一種石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑及其制備方法，所述制劑中含有重量比為2:2～4:1～2:1～2的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌。并且最終制得的制劑(包括復(fù)合微生物粉狀制劑和復(fù)合微生物液體制劑)中枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的活菌量分別為：6.0×109～9.0×1010CFU/ml、6.0×109～9.0×1010CFU/ml、3.0×108～9.0×109CFU/ml和3.0×107～9.0×109CFU/ml。該復(fù)合微生物制劑活菌含量高、水分含量低，穩(wěn)定性高，能夠有效吸收養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝態(tài)氮等有害物質(zhì)，能夠有效的對海水養(yǎng)殖污水進行改良。
【專利說明】
一種石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物制劑，具體涉及石斑魚養(yǎng)殖污水改 良用復(fù)合微生物制劑，還涉及到復(fù)合微生物制劑的制備方法，包括粉狀制劑和液體制劑的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和市場需求的增加，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)正處于迅猛發(fā)展階 段。然而，在水產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展的同時，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)導(dǎo)致的養(yǎng)殖品種出現(xiàn)退化和水體污染已日 趨嚴重，特別是海洋近海域養(yǎng)殖區(qū)的高密度養(yǎng)殖、工業(yè)廢水和生活污水的任意排放，使養(yǎng)殖 水域的自凈與調(diào)節(jié)能力降低，水域環(huán)境惡化，赤潮頻發(fā)，生態(tài)平衡和生物多樣性遭到破壞。 養(yǎng)殖水域的水質(zhì)下降不僅對環(huán)境造成了嚴重的污染，而且對生物體有致命的威脅，給我國 漁業(yè)經(jīng)濟帶來了巨大損失。因此處理水產(chǎn)養(yǎng)殖污水并使其達到排放標準已是當務(wù)之急。理 論上講，許多常規(guī)的物理、化學(xué)和生化的廢水處理方法可以用于養(yǎng)殖廢水處理，但是和生活 污水相比，海水水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)生的廢水具有兩個明顯的特點，即潛在污染物的含量低和水量 大，加之海水鹽度效應(yīng)以及養(yǎng)殖廢水中污染物的主要成分、結(jié)構(gòu)與常見陸源污水的差異，增 加了海水水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理難度。
[0003] 石斑魚肉質(zhì)鮮美，加工出肉率可高達67%，適溫范圍（18 - 32°C)廣，生長，適鹽范 圍（1 一40%。）也廣，生長快，抗病能力強，現(xiàn)已成為我國南方主要經(jīng)濟養(yǎng)殖魚種之一。近年 來，倡導(dǎo)的魚類高產(chǎn)健康養(yǎng)殖系統(tǒng)更是推動了我國石斑魚養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，使得魚類養(yǎng)殖 總產(chǎn)量節(jié)節(jié)攀高，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。然而，在石斑魚生產(chǎn)實踐中，仍存在 一些問題。石斑魚養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，包括養(yǎng)殖動物的排泄物、殘余飼 料、浮游動植物殘體等。在我國，石斑魚的養(yǎng)殖和其他對魚類品種的養(yǎng)殖一樣，基本采用"三 池合一"，即養(yǎng)殖魚類的攝食、排泄及代謝產(chǎn)物的分解在同一個池里完成。養(yǎng)殖生產(chǎn)中每天 投喂飼料，養(yǎng)殖魚類每天攝食，每天排泄、代謝產(chǎn)物不斷積累，如果不合理的改善水質(zhì)狀況， 自身污染程度便會逐漸加重，引起養(yǎng)殖水體質(zhì)量下降，水質(zhì)因子變動，加劇各類病害的發(fā) 生。氨氮和亞硝酸氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的主要污染物，也是最難以去除的物質(zhì)。目前研究較 多的是泡沫分離、過濾等物理處理技術(shù)。這些物理處理設(shè)施具有造價和運行費用低等優(yōu)點， 但不能去除溶解性污染物，特別是對氨氮不能有效地去除。近年來，人們借鑒畜禽養(yǎng)殖經(jīng) 驗，嘗試在養(yǎng)殖水體中施用微生物制劑增強動物免疫力，抑制病原微生物，減少疾病的發(fā) 生，改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，提高水產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量，取得了顯著效果。
[0004] 早在1981年，就有學(xué)者指出抗生素之后的時代將是微生物制劑的時代，微生物制 劑一直是國內(nèi)外生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點。目前國內(nèi)外市場對微生物制劑的需求旺 盛，供不應(yīng)求。我國是農(nóng)業(yè)大國，水產(chǎn)養(yǎng)殖占有相當大的比重，每年消耗掉大量的微生物制 劑，市場前景非常的廣大。目前，國際上先進國家的微生物制劑產(chǎn)品一般都含有5科10屬80 余種，而且其產(chǎn)品的活菌數(shù)高達1〇 1()個/克。自20世紀80年代以來，我國微生態(tài)保健品的研究 和開發(fā)迅猛發(fā)展，但是無論從研究領(lǐng)域還是應(yīng)用領(lǐng)域仍然存在許多問題需要解決。就水產(chǎn) 養(yǎng)殖水質(zhì)改良而言，首先，單一菌種的微生物制劑不能降低氨氮和亞硝酸氮;其次，市面上 所售復(fù)合微生物制劑因菌種配伍比例不理想或者是活菌數(shù)含量低，導(dǎo)致這些產(chǎn)品不能充分 發(fā)揮不同菌種配伍降低氨氮和亞硝酸氮等方面的作用;再次，適用于水產(chǎn)微生物制劑的菌 種缺乏，篩選方法過于簡單，適用于海水水產(chǎn)動物養(yǎng)殖的微生物制劑更是少之又少;最后， 水產(chǎn)微生物制劑穩(wěn)定性差，產(chǎn)品的加工保存技術(shù)有待提高等等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對目前存在的情況，本發(fā)明提供一種石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑， 能夠克服目前市售水產(chǎn)養(yǎng)殖污水單一或復(fù)合微生物制劑的缺點和不足。
[0006] 本發(fā)明還提供了石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，制得的制劑 活菌含量高、水分含量低，穩(wěn)定性高。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] -種石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑，所述制劑中含有重量比為2:2~4:1 ~2:1~2的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌。
[0009] 優(yōu)選地，前述石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑中，所述枯草芽孢桿菌、地衣 芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的重量比為2:2:1:1。
[0010] 或者，優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的重量比 為2:4:2:2。
[0011] 前述石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0012] (1)分別取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌在各自的培養(yǎng)基上 培養(yǎng)活化，于每管菌中分別加入5ml無菌水，制成的菌懸液分別作為一級種子，之后分別將 培養(yǎng)好的一級種子按質(zhì)量百分比為5~8 %的接種量轉(zhuǎn)移到含200ml液體種子培養(yǎng)基的 1000ml三角瓶中，然后將三角瓶置于搖床中，在溫度為28~37°C、振蕩速度為250rpm的條件 下振蕩培養(yǎng)16~20小時，分別得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌二級 種子液，備用；
[0013] ⑵以質(zhì)量比為6~7:2~2.5:1~1.5的麩皮、豆餅粉和花生柏為基礎(chǔ)混合料，向基 礎(chǔ)混合料中添加占基礎(chǔ)混合料質(zhì)量百分比為5.0 %的葡萄糖、0.5~2 %的Ca⑶3、0.2~1 % 的MnS〇4 · H20和0.3~1%的NaCl得到固體干基;然后向固體干基中再加入1~2倍重量的無 菌水，pH值調(diào)為6.5~7.2,攪拌均勻后再將其在120~130°C高溫條件下滅菌15~30min，待 冷卻至室溫，即可作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基使用；
[0014] (3)分別將上述二級種子液均按質(zhì)量百分比為5~10%的接種量接種到上述固體 發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分混勻，在密閉的固體發(fā)酵罐中，濕度為28~37%、溫度為36~37°C條件 下發(fā)酵，發(fā)酵時間為30~48小時，得發(fā)酵產(chǎn)物；
[0015] (4)在上述發(fā)酵產(chǎn)物中加入15~20倍重量的玉米淀粉，充分混勻，溫度為50~65°C 條件下真空冷凝干燥8~15小時，得到干燥發(fā)酵產(chǎn)物，再粉碎，過40~60目，得到復(fù)合微生物 粉狀制劑。
[0016] 其中，所述步驟(4)還可以用下述步驟代替：
[0017]以通用培養(yǎng)基作為稀釋劑，將發(fā)酵產(chǎn)物稀釋2~200倍;過濾，保證濾液中活菌含量 在1.0X107~109CFU/ml，再將濾液濃縮，采用轉(zhuǎn)速為lOOOOrpm的離心機離心1~2分鐘或者 采用4000~5000rpm的離心機離心10~30分鐘，收集離心后的沉淀物，將沉淀物重新懸溶于 通用培養(yǎng)基中，獲得濃縮液體，保證活菌含量在1. 〇 X 1〇9~l〇12CFU/ml，即得復(fù)合微生物液 體制劑；
[0018] 所述通用培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，其配方為:細菌學(xué)蛋白胨5g、酵母粉5g、葡萄糖5g、 磷酸氫二鉀4g和瓊脂18g，其pH為7.4;
[0019] 或液體培養(yǎng)基，其配方為:羧甲基纖維素鈉20g、蛋白胨5g、酵母膏5g、氯化鈉5g和 磷酸二氫鉀lg，其pH為7.4。
[0020] 其中，所述枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌所用的培養(yǎng)基配方均為:胰蛋白胨10g、 酵母粉5g、氯化鈉5g和瓊脂粉15g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐 上加熱煮沸保證其完全溶解，加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=7.2±0.2,于121°C高壓 滅菌備用。
[0021] 所述反硝化細菌所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其配方為:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化鈉5g、硝酸鈉0.85g和瓊脂粉20g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐 上加熱煮沸保證其完全溶解，加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=7.0 ± 0.2，于121°C下高 壓滅菌備用。
[0022] 所述乳酸菌所用的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，其配方為:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏 5g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉5g、葡萄糖20g、吐溫801ml、檸檬酸二銨2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳 〇.25g和瓊脂粉15g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐上加熱煮沸保 證其完全溶解，然后加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=6.2 ±0.2，121°C高壓滅菌備用。
[0023] 采用涂板的方法確定枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌濃度。將 上述各菌種各取1克放入150ml錐形瓶中，向其中加入100ml無菌水，這可以視為菌種被稀釋 了 100倍的菌落母液。將母液置于200r/min的搖床上振蕩30min，使菌種混合均勾。把振蕩后 的菌種母液移入無菌操作臺中，并取其上清液0.5ml于10ml離心管中，而后向其中加入 4.5ml無菌水，將離心管蓋上蓋，在漩渦儀上振蕩10秒，使其混合均勻，此即為母液被稀釋10 倍。重復(fù)此操作，逐級稀釋，一直稀釋到1010,取0.1ml各梯度的稀釋液于相應(yīng)菌種的培養(yǎng)基 內(nèi)，用玻璃刮刀涂抹均勻，每個濃度梯度取3個重復(fù)。涂板完成以后將培養(yǎng)基倒置放于30°C 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。觀察培養(yǎng)基中菌落的生長情況，如果24小時后細菌長勢不明 顯可適當延長培養(yǎng)時間。直到培養(yǎng)基平板上的菌落清晰可見為止。
[0024] 最終制得的制劑(包括復(fù)合微生物粉狀制劑和復(fù)合微生物液體制劑）中枯草芽孢 桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的活菌量分別為:6.0 X 109~9.0 X 101()CFU/ml、 6 · 0 X 109~9 · 0 X 1010CFU/ml、3 · 0 X 108~9 · 0 X 109CFU/ml和3 · 0 X 107~9 · 0 X 109CFU/ml。
[0025] 本發(fā)明的有益效果是：
[0026] (1)本發(fā)明通過采用4種不同的微生物菌種混合使用，并且采用合適的比例，能夠 有效的對海水養(yǎng)殖污水進行改良，通過實驗證明具有較好的改良效果；
[0027] (2)該海水養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑活菌含量高、水分含量低，穩(wěn)定性高， 是一種能夠利用并吸收養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝態(tài)氮等有害物質(zhì)等益生功能的多種益生 菌以及其分泌的酶、氨基酸生物素等有益因子的復(fù)合微生物制劑；
[0028] (3)該復(fù)合微生物制劑所用原料國內(nèi)市場均有銷售、來源穩(wěn)定、價格便宜，生產(chǎn)工 藝簡單，可操作性強；
[0029] (4)該復(fù)合微生物制劑應(yīng)市場需求，可制成粉狀劑型和液體劑型。
【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 下面將通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。提供這些實施例是為了能夠更 透徹地理解本發(fā)明，并且能夠?qū)⒈景l(fā)明的范圍完整的傳達給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。
[0033] 如在通篇說明書及權(quán)利要求當中所提及的"包含"或"包括"為一開放式用語，故應(yīng) 解釋成"包含但不限定于"。說明書后續(xù)描述為實施本發(fā)明的較佳實施方式，然所述描述乃 以說明書的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護范圍當視所附權(quán) 利要求所界定者為準。
[0034] 實施例1
[0035] -種石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑，所述制劑中含有重量比為2: 2:1:1 的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌。
[0036] 石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0037] (1)分別取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌在各自的培養(yǎng)基上 培養(yǎng)活化，于每管菌中分別加入5ml無菌水，制成的菌懸液分別作為一級種子，之后分別將 培養(yǎng)好的一級種子按質(zhì)量百分比為5 %的接種量轉(zhuǎn)移到含200ml液體種子培養(yǎng)基的1000ml 三角瓶中，然后將三角瓶置于搖床中，在溫度為28°C、振蕩速度為250rpm的條件下振蕩培養(yǎng) 20小時，分別得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌二級種子液，備用；
[0038] 其中，所述枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌所用的培養(yǎng)基配方均為:胰蛋白胨10g、 酵母粉5g、氯化鈉 5g和瓊脂粉15g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐 上加熱煮沸保證其完全溶解，加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=7.2±0.2,于121°C高壓 滅菌備用。
[0039]所述反硝化細菌所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其配方為:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化鈉5g、硝酸鈉0.85g和瓊脂粉20g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐 上加熱煮沸保證其完全溶解，加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=7.0 ± 0.2，于121°C下高 壓滅菌備用。
[0040]所述乳酸菌所用的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，其配方為:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏 5g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉5g、葡萄糖20g、吐溫801ml、檸檬酸二銨2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳 〇.25g和瓊脂粉15g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐上加熱煮沸保 證其完全溶解，然后加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=6.2 ±0.2，121°C高壓滅菌備用； [0041 ] (2)以質(zhì)量比為6: 2 :1的麩皮、豆餅粉和花生柏為基礎(chǔ)混合料，向基礎(chǔ)混合料中添 加占基礎(chǔ)混合料質(zhì)量百分比為5.0 %的葡萄糖、0.5 %的CaC03、1 %的MnS〇4 · H20和1 %的 NaCl得到固體干基;然后向固體干基中再加入1倍重量的無菌水，pH值調(diào)為6.5，攪拌均勻后 再將其在120°C高溫條件下滅菌30min，待冷卻至室溫，即可作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基使用；
[0042] (3)分別將上述二級種子液均按質(zhì)量百分比為10%的接種量接種到上述固體發(fā)酵 培養(yǎng)基中，充分混勻，在密閉的固體發(fā)酵罐中，濕度為28%、溫度為37°C條件下發(fā)酵，發(fā)酵時 間為30小時，得發(fā)酵產(chǎn)物；
[0043] (4)在上述發(fā)酵產(chǎn)物中加入15倍重量的玉米淀粉，充分混勻，溫度為50°C條件下真 空冷凝干燥8小時，得到干燥發(fā)酵產(chǎn)物，再粉碎，過40目，得到復(fù)合微生物粉狀制劑。
[0044] 最終制得的制劑中枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的活菌量 分別為:6 · 0 X 109CFU/ml、2 · 0 X 101QCFU/ml、3 · 0 X 108CFU/ml和9 · 0 X 109CFU/ml。
[0045] 實施例2
[0046] -種石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑，所述制劑中含有重量比為2 :3 :1: 2 的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌。
[0047] 上述石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0048] (2)分別取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌在各自的培養(yǎng)基上 培養(yǎng)活化，于每管菌中分別加入5ml無菌水，制成的菌懸液分別作為一級種子，之后分別將 培養(yǎng)好的一級種子按質(zhì)量百分比為8 %的接種量轉(zhuǎn)移到含200ml液體種子培養(yǎng)基的1000ml 三角瓶中，然后將三角瓶置于搖床中，在溫度為37°C、振蕩速度為250rpm的條件下振蕩培養(yǎng) 16小時，分別得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌二級種子液，備用；
[0049] 其中，所述枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌所用的培養(yǎng)基配方均為:胰蛋白胨10g、 酵母粉5g、氯化鈉5g和瓊脂粉15g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐 上加熱煮沸保證其完全溶解，加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=7.2±0.2,于121°C高壓 滅菌備用。
[0050] 所述反硝化細菌所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其配方為:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化鈉5g、硝酸鈉0.85g和瓊脂粉20g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐 上加熱煮沸保證其完全溶解，加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=7.0 ± 0.2，于121°C下高 壓滅菌備用。
[0051] 所述乳酸菌所用的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，其配方為:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏 5g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉5g、葡萄糖20g、吐溫801ml、檸檬酸二銨2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳 〇.25g和瓊脂粉15g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐上加熱煮沸保 證其完全溶解，然后加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=6.2 ±0.2，121°C高壓滅菌備用； [0052] (2)以質(zhì)量比為7 : 2.5:1.5的麩皮、豆餅粉和花生柏為基礎(chǔ)混合料，向基礎(chǔ)混合料 中添加占基礎(chǔ)混合料質(zhì)量百分比為5.0%的葡萄糖2 %的CaC03、0.2%的MnS〇4 · H20和0.3% 的NaCl得到固體干基;然后向固體干基中再加入2倍重量的無菌水，pH值調(diào)為7.2，攪拌均勻 后再將其在130°C高溫條件下滅菌15min，待冷卻至室溫，即可作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基使用； [0053] (3)分別將上述二級種子液均按質(zhì)量百分比為10%的接種量接種到上述固體發(fā)酵 培養(yǎng)基中，充分混勻，在密閉的固體發(fā)酵罐中，濕度為37%、溫度為36°C條件下發(fā)酵，發(fā)酵時 間為48小時，得發(fā)酵產(chǎn)物；
[0054] (4)在上述發(fā)酵產(chǎn)物中加入20倍重量的玉米淀粉，充分混勻，溫度為65°C條件下真 空冷凝干燥8小時，得到干燥發(fā)酵產(chǎn)物，再粉碎，過60目，得到復(fù)合微生物粉狀制劑。
[0055] 最終制得的制劑(包括復(fù)合微生物粉狀制劑和復(fù)合微生物液體制劑）中枯草芽孢 桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的活菌量分別為：5.0 X 101()CFU/ml、5.0 X 101()CFU/ml、1 · 0 X 109CFU/ml 和3 · 0 X 107CFU/ml。
[0056] 實施例3
[0057] 一種石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑，所述枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、 反硝化細菌和乳酸菌的重量比為2:4:2:2。
[0058]上述石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0059] (3)分別取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌在各自的培養(yǎng)基上 培養(yǎng)活化，于每管菌中分別加入5ml無菌水，制成的菌懸液分別作為一級種子，之后分別將 培養(yǎng)好的一級種子按質(zhì)量百分比為6 %的接種量轉(zhuǎn)移到含200ml液體種子培養(yǎng)基的1000ml 三角瓶中，然后將三角瓶置于搖床中，在溫度為30°C、振蕩速度為250rpm的條件下振蕩培養(yǎng) 18小時，分別得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌二級種子液，備用；
[0060] 其中，所述枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌所用的培養(yǎng)基配方均為:胰蛋白胨10g、 酵母粉5g、氯化鈉5g和瓊脂粉15g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐 上加熱煮沸保證其完全溶解，加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=7.2±0.2,于121°C高壓 滅菌備用。
[0061] 所述反硝化細菌所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其配方為:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化鈉5g、硝酸鈉0.85g和瓊脂粉20g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐 上加熱煮沸保證其完全溶解，加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=7.0 ± 0.2，于121°C下高 壓滅菌備用。
[0062] 所述乳酸菌所用的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，其配方為:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏 5g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉5g、葡萄糖20g、吐溫801ml、檸檬酸二銨2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳 〇.25g和瓊脂粉15g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐上加熱煮沸保 證其完全溶解，然后加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=6.2 ±0.2，121°C高壓滅菌備用；
[0063] (2)以質(zhì)量比為7 : 2.2:1.2的麩皮、豆餅粉和花生柏為基礎(chǔ)混合料，向基礎(chǔ)混合料 中添加占基礎(chǔ)混合料質(zhì)量百分比為5.0%的葡萄糖、1%的Ca⑶ 3、0.5%的MnS〇4 · H20和 0.5 %的NaCl得到固體干基;然后向固體干基中再加入1.5倍重量的無菌水，pH值調(diào)為7，攪 拌均勻后再將其在125°C高溫條件下滅菌20min，待冷卻至室溫，即可作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基 使用；
[0064] (3)分別將上述二級種子液均按質(zhì)量百分比為8%的接種量接種到上述固體發(fā)酵 培養(yǎng)基中，充分混勻，在密閉的固體發(fā)酵罐中，濕度為30%、溫度為36°C條件下發(fā)酵，發(fā)酵時 間為36小時，得發(fā)酵產(chǎn)物；
[0065] (4)以通用培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基，其配方為:細菌學(xué)蛋白胨5g、酵母粉5g、葡萄糖5g、 磷酸氫二鉀4g和瓊脂18g，其pH為7.4;)作為稀釋劑，將發(fā)酵產(chǎn)物稀釋100倍;過濾，保證濾液 中活菌含量在1.0X107~l〇9CFU/ml，再將濾液濃縮，采用轉(zhuǎn)速為lOOOOrpm的離心機離心2分 鐘或者采用5000rpm的離心機離心10分鐘，收集離心后的沉淀物，將沉淀物重新懸溶于通用 培養(yǎng)基中，獲得濃縮液體，保證活菌含量在1 .〇 X 1〇9~l〇12CFU/ml，即得復(fù)合微生物液體制 劑。
[0066] 最終制得的制劑(包括復(fù)合微生物粉狀制劑和復(fù)合微生物液體制劑）中枯草芽孢 桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的活菌量分別為：4.0 X 101()CFU/ml、9.0 X 1010CFU/ml、9 · 0 X 109CFU/ml和5 · 0 X 108CFU/ml。
[0067] 實施例4
[0068] -種石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑，所述制劑中含有重量比為2:4:1:2 的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌。
[0069] 上述石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0070] (4)分別取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌在各自的培養(yǎng)基上 培養(yǎng)活化，于每管菌中分別加入5ml無菌水，制成的菌懸液分別作為一級種子，之后分別將 培養(yǎng)好的一級種子按質(zhì)量百分比為7 %的接種量轉(zhuǎn)移到含200ml液體種子培養(yǎng)基的1000ml 三角瓶中，然后將三角瓶置于搖床中，在溫度為35°C、振蕩速度為250rpm的條件下振蕩培養(yǎng) 18小時，分別得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌二級種子液，備用；
[0071] 其中，所述枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌所用的培養(yǎng)基配方均為:胰蛋白胨10g、 酵母粉5g、氯化鈉5g和瓊脂粉15g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐 上加熱煮沸保證其完全溶解，加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=7.2±0.2,于121°C高壓 滅菌備用。
[0072]所述反硝化細菌所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其配方為:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化鈉5g、硝酸鈉0.85g和瓊脂粉20g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐 上加熱煮沸保證其完全溶解，加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=7.0 ± 0.2，于121°C下高 壓滅菌備用。
[0073]所述乳酸菌所用的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，其配方為:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏 5g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉 5g、葡萄糖20g、吐溫801ml、檸檬酸二銨2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳 〇.25g和瓊脂粉15g。將上述各試劑準確稱量后溶于適量的蒸餾水中，在電爐上加熱煮沸保 證其完全溶解，然后加蒸餾水定容至l〇〇〇ml，調(diào)整其PH=6.2 ±0.2，121°C高壓滅菌備用； [0074] (2)以質(zhì)量比為6: 2.5:1的麩皮、豆餅粉和花生柏為基礎(chǔ)混合料，向基礎(chǔ)混合料中 添加占基礎(chǔ)混合料質(zhì)量百分比為5.0 %的葡萄糖、1.5 %的Ca⑶3、0.8 %的MnS〇4 · H20和 0.8 %的NaCl得到固體干基;然后向固體干基中再加入2倍重量的無菌水，pH值調(diào)為6.8，攪 拌均勻后再將其在130°C高溫條件下滅菌25min，待冷卻至室溫，即可作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基 使用；
[0075] (3)分別將上述二級種子液均按質(zhì)量百分比為8%的接種量接種到上述固體發(fā)酵 培養(yǎng)基中，充分混勻，在密閉的固體發(fā)酵罐中，濕度為35%、溫度為37°C條件下發(fā)酵，發(fā)酵時 間為42小時，得發(fā)酵產(chǎn)物；
[0076] (4)以通用培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基，其配方為:羧甲基纖維素鈉20g、蛋白胨5g、酵母膏 5g、氯化鈉5g和磷酸二氫鉀lg，其pH為7.4)作為稀釋劑，將發(fā)酵產(chǎn)物稀釋200倍;過濾，保證 濾液中活菌含量在1.0X107~l〇9CFU/ml，再將濾液濃縮，采用轉(zhuǎn)速為lOOOOrpm的離心機離 心1分鐘或者采用4000rpm的離心機離心30分鐘，收集離心后的沉淀物，將沉淀物重新懸溶 于通用培養(yǎng)基中，獲得濃縮液體，保證活菌含量在1. 〇 X 1〇9~l〇12CFU/ml，即得復(fù)合微生物 液體制劑。
[0077]最終制得的制劑(包括復(fù)合微生物粉狀制劑和復(fù)合微生物液體制劑）中枯草芽孢 桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的活菌量分別為：9.0X109CFU/ml、7.0X 1010CFU/ml、4 · 0 X 109CFU/ml和6 · 0 X 108CFU/ml。
[0078] 為了證明本發(fā)明的有效性，
【申請人】還進行了如下試驗：
[0079] 實驗一:復(fù)合微生物制劑(復(fù)合微生物粉狀制劑或復(fù)合微生物液體制劑)對模擬石 斑魚養(yǎng)殖污水的影響和作用
[0080] 1.試驗器材：
[0081] ⑴儀器
[0082] 恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、漩渦儀、無菌操作臺、搖床、錐形瓶、分光光度計和配套比色 皿、25ml具塞比色管、容量瓶、移液槍等。
[0083] (2)試劑
[0084]磺胺、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、硫酸銨、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、苯酚溶液、亞硝鐵鐵 氰化鈉、次氯酸鈉溶液以及配制培養(yǎng)基所需要的各種試劑等。
[0085] 2.試驗水體:室內(nèi)石斑魚高位池養(yǎng)殖模擬水的配制
[0086] 稱取0.2463g亞硝酸鈉(于110°C烘干)和0.4716g硫酸銨（于110°C烘干)溶解于少 量純水后定容至l〇〇〇ml，得到亞硝酸鹽濃度分別為50mg/L和氨氮濃度為100mg/L的儲備液。 實驗所用到的溶液需要在此基礎(chǔ)上稀釋50倍，得到亞硝酸鹽氮和氨氮濃度如表1的水樣。
[0087] 表1實驗前模擬水樣中各物質(zhì)含量
[0088]
[0090] 3.試驗方法:表2表不的各種菌種的添加量(正交因素-水平表，表中分別代表的是 四種菌種添加量g，將四種菌添加到150ml水里震蕩，接著再加入到實驗組里，每組模擬水的 量為5L)和表3(L9(34)正交表，表中各數(shù)據(jù)表示的各種菌種之間的比例），設(shè)1個空白對照組 (不添加菌種），共10組，每組3個平行，每天上午10點進行氨氮和亞硝酸鹽的測定并記錄，連 續(xù)記錄6天。其中，表2中的水平1、2、3分別對應(yīng)表3的編號1-3、4-6、7-9。比如編號為1的枯草 芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌、乳酸菌的比例為1:1:1:1，則對應(yīng)的重量分別為2g、 28、以、18，再比如編號為2的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌、乳酸菌的比例為1: 2:2:2，則對應(yīng)的重量分別為2g、4g、2g、2g。
[0091] 表2正交實驗的因素-水平表
[0092]
[0093] 表3 L9(34)正交實驗設(shè)計
[0094]
[0095] 4 ·試驗結(jié)果
[0096] 復(fù)合微生物制劑(復(fù)合微生物粉狀制劑或復(fù)合微生物液體制劑)對室內(nèi)模擬養(yǎng)殖 污水的氨氮含量變化如表4所示，亞硝酸鹽氮含量變化如表5所示。加入復(fù)合微生物制劑前， 模擬水中的氨氮含量為2.40mg/L，亞硝酸鹽氮含量為1.04mg/L。
[0097] 從表4和表5中可以看出，加菌處理的水樣中，其氨氮和亞硝酸鹽氮的含量都有明 顯的降低。就氨氮而言，第1組的降氨氮效果最為明顯，在加入復(fù)合微生物制劑48小時以后， 氨氮含量下降的峰值達到了 97.5%。第3組微生物制劑對水體中的氨氮降解率次之，在加入 微生物制劑84小時后，水體中的氨氮降解了74.2%。對氨氮降解效果最不明顯的是第九組 微生物制劑，在加入微生物制劑84小時后，水體中氨氮的降解率只有21 %。在向模擬水中加 入微生物制劑以后，其亞硝酸鹽氮的含量一直在下降，在第6次進行水樣亞硝酸鹽氮含量測 定時，亞硝酸鹽氮的含量降低了 93.3%。
[0098] 由此可得出，所有四個菌種(枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌） 配伍所得的復(fù)合微生物制劑對水體中的亞硝酸鹽氮都具有明顯的降解效果，不同配伍比例 的微生物制劑對亞硝酸鹽氮的降解效果沒有明顯差異。
[0099] 綜上所述，第1組微生物制劑（即枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸 菌按重量比2:2:1:1配伍形成)對水體中氨氮和亞硝酸鹽氮的影響效果最為明顯?？蓪⑵淇?作是在模擬水實驗條件下，得到的配伍最優(yōu)的一組復(fù)合微生物制劑。
[0100] 表4模擬水樣氨氮含量(mg/L)的變化
[0101]
[0102] 表5模擬水樣亞硝酸鹽氮含量(mg/L)變化
[0103]
[0104]
[0105] 實驗二:復(fù)合微生物制劑(復(fù)合微生物粉狀制劑或復(fù)合微生物液體制劑)對室外石 斑魚高位池養(yǎng)殖污水的影響和作用
[0106] 1.試驗水體:養(yǎng)殖水水樣采自三亞市榆紅村某石斑魚養(yǎng)殖場，其鹽度在35%〇左右。 采樣的容器是25L的白色塑料桶，采樣點為同一個蝦塘的四個不同位置，共采集水樣75L。采 回水樣后12小時測定水體中氨氮和亞硝酸鹽氮的含量，其中亞硝酸鹽氮和氨氮含量含量分 別為0.13mg/L和3.12mg/L，然后分裝到2000ml的燒杯中進行實驗。實驗共分為10組，其中1 -9組是實驗組，第10組為空白對照組，對比相同的條件下進行，相同的時間間隔測定其水體 中的氨氮和亞硝酸鹽氮含量的變化。
[0107] 2.試驗方法:同實驗一，復(fù)合微生物制劑添加量與實驗1相同。
[0108] 3.試驗結(jié)果
[0109] 復(fù)合微生物制劑對南美白對蝦高位池養(yǎng)殖污水的氨氮含量變化如表6所示，亞硝 酸鹽氮含量變化如表7所示。加入復(fù)合微生物制劑前水體中的氨氮含量為3.12mg/L，亞硝酸 鹽氮的含量為〇.133mg/L。
[0110] 表6養(yǎng)殖污水中氨氮含量(mg/L)變化
[0111]
[0112] 表7養(yǎng)殖污水中亞硝酸鹽氮含量(mg/L)變化
[0113]
[0115] *注：表示水樣在比色時已經(jīng)不顯色
[0116] 從表6中可以看出，養(yǎng)殖水樣的氨氮含量一直呈降低趨勢。第2組實驗在加入復(fù)合 微生物制劑的84小時后，水體中氨氮的降解率達到了 93.2%，是9個實驗組中氨氮降解率最 高的一組。其他實驗組中，只有第6組的氨氮降解率稍微低了一點，但是在加入微生物制劑 84小時后，其氨氮降解率依然高達84.0%。可見復(fù)合微生物制劑對實際養(yǎng)殖污水中的氨氮 降解效果比較明顯，在加入微生物制劑前后，氨氮含量降低了 84.0%~93.2%。
[0117]表7表示的是養(yǎng)殖污水中加入復(fù)合微生物制劑前后，其亞硝酸鹽氮含量的變化，從 表中可以看出，在加入微生物制劑24小時后，第1次水質(zhì)測定時，其水體中的亞硝酸鹽氮含 量已經(jīng)極低。之后的幾次水質(zhì)測定實驗中，在向待測液中加入磺胺和鹽酸萘乙二酸鈉后，待 測液已經(jīng)不再顯色，可近似看作水體中已經(jīng)沒有亞硝酸鹽氮的存在或其含量極微，可忽略 不計。
[0118]綜上所述，第2組微生物制劑(枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌 按照其重量比2:4:2:2進行配伍)對水體中氨氮的影響最為明顯，在加入微生物制劑84小時 后，其氨氮含量下降了 93.2%。
[0119]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng) 域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑，其特征在于，所述制劑中含有重量比 為2:2~4:1~2:1~2的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑，其特征在于，所述枯 草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的重量比為2:2:1:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑，其特征在于，所述枯 草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的重量比為2:4:2:2。4. 根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述的石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制 備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟： (1) 分別取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌在各自的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 活化，于每管菌中分別加入5ml無菌水，制成的菌懸液分別作為一級種子，之后分別將培養(yǎng) 好的一級種子按質(zhì)量百分比為5~8 %的接種量轉(zhuǎn)移到含200ml液體種子培養(yǎng)基的1000ml三 角瓶中，然后將三角瓶置于搖床中，在溫度為28~37°C、振蕩速度為250rpm的條件下振蕩培 養(yǎng)16~20小時，分別得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌二級種子液， 備用； (2) 以質(zhì)量比為6~7:2~2.5:1~1.5的麩皮、豆餅粉和花生柏為基礎(chǔ)混合料，向基礎(chǔ)混 合料中添加占基礎(chǔ)混合料質(zhì)量百分比為5.0 %的葡萄糖、0.5~2 %的Ca⑶3、0.2~1 %的 MnS〇4 · H20和0.3~1%的NaCl得到固體干基;然后向固體干基中再加入1~2倍重量的無菌 水，pH值調(diào)為6.5~7.2,攪拌均勻后再將其在120~130°C高溫條件下滅菌15~30min，待冷 卻至室溫，即可作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基使用； (3) 分別將上述二級種子液均按質(zhì)量百分比為5~10%的接種量接種到上述固體發(fā)酵 培養(yǎng)基中，充分混勻，在密閉的固體發(fā)酵罐中，濕度為28~37%、溫度為36~37°C條件下發(fā) 酵，發(fā)酵時間為30~48小時，得發(fā)酵產(chǎn)物； (4) 在上述發(fā)酵產(chǎn)物中加入15~20倍重量的玉米淀粉，充分混勻，溫度為50~65°C條件 下真空冷凝干燥8~15小時，得到干燥發(fā)酵產(chǎn)物，再粉碎，過40~60目，得到復(fù)合微生物粉狀 制劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，其特征 在于，所述步驟(4)還可以用下述步驟代替： 以通用培養(yǎng)基作為稀釋劑，將發(fā)酵產(chǎn)物稀釋2~200倍;過濾，保證濾液中活菌含量在 1.0X107~109CFU/ml，再將濾液濃縮，采用轉(zhuǎn)速為lOOOOrpm的離心機離心1~2分鐘或者采 用4000~5000rpm的離心機離心10~30分鐘，收集離心后的沉淀物，將沉淀物重新懸溶于通 用培養(yǎng)基中，獲得濃縮液體，保證活菌含量在1 .〇 X 1〇9~l〇12CFU/ml，即得復(fù)合微生物液體 制劑； 所述通用培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，其配方為:細菌學(xué)蛋白胨5g、酵母粉5g、葡萄糖5g、磷酸 氫二鉀4g和瓊脂18g，其pH為7.4; 或液體培養(yǎng)基，其配方為:羧甲基纖維素鈉20g、蛋白胨5g、酵母膏5g、氯化鈉5g和磷酸 二氫鉀lg，其pH為7.4。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，其特征 在于，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌所用的培養(yǎng)基配方均為:胰蛋白胨l〇g、酵母粉5g、氯化 鈉5g和瓊脂粉15g。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，其特征 在于，反硝化細菌所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其配方為:胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化鈉5g、 硝酸鈉〇.85g和瓊脂粉20g。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，其特征 在于，乳酸菌所用的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，其配方為:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、磷酸 氫二鉀2g、乙酸鈉5g、葡萄糖20g、吐溫8011111、檸檬酸二銨2 8、硫酸鎂0.588、硫酸錳0.258和 瓊脂粉15g。9. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的石斑魚養(yǎng)殖污水改良用復(fù)合微生物制劑的制備方法，其特 征在于，所述制劑中枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化細菌和乳酸菌的活菌量分別為： 6 · 0 X 109~9 · 0 X 1010CFU/ml、6 · 0 X 109~9 · 0 X 1010CFU/ml、3 · 0 X 108~9 · 0 X 109CFU/ml和 3.0X107~9.0X109CFU/ml 〇
【文檔編號】C12R1/125GK106085906SQ201610424849
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】陳燕, 李成才, 黃海, 馬軍, 鐘鴻干, 林熾賢, 陳忠萌, 杜前進, 葉風, 陳銘粵, 張杰超, 鐘教豪, 張作堅, 王小美, 吳子瑩
【申請人】陳燕