將樣品涂皿培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為固體HFJ培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分中不含任何氮源，按 質量百分比含：碳源〇 . 4 % -1 %、碳酸鈣0.2 % -0.6 %、硫酸鎂0.01-0.05 %、磷酸二氫鉀 0.01-0.03%、瓊脂粉1.2-2%，pH值6.5-7.0;該培養(yǎng)基中還含有能抑制細菌而不抑制真菌 的抗生素;所述碳源為蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇中的一種或幾種；
[0015] 培養(yǎng)好后挑取白色單菌落進行搖菌培養(yǎng)至肉眼看出渾濁，若顯微觀察無其他雜菌 污染，則該菌就是分離得到的目的菌株。
[0016] 本發(fā)明的樣品為預期含有黑粉菌的任何樣品。
[0017] 具體的，是在培養(yǎng)好的平皿中挑選無氣生菌絲、無反光光澤的白色菌落。
[0018] 在一個【具體實施方式】中，所述能抑制細菌而不抑制真菌的抗生素為鏈霉素和頭孢 霉素。
[0019] 在一個【具體實施方式】中，平皿中固體HFJ培養(yǎng)基的厚度不小于4毫米;若是液體樣 品直接涂皿或適當稀釋后涂皿，若是固體樣品則加無菌水后破碎、細化樣品取水液涂皿。
[0020] 在一個【具體實施方式】中，樣品涂皿后，保持平皿內透氣，隨后將平皿倒扣置于恒溫 培養(yǎng)箱中，24~30 °C培養(yǎng)3~5天。
[0021] 在一個【具體實施方式】中，挑取白色單菌落接種于加有能抑制細菌而不抑制真菌的 抗生素的液體YEPSL培養(yǎng)基或不加瓊脂的液體HFJ培養(yǎng)基。
[0022]在一個【具體實施方式】中，搖菌培養(yǎng)是在溫度為24~30°C、轉速為150~200rpm的恒 溫搖床中培養(yǎng)至肉眼看出渾濁。
[0023]若培養(yǎng)好后挑取的不是單菌落或是有細菌污染，需稀釋后再次涂布于固體HFJ培 養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，再次進行分離培養(yǎng)。
[0024]最后對目的菌株進行種屬鑒定。
[0025] 本發(fā)明還提供一種用于分離黑粉菌的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分中不含任何氮源，按質 量百分比含:碳源〇.4%-1%、碳酸鈣0·2%-0·6%、硫酸鎂0·01-0·05%、磷酸二氫鉀0·01-0.03%、瓊脂粉1.2-2%，pH值6.5-7.0;所述碳源為蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨 醇中的一種或幾種。
[0026] 目前報道的其他分離方法中所使用的培養(yǎng)基都含有豐富的氮源（如蛋白胨、酵母 提取物等），因此其他類型的微生物都能在此類培養(yǎng)基上快速生長;而本發(fā)明HFJ培養(yǎng)基中 不含任何氮源，很多微生物就無法在HFJ培養(yǎng)基上生長，但黑粉菌能正常生長。HFJ培養(yǎng)基極 大程度的抑制了其他菌類生長，提高了對黑粉菌的篩選效率。
[0027] 本發(fā)明對對象材料無限制，不管有無黑粉菌病癥，只要材料中含有黑粉菌就能將 其分咼出來。
[0028] 從本發(fā)明技術方案中的分離步驟可以看出，整個分離工作簡單高效，對材料無特 殊處理要求，只需簡單處理樣品、用一種培養(yǎng)基就能極大的降低雜菌污染，一次性分離到黑 粉菌菌株。若第一次挑菌不小心帶有雜菌污染，經(jīng)簡單稀釋再重復涂皿分離一次就能完成 分咼。
[0029]為提高分離黑粉菌的工作效率，本發(fā)明在第一步分離培養(yǎng)中對黑粉菌具有明顯的 篩選效果，極大的降低雜菌污染，雜菌率減少了90%以上，避免了分離真菌常規(guī)方法中需要 挑取大量菌落并需要一一鑒定所有菌株的繁瑣工作，極大的提高了分離純化黑粉菌的效 率。
[0030]與【背景技術】中"選擇有黑粉菌病癥的材料進行篩選分離黑粉菌"這一技術相比較， 本發(fā)明的優(yōu)點有：（1)樣品取樣無限制，科研人員可以從預期含有黑粉菌的各類樣品中分離 得到黑粉菌，不需要等待有黑粉病發(fā)病的材料。（2)樣品處理簡單，只需粉碎細化樣品即可； 無需消毒，并避免了實驗人員對消毒劑等有害物質的接觸。（3)在本發(fā)明固體HFJ分離培養(yǎng) 基上，很多菌類不宜生長，因此能極大程度的減少雜菌污染，雜菌污染率減少90%以上。（4) 本發(fā)明固體HFJ分離培養(yǎng)基上的黑粉菌一般為無氣生菌絲、無反光光澤的白色菌落，同此形 態(tài)判斷可極大的提高挑取目的菌落的準確性。（5)基于上述優(yōu)點，本發(fā)明能極大的提高黑粉 菌的分離工作效率。
[0031] 所以，本發(fā)明很大程度上解決了材料限制和大量雜菌污染這兩大問題，對分離材 料無特殊要求，并極大的提高了黑粉菌的分離純化工作效率。本發(fā)明具有操作簡單、經(jīng)濟實 用的特點，能廣泛的從各種材料分離得到黑粉菌。
【附圖說明】
[0032] 附圖1為四種培養(yǎng)基對無黑粉菌病癥鳳尾竹材料的分離效果對比圖。
【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明的一種黑粉菌的高效分離方法，在一個優(yōu)選的【具體實施方式】中，包括下述 的步驟：
[0034] 1.樣品米集
[0035] 樣品取樣無限制，可以為預期含有黑粉菌的各類樣品，無需有黑粉病病癥。例如， 取材于鳳尾竹、蘆葦、蘆荻、高粱、茭白（菰）、玉米等。
[0036] A液體樣品：用無菌的可密封管子裝好備用。
[0037] B固體樣品：24小時內使用的固體樣品，用干凈的保濕盒或袋子裝載待用；如果固 體樣品需要長距離或長時間運輸，用干凈的吸水性紙包裹4-10層后裝入保濕盒子或袋子中 運輸。
[0038]采集到的樣品應盡快做分離工作。
[0039] 2.黑粉菌分離培養(yǎng)基的準備
[0040] 配置固體HFJ分離培養(yǎng)基(該名稱為本發(fā)明自定義）：培養(yǎng)基成分中不含任何氮源， 按質量百分比，蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇中的一種或幾種〇.4%_1 %、碳酸 鈣0.2%-0.6%、硫酸鎂1%504,7!120 0.01-0.05%、磷酸二氫鉀1〇12?04 0.01-0.03%、瓊脂 粉1 · 2-2 %，余量為水，pH值6 · 5-7 · 0。
[0041] 配置的培養(yǎng)基裝瓶密封后經(jīng)高溫高壓滅菌處理。滅菌好的培養(yǎng)基可立即使用或放 置待用。
[0042]此培養(yǎng)基在液體狀態(tài)時、約65 °C時加入鏈霉素和頭孢霉素，使這兩種抗生素在培 養(yǎng)基中的終濃度均為80~120微克/毫升;在培養(yǎng)基凝固前倒平皿，使平皿中培養(yǎng)基厚度為4 ~6毫米，凝固冷卻至室溫后待用。平皿中培養(yǎng)基的厚度不宜小于4毫米，否則在后續(xù)培養(yǎng)中 容易失水干掉。
[0043]固體HFJ分離培養(yǎng)基中含有的抗生素不限制于鏈霉素和頭孢霉素，只要能抑制細 菌而不抑制真菌的抗生素都能使用，可使用一種抗生素或同時多種抗生素。
[0044] 3.樣品處理和涂皿培養(yǎng)
[0045] 3.1樣品若是液體樣品，則可以直接取50-200微升于涂皿或適當稀釋后涂皿。
[0046] 3.2樣品若是泥土、動植物組織等固體樣品，則取1-5克樣品加1-3毫升無菌水后破 碎、細化樣品，盡可能使樣品中含有的黑粉菌游離到水液中；樣品處理過程要求所用的器具 均為無菌，盡量避免樣品外的其他雜菌污染。
[0047] 3.3取樣品處理后的水液50-200微升涂布于上述HFJ分離培養(yǎng)皿中，涂好后平皿蓋 上蓋子，不要封□，保持平皿內透氣。隨后將平皿倒扣置于恒溫培養(yǎng)箱中，24~30°C培養(yǎng)3~ 5天(30 °C -般3天可培養(yǎng)好，24°C左右則需要4至5天）。
[0048] 4.挑取黑粉菌菌落初步分離
[0049] 在培養(yǎng)好的平皿中雜菌非常稀少，而無氣生菌絲、無反光光澤的白色菌落一般就 是黑粉菌菌落；同為白色菌落，但形態(tài)有差異的，有可能是不同的黑粉菌類型。直接挑取此 類白色單菌落(確保挑取的是單菌落)接種于加有濃度均為80~120微克/毫升鏈霉素和頭 孢霉素(或者換成抗細菌生長的其他抗生素）的液體YEPSL培養(yǎng)基(0.8~1.2 %酵母提取物、 0.3~0.5%蛋白胨和0.3~0.5%蔗糖）中。在溫度為24~30°C、轉速為150~200rpm的恒溫 搖床中培養(yǎng)至肉眼看出渾濁。
[0050] 取渾濁的菌體培養(yǎng)液3~10微升滴入干凈的載玻片中，在顯微鏡下觀察，若無其他 雜菌污染，則該菌就是分離得到的目的菌株。
[0051] 該步驟中，所用液體YEPSL培養(yǎng)基可以換成常用的真菌液體培養(yǎng)基，或者用液體 HFJ培養(yǎng)基（即不加瓊脂，其他組分及配比與步驟2相同；用HFJ液培養(yǎng)搖菌時使用蓋子能濾 菌透氣的瓶或管進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間適當增加1-3天）。液體培養(yǎng)基都需加有終濃度均為80 ~120微克/毫升鏈霉素和頭孢霉素(或者換成抗細菌生長的其他抗生素）。
[0052] 5.再次純化
[0053]若上述第4步挑取的不是單菌落或是顯微鏡觀察中有雜菌污染，則需要再次純化。 根據(jù)菌液渾濁度，取0.5~2微升菌液稀釋于lml無菌水中，混勻后取50~100微升再次涂布 于上述HFJ分離培養(yǎng)皿中，再次進行分離培養(yǎng)。重復第4步。一般到此就能純化出黑粉菌菌 株，黑粉菌的分離工作到此完成。
[0054] 6.菌株鑒定
[0055] 為進一步明確所分離黑粉菌是何種屬，則需要進行種屬鑒定。黑粉菌鑒定可以用 真菌分子鑒定的通用方法、比如ITS、18S和28S DNA序列等。
[0056] 以下通過具體實施例和對比實驗對本發(fā)明進行詳細的說明。
[0057] 實施例一
[0058]該實施例是從無黑粉菌病癥的鳳尾竹中分離黑粉菌。
[0059] 配置幾種固體培養(yǎng)基，分別為① PDA:200g去皮馬鈴薯煮水后最終過濾得馬鈴薯汁 約800ml，加20g葡萄糖、17g瓊脂粉，自然pH值，加純水定容至1L。②YEPSL:酵母提取物1%、 蛋白胨0.4%、蔗糖0.4%和瓊脂粉1.7%，自然pH值;另外，YEPSL液體培養(yǎng)基不加瓊脂粉。③ YPD:酵母提取物1 %、蛋白胨2%、葡萄糖2 %和瓊脂粉1.7 %。④HFJ分離培養(yǎng)基:蔗糖0.4%、 碳酸鈣0.5 %、硫酸鎂0.02 %、磷酸二氫鉀0.02 %、瓊脂粉1.5 %，調pH值至6.8。
[0060] 上述幾種培養(yǎng)基裝瓶密封，115°C、0.20Mpa高溫高壓滅菌18分鐘。加瓊脂粉的培養(yǎng) 基冷卻至60-65Γ時加入鏈霉素和頭孢霉素，兩者終濃度均為100微克/毫升。然后倒入無菌 的平皿中培養(yǎng)基厚度約為5毫米，凝固冷卻至室溫后待用。YEPSL液體培養(yǎng)基用于挑取菌落 搖菌培養(yǎng)。
[0061] 戴一次性PE手套，用無菌剪刀，從中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所院內的鳳尾竹上剪 取靠基部的葉片，裝入干凈的一次性自封袋中。放4°C冰箱內待用，并于12小時內用于分離 實驗。
[0062] 研缽經(jīng)110°C烘烤2小時，冷卻到室溫后，加入2ml無菌水;剪碎竹枝(包括竹葉和枝 條)樣品，稱2g混合樣品，放入研缽中搗碎，攪拌均勻。各吸取100微升水液涂布于①-④四種 培養(yǎng)基平皿上，蓋上平皿蓋子后不封口，倒扣平皿放置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
[0063] 培養(yǎng)結果如圖1。其中從roA和YEPSL平皿上分別挑取96個酵母樣菌落，從YPD中挑 取全部菌落共15個，從HFJ中挑取10個白色單菌落;分別接種于每孔含有200微升YEPSL液體 培養(yǎng)基(加有濃度均為100微克/毫升的鏈霉素和頭孢霉素)的無菌96孔板中，密封后放于28 °C、180rpm轉速的搖床中培養(yǎng)2天。
[0064] 培養(yǎng)好后從96孔板中取5微升菌液滴在玻片上顯微鏡觀察，從菌體形態(tài)上判斷是 否有雜菌污染和疑似黑粉菌個數(shù)，結果如表1。疑似黑粉菌是根據(jù)多種黑粉菌形態(tài)歸納的經(jīng) 驗作判斷。在此結果中，PDA的1個和YEPSL的2個疑似黑粉菌菌落均為混合菌落，需要重復分 離純化。
[0065] 表1無黑粉菌病癥鳳尾竹材料的分離效果計數(shù)
[0066]
[0067] ITS序列鑒定：提取菌株基因組DNA，用真菌ITS序列引物ITS1和1了34(1了31:5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3'，ITS 4:5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3'）對這些菌株基 因組DNA進行PCR擴增，直接用PCR產(chǎn)物測序后在NCBI上用Blastn比對分析。結果顯示，HFJ分 離出來的10個菌株均為黑粉菌科中的Pseudozyma aphidis;而YEPSL分離出來的2個疑似黑 粉菌中1個是黑粉菌Pseudozyma aphidis〇
[0068] 由圖1和表1數(shù)據(jù)可見，本發(fā)明對無黑粉菌病癥的材料中分離黑粉菌菌株的效率顯 著提高。（圖1中：PDA、YEPSL等真菌培養(yǎng)基中長出的絕大部分酵母類菌落為表面光滑、反光 的菌落，部分還帶有其他顏色;而本發(fā)明HFJ培養(yǎng)基中的黑粉菌菌落為無反光光澤的白色菌 落，與其他培養(yǎng)基的酵母類菌落有明顯區(qū)別，用肉眼可輕易區(qū)分。但由于圖1按規(guī)定為黑白 圖片，因而在此圖片上分辨不出明顯差異。）
[0069] 實施例二
[0070] 該實施例是從有黑粉菌病癥的茭白中分離黑粉菌（茭白莖干膨大是茭白黑粉菌 Ustilago esculenta侵染的結果）。
[0071] 本實施例與實施例一不同的地方是：只準備HFJ固體培養(yǎng)基和YEPLS的固體和液體 培養(yǎng)基。比較這兩種培養(yǎng)基對莖干膨大茭白材料的分離效果。其中，固體HFJ分離培養(yǎng)基配 比與實施例一稍微不同：葡萄糖1 %、碳酸鈣0.2%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.03%、瓊脂 粉2%，pH值6.5。
[0072]從每種培養(yǎng)基中各挑取15個菌落進行鑒定，結果:從YEPSL培養(yǎng)基中分離得出的酵 母類菌落全都是酵母菌；而從HFJ培養(yǎng)基中分離得到有兩種黑粉菌，分別是Ustilago esculenta和Pseudozyma aphidis。
[0073]其中兩個黑粉菌的ITS序列測序結果分別為：
[0074] >ITS Ustilago esculenta
[0075] TTCTTGAGGTGTGGCTCGCACCTGTCTAACTAAATCGAGCTACCACATTTTAACACGGTTGCATCGGTT GGCTGTCAAACAGTGCGCGCGGCGAATTCATTTTCGCCCGCGCTCTGCGAGACGGTCGACACTTTACCAAAAACACT GTTGATACCATAGGATTTGAACGTAGATGAAACTCGACTGGTAATGCGGTCGTCTAAAATCTAAAAACAACTTTTGG CAACGGATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAGTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCCGGCAGATCTAATCTGGGGAGCATGCCTGTTTGAGGGCCGCGAATTGT TTCGAACGACAGCTTTCTTATTTAGTTGAGAGAGCTGGCGGATCGGTATTGAGGGTCTTGCCATTTTCCACGGTGGC TCCCTCGAAATGCATTAGCGCATCCATTCGATAGGCAAGACGGACGAAAGCTCGTTATTTCGCCCACGTCTTTCCCT GCCGGGTTTTGATAATATCAGGACTTCGGAGAGGAAAGGCGCTGGGTCGAGGAGCTGGACGCGACGTTTTGCTGGTT GGAGTGCTTCTGAACCCCGCCCATGCCTCCTTCTCCGGAAGAGGAAGGGATTTAATTTCAATTCATCGGCCTCAGAT TGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA
[0076] >ITS Pseudozyma aphidis
[0077] TTCTTGAGGTGTGGCTCGCACCTGTCTAACTAAATCGAGCTACCACATTTTAACACGGTTGCATCGGTTGGCTGTCA AACAGTGCGCGCGGCGATTTATTTCGCCTCCCCGCGCATTGCCGAGACGGTCGACATTTACCAAAAACACTGTTGAT ACCATAGGATTTGAACGTAGATGAAACTCGACTGGTAATGCGGTCGTCTAAAATCTAAAAACAACTTTTGGCAACGG ATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAGTGAATCATCGAA TCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCCGGCAGATCTAATCTGGGGAGCATGCCTGTTTGAGGGCCGCGAATTGTTTCGAA CGACAGCTTTCTTATTTAGTTGAGAAAGCTGGCGGATCGGTATTGAGGGTCTTGCCATCTTCCACGGTGGCTCCCTC GAAATGCATTAGCGCATCCATTCGATAGGCAAGACGGACGAAAGCTCGTTATTTCGCCCACGTCTTTCCCTGCCGGG TTTTGATAATATCAGGACTTCGGAGAGGAGAGGCGCAGGGTCGAGGAGCTGGACGCGACGTTTTGCTGGTTGGAGTG CTTCTGAACCCCGCCCATGCCTCGCTTCTTTGGAAGAGAGGAAGGGATTTAATTTCAATTCATCGGCCTCAGATTGG TAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAaTAA
[0078] 由此可見，本發(fā)明從有黑粉菌病癥的材料中分離黑粉菌的效率也明顯提高。
[0079] 實施例三
[0080]該實施例是從無黑粉菌病癥的倉儲稻谷中分離黑粉菌。
[0081 ]本實施例與實施例二不同的地方是：只準備HFJ固體培養(yǎng)基和YEPLS液體培養(yǎng)基。 其中，固體HFJ分離培養(yǎng)基配比與實施例二稍微不同：甘露醇1 %、碳酸鈣0.4%、硫酸鎂 0.04%、磷酸二氫鉀0.05%、瓊脂粉2%，pH值7.0。
[0082]將無黑粉菌病癥的倉儲稻谷研磨后進行分離培養(yǎng)。
[0083]最后挑取10個無反光光澤的白色菌落進行培養(yǎng)鑒定，ITS序列比對結果：8個菌落 是Ustilago esculenta(在NCBI中比對相似度100% );另外2個菌落與NCBI中的Pseudozyma antarctica相似度是 100%。
[0084] >ITS Ustilago esculenta(稻谷）
[0085] TTTTCTTGAGGTGTGGCTCGCACCTGTCTAACTAAATCGAGCTACCACATTTTAACACGGTTGCATCGG TTGGCTGTCAAACAGTGCGCGCGGCGAATTCATTTTCGCCCGCGCTCTGCGAGACGGTCGACACTTTACCAAAAACA CTGTTGATACCATAGGATTTGAACGTAGATGAAACTCGACTGGTAATGCGGTCGTCTAAAATCTAAAAACAACTTTT GGCAACGGATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAGTGAA TCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCCGGCAGATCTAATCTGGGGAGCATGCCTGTTTGAGGGCCGCGAATT GTTTCGAACGACAGCTTTCTTATTTAGTTGAGAGAGCTGGCGGATCGGTATTGAGGGTCTTGCCATTTTCCACGGTG GCTCCCTCGAAATGCATTAGCGCATCCATTCGATAGGCAAGACGGACGAAAGCTCGTTATTTCGCCCACGTCTTTCC CTGCCGGGTTTTGATAATATCAGGACTTCGGAGAGGAAAGGCGCTGGGTCGAGGAGCTGGACGCGACGTTTTGCTGG TTGGAGTGCTTCTGAACCCCGCCCATGCCTCCTTCTCCGGAAGAGGAAGGGATTTAATTTCAATTCATCGGCCTCAG ATTGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA
[0086] >ITS Pseudozyma antarctica
[0087] TTTTCTTGAGGTGTGGCTCGCACCTGTCTAACTAAATCGAGCTACCACATTTTAACACGGTTGCATCGG TTGGCTGTCAAACAGTGCGCGCGGCGAATTCATTTTCGCCCGCGCTCTGCGAGACGGTCGACACTTTACCAAAAACA CTGTTGATACCATAGGATTTGAACGTAGATGAAACTCGACTGGTAATGCGGTCGTCTAAAATCTAAAAACAACTTTT GGCAACGGATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAGTGAA TCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCCGGCAGATCTAATCTGGGGAGCATGCCTGTTTGAGGGCCGCGAATT GTTTCGAACGACAGCTTTCTTATTTAGTTGAGCGAGCTGGCGGATCGGTATTGAGGGTCTTGCCATTTTCCACGGTG GCTCCCTCGAAATGCATTAGCGCATCCATTCGATAGGCAAGACGGACGAAAGCTCGTTATTTCGCCCACGTCTTTCC CTGCCGGGTTTTGATAATATCAGGACTTCGGAGAGGAAAGGCGCTGGGTCGAGGAGCTGGACGCGACGTTTTGCTGG TTGGAGTGCTTCTGAACCCCGCCCATGCCTCCTTCTCCGGAAGAGGAAGGGATTTAATTTCAATTCATCGGCCTCAG ATTGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
[0088] 實施例四
[0089] 該實施例是從無黑粉菌病癥的蘆葦莖葉中分離黑粉菌。
[0090]本實施例與實施例三不同的地方是:分離對象不同。采集蘆葦莖葉，剪取少許樣品 研磨后進行分離實驗。
[0091] 最后挑取8個無反光光澤的白色菌落進行培養(yǎng)鑒定，ITS序列比對結果:8個菌落均 是Pseudozyma hubeiensis(在NCBI中比對相似度 100% )
[0092] >ITS Pseudozyma hubeiensis
[0093] TTTTCTGAGGTGTGGCTCGCACCTGTCCAACTAAACTTGAGCTACCTTTTTTATACACGGTTGCATCGG TCGGCCTGTCCAACAGTGCGGGAATGTATTTTCCGGCGCTGAGCAGACGAGTCGGCACTTTACACAAACACTTTTGA TAATCTAGGATTTGAATGAAAGTTCATTTTTATGATGGATCCGACTGGTAATGCGGTCGTCTAAATCTAAAAAACAA CTTTTGGCAACGGATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAA GTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCCGGCAGATCTAATCTGGGGAGCATGCCTGTTTGAGGGCCGC GAATTGTTTCGAACGACAGCTTTTTTCAGTAAGAGCTGGCGGATCGGTATTGAGGGTCTTTTTGCCATTTACCGTGG CTCCCTCGAAATGCATTAGCGCATCCATTTGATAGGCGAAAGACGGACGAAAGCTTGATTTTTCGCCCTCTCTTCCC TGCCGGGTTTTGATAATATCAGGACTTCGGAGGCGGAGAAAGGGTTAGAGCTGGACGCAACGACTTTTGCTGGTTGG AGTGCTTCTGAACCCCGCCCTTTCTGTCAGAGAAAGGGATCTAATTTCAATTCATCGGCCTCAGATTGGTAGGACTA CCCGCTGAACTTAAGCATATCA
[0094] 從上述4個實施例可以看出，本發(fā)明可以從各種有黑粉菌的材料中快速、高效的分 離出黑粉菌，極大提高了黑粉菌的分離工作效率。
【主權項】
1. 一種黑粉菌的分離方法，其特征在于包括： 將樣品涂皿培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為固體HFJ培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分中不含任何氮源，按質量 百分比含：碳源0.4%-1%、碳酸鈣0.2%-0.6%、硫酸鎂0.01-0.05%、磷酸二氫鉀0.01- 0.03%、瓊脂粉1.2-2 %，pH值6.5-7.0;該培養(yǎng)基中還含有能抑制細菌而不抑制真菌的抗生 素;所述碳源為蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇中的一種或幾種； 培養(yǎng)好后挑取白色單菌落進行搖菌培養(yǎng)至肉眼看出渾濁，若顯微觀察無其他雜菌污 染，則該菌就是分離得到的目的菌株。2. 根據(jù)權利要求1所述的黑粉菌的分離方法，其特征在于樣品為預期含有黑粉菌的任 何樣品;所述能抑制細菌而不抑制真菌的抗生素為鏈霉素和頭孢霉素。3. 根據(jù)權利要求1所述的黑粉菌的分離方法，其特征在于平皿中固體HFJ培養(yǎng)基的厚度 不小于4毫米;若是液體樣品直接涂皿或適當稀釋后涂皿，若是固體樣品則加無菌水后破 碎、細化樣品取水液涂皿。4. 根據(jù)權利要求1~3之一所述的黑粉菌的分離方法，其特征在于樣品涂皿后，保持平 皿內透氣，隨后將平皿倒扣置于恒溫培養(yǎng)箱中，24~30°C培養(yǎng)3~5天。5. 根據(jù)權利要求1所述的黑粉菌的分離方法，其特征在于培養(yǎng)好的平皿中挑選無氣生 菌絲、無反光光澤的白色菌落。6. 根據(jù)權利要求1~3和5之一所述的黑粉菌的分離方法，其特征在于挑取白色單菌落 接種于加有能抑制細菌而不抑制真菌的抗生素的液體YEPSL培養(yǎng)基或不加瓊脂的液體HFJ 培養(yǎng)基。7. 根據(jù)權利要求6所述的黑粉菌的分離方法，其特征在于搖菌培養(yǎng)是在溫度為24~30 °C、轉速為150~200rpm的恒溫搖床中培養(yǎng)至肉眼看出渾濁。8. 根據(jù)權利要求1~3、5和7之一所述的黑粉菌的分離方法，其特征在于若培養(yǎng)好后挑 取的不是單菌落或是有細菌污染，需稀釋后再次涂布于固體HFJ培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，再次進 行分咼培養(yǎng)。9. 根據(jù)權利要求1所述的黑粉菌的分離方法，其特征在于目的菌株進行種屬鑒定。10. -種用于分離黑粉菌的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基成分中不含任何氮源，按質量百 分比含：碳源〇.4%-1%、碳酸鈣0.2%-0.6%、硫酸鎂0.01-0.05%、磷酸二氫鉀0.01- 0.03%、瓊脂粉1.2-2%，pH值6.5-7.0;所述碳源為蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨 醇中的一種或幾種。
【文檔編號】C12R1/645GK106085880SQ201610541712
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月11日
【發(fā)明人】李智敏, 嚴準, 嚴理, 余永廷, 高春生, 曾糧斌, 陳佳, 程毅, 孫向平, 薛召東
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所