一種枯草芽孢桿菌及其微生物菌劑和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于生物防治領(lǐng)域的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株YNM?3，該菌株己于2012年12月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.6933。本發(fā)明還公開了利用YNM?3制備的微生物菌劑，以及該微生物菌劑的制備方法。本發(fā)明枯草芽孢桿菌菌株YNM?3對(duì)玉米莖基腐病和苗期根腐病的防治效果好，其苗期莖基部防效達(dá)到82.9％，田間成株期防效達(dá)88.31％，為玉米莖基腐病和苗期根腐病的防治提供了一種新途徑；其次，本發(fā)明微生物菌劑制備方法簡單、成本低、易于推廣應(yīng)用；此外，本發(fā)明微生物菌劑無污染，無公害，對(duì)環(huán)境友好。CGMCC No.693320121204
【專利說明】
一種枯草芽孢桿菌及其微生物菌劑和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物防治領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌，還涉及利用該枯草芽孢 桿菌生產(chǎn)的微生物菌劑、以及該微生物菌劑的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米莖基腐病(Corn stalk rot)又稱玉米莖腐病或玉米青枯病，由多種病原菌單 獨(dú)或復(fù)合侵染造成，主要病原菌有禾谷鐮刀菌（Fusarium gramincarum)、輪生鐮刀菌 (Fusarium.moniliforme)和腐霉菌(Pythium. spp)，不同地區(qū)主要病原菌種類不同。病原菌 自玉米苗期至成株期都可從根部侵染，在苗期侵染引起根腐和苗枯，一般在玉米灌漿至乳 熟期開始發(fā)病，乳熟末期至蠟熟期為顯癥高峰。開始在莖基部節(jié)間產(chǎn)生縱向不規(guī)則褐色病 斑，隨后基部皺縮、變軟，后期莖內(nèi)空松腐爛，腐爛自莖基第一節(jié)開始向上擴(kuò)展，可達(dá)第二、 三節(jié)，甚至第四節(jié)，后期極易倒折。典型癥狀有青枯和黃枯兩種類型，青枯型為急性發(fā)病，葉 片呈灰綠色自下而上迅速枯死;黃枯為慢性發(fā)病型，發(fā)病后葉片自下而上逐漸黃枯。感病玉 米根部須根和根毛減少，根表皮松脫，髓部中空，變褐腐爛。近幾年，由于氣候變化、秸桿還 田、種植密度加大等原因該病的發(fā)生有上升趨勢，莖基腐病已成為繼大斑病、小斑病、彎孢 菌葉斑病等葉斑病之后的又一亟待解決的重要玉米病害。此外，蠕孢菌和絲核菌也是造成 玉米苗期根腐的病原菌。
[0003] 目前，防治玉米莖基腐病和苗期根腐病的主要方法：（1)化學(xué)防治。即用化學(xué)藥劑 進(jìn)行種子包衣或灌根，由于病原菌在玉米整個(gè)生育期都能夠侵染植株根系，化學(xué)防治存在 防治效果不佳，且長期大量使用對(duì)土壤和環(huán)境帶來污染等缺點(diǎn)。（2)抗病育種。由于抗病基 因難找，培育抗性品種困難。（3)生物防治。生物防治因具有?；詮?qiáng)、持久性好、以及環(huán)境 友好等特點(diǎn)，是解決玉米莖基腐病和苗期根腐病的有效方法。目前篩選出的對(duì)玉米莖基腐 病有生防作用的生防菌有哈次木霉、鞍形小球殼菌、粉紅粘帚霉菌、粉紅單端孢菌、簡單節(jié) 葡孢菌、棘腐霉菌、外擔(dān)菌和綠木霉等。如已公開對(duì)玉米莖腐病有防治作用的綠木霉（陳捷 等.植物保護(hù)，1994(3): 6-8)和解淀粉芽孢桿菌（崔文艷等.玉米科學(xué)，2015,23(5):153-158)等。
[0004] 枯草芽孢桿菌(Bacillius subtilis)是目前應(yīng)用比較廣泛的生防細(xì)菌。其分布范 圍廣，可以產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，耐熱抗逆性強(qiáng)，在土壤和植物表面普遍存在。同時(shí)還是植物體內(nèi) 常見的內(nèi)生菌，對(duì)人畜無毒無害，不污染環(huán)境，由于其生長速度快、營養(yǎng)需求簡單、在植物表 面易于定殖、生長和繁殖，而且生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的工藝簡單、制劑穩(wěn)定、使用方便、儲(chǔ)存期 長，因此是一種理想的生防細(xì)菌。因此，如果篩選出對(duì)玉米莖基腐病菌和苗期根腐病菌具有 抑制作用的枯草芽孢桿菌，將為防治玉米莖基腐病提供有效途徑。
[0005] 經(jīng)檢索，沒有發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌用于防治玉米莖基腐病的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)目前玉米莖基腐病抗病品種缺少，化學(xué)農(nóng)藥防治效果差、且存在污染環(huán)境的 問題，本發(fā)明目的在于提供一種枯草芽孢桿菌。該菌株對(duì)玉米莖基腐病和苗期根腐病防治 效果好。
[0007] 本發(fā)明第二目的在于提供利用上述枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的微生物菌劑。
[0008] 本發(fā)明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。
[0009] 本發(fā)明第四目的在于提供上述枯草芽孢桿菌在防治玉米莖基腐病或苗期根腐病 上的用途。
[0010]本發(fā)明第五目的在于提供上述微生物菌劑在在防治玉米莖基腐病或苗期根腐病 上的用途。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0012] 本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株YNM-3,己于2012年12 月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(保藏地址為:北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No.6933。
[0013] 本發(fā)明還提供了利用上述枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的微生物菌劑，其活性成分為枯草芽 孢桿菌菌株YNM-3菌體。
[0014] 上述微生物菌劑，其劑型可以是液體制劑或顆粒劑。
[0015] 上述微生物菌劑的液體制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0016] (1)菌種活化:將低溫保存的YNM-3菌株在LB平板培養(yǎng)基上、在30 °C下活化，挑取單 菌落在LB斜面培養(yǎng)基上擴(kuò)繁，備用；
[0017] (2)種子液制備：向LB液體培養(yǎng)基100mL中接種一接種環(huán)步驟（1)中活化好的YNM-3 菌株，在30~32°C、轉(zhuǎn)速160~180r/min條件下震蕩培養(yǎng)20~30h，得種子液；
[0018] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵罐加入混合好的發(fā)酵培養(yǎng)基（亦稱:玉米粉酵母膏發(fā)酵培養(yǎng) 基），按照重量百分比0.5~1%的比例接種步驟⑵所得的種子液，初始pH值用HC1調(diào)為6.5 ~7.0,在溫度為30~32°C、攪拌速度為160~180r/min、0~8h通氣比1:0.4;8~1511通氣比 1:1; 15~22h通氣比1:0.6的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為24~72h;
[0019] (4)在步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)12h以后，每隔60分鐘從發(fā)酵培養(yǎng)液中取樣進(jìn)行鏡檢，對(duì) 視野中的芽孢和總菌體數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算芽孢率;芽孢率達(dá)到90 %即停止發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā) 酵液;所得發(fā)酵液即為本發(fā)明微生物菌劑的液體制劑。
[0020] 上述制備方法步驟(2)或(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為24~48h。
[0021 ]上述制備方法步驟(2)或(3)中所述的攪拌速度為170r/min。
[0022] 上述制備方法步驟（1)中所述的的LB平板培養(yǎng)基和LB斜面培養(yǎng)基按常規(guī)方法制 作。
[0023] 上述制備方法步驟(2)中的LB液體培養(yǎng)基按常規(guī)方法制作。
[0024]上述制備方法步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分及其重量百分比為:玉米粉1 ~2%，酵母膏0.2~0.5%，黃豆粉 1~2%，Na2HP〇4 0· 1~0.2%，Ca⑶3〇· 1~0.2%，Kcl 0.08~0.15%，]\%504 0.1~0.3%，順4勵(lì)3 0.1~0.2%1^，]\1115040.01~1.03%，其余為水；
[0025] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括按照重量百分比比例將各成分加入水中，混 合均勻，121°C滅菌30min，降溫到30°C備用。
[0026] 上述微生物菌劑的顆粒劑，包括將上述制備方法中制備的發(fā)酵液濃縮，與草炭1:1 混合均勻后，通過制粒機(jī)制成不同濃度的顆粒劑。
[0027] 上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株YNM-3在防治玉米莖基腐病或苗期 根腐病上的應(yīng)用。
[0028]上述微生物菌劑在防治玉米莖基腐病或苗期根腐病上的應(yīng)用。
[0029]上述微生物菌劑的使用方法:玉米播種前用YNM-3發(fā)酵液浸種、或在玉米播種時(shí)將 YNM-3微生物菌劑的顆粒劑隨底肥施入，即可達(dá)到控制玉米莖基腐病和苗期根腐病的目的。
[0030] 本發(fā)明菌株YNM-3的篩選分離過程：
[0031] YNM-3菌株是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從玉米莖基腐病發(fā)病嚴(yán)重的病田 土壤中分離得到的。2003年3月河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所在河北省邯鄲永年縣采 集小麥田土壤樣品，混勾后稱取10g放入250mL三角瓶中，加入無菌水100mL，搖床170r/min 條件下振蕩30min，靜置2h，取上清液lmL加無菌水9mL，即成10mL 10-2倍土壤微生物懸液，繼 而將土壤懸液稀釋成10' 10' 10-5、10-6倍稀釋液，各濃度取200yL微生物懸液涂于LB平板 培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度3次重復(fù)，在30°C恒溫培養(yǎng)3d~5d，分別進(jìn)行細(xì)菌分離，挑取單菌落純 化，入生防菌庫保存。之后，以玉米莖基腐病菌和苗期根腐的優(yōu)勢病原菌禾谷鐮刀菌 (Fusarium gramincarum)、輪生鏡刀菌（F ·moni 1 iforme )、離懦抱菌（Cochliobolus sativas)和立枯絲核菌(Rhizotonia solani)為革El標(biāo)菌，進(jìn)行詰抗菌的篩選，從中篩選出一 個(gè)對(duì)禾谷鐮刀菌、輪生鐮刀菌、離蠕孢菌和立枯絲核菌都具有明顯抑菌效果的菌株，定名為 YNM-3〇
[0032] YNM-3菌株的分類鑒定：
[0033] (1)形態(tài)特征鑒定
[0034] 菌體革蘭氏陽性菌、桿狀。芽孢形態(tài)橢圓至柱狀，中部產(chǎn)生。PDA平板培養(yǎng)初期菌落 乳白色，規(guī)則圓形，邊緣不齊整，表面濕潤、光滑；中期膿狀凸起;后期淡黃色，邊緣粗糙，表 面干燥。平板劃線呈直線行。LB液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，表面能夠形成白色菌膜。這些形態(tài) 特征與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠等編著.科學(xué)出版社.2001年）中描述的芽孢桿菌 屬形態(tài)特征基本一致，初步判斷菌株YNM-3屬于芽孢桿菌。
[0035] (2)1防rDNA序列測定
[0036]以本發(fā)明菌株TOM-3的基因組DNA為模板、以細(xì)菌鑒定常用的16S rDNA通用引物 F27和R1492為引物進(jìn)行擴(kuò)增;所述的引物為：
[0037] F27:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'（SEQ ID No:l);
[0038] R1492:5，-GGCTACCTTGTTACGACTT-3，（SEQ ID No:2)。
[0039] PCR的反應(yīng)體系為50μ1，其中模板DNA 2μ1，上下游引物各2yl，PCR Master Mix 25 μL以及無菌水19μ1。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延 伸458,35個(gè)循環(huán) ;最后72°(：延伸1〇1^11。？0財(cái)廣增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將其 送往上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果見序列表SEQ ID N〇:3。將測序所得 Y匪-3的16S rDNA序列在Genbank中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果菌株Y匪-3與芽孢桿菌屬的16S rDNA同源性達(dá)到99%;構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)，菌株YNM-3與芽孢桿菌屬聚合到一起，說明 YNM-3屬于芽抱桿菌屬(Bacillus)。
[0040] (3)YNM-3生理生化指標(biāo)鑒定
[00411采用法國梅里埃公司生產(chǎn)的API 50CHB試劑條對(duì)菌株Y匪-3進(jìn)行生理生化指標(biāo)鑒 定，以枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株1504(中國菌種保藏委員會(huì))作為對(duì)照，操作步驟按其說明書 進(jìn)行。根據(jù)試劑條的顏色反應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，（"+"代表陽性，代表陰性），API Lab V3.0軟件分析。
[0042] 表1本發(fā)明ΥΝΜ-3菌株的生理生化指標(biāo)鑒定判讀結(jié)果
[0043]
[0044] 結(jié)果（見表1)本發(fā)明菌株TOM-3為枯草芽孢桿菌的鑒定ID( Identification)為 97.7%，鑒定結(jié)果說明本發(fā)明菌株YNM-3為枯草芽孢桿菌(Baci 1 lus subti 1 is)。
[0045] 綜合以上形態(tài)特征、16S rDNA序列分析和API 50CHB試劑條鑒定的結(jié)果，可知ΥΝΜ-3 屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) ， 并且和現(xiàn)有的其他芽孢桿菌菌株不同， 是一個(gè) 新的枯草芽孢桿菌菌株。
[0046] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：（1)本發(fā)明枯草芽孢桿菌菌株YNM-3對(duì)玉米莖基腐 病和苗期根腐病的防治效果好，其苗期莖基部防效達(dá)到82.9%，田間成株期防效達(dá) 88.31%，為玉米莖基腐病和苗期根腐病的防治提供了一種新途徑；（2)本發(fā)明微生物菌劑 制備方法簡單、成本低、易于推廣應(yīng)用；（3)本發(fā)明無污染，無公害，對(duì)環(huán)境友好。
【附圖說明】
[0047] 圖1為YNM-3的系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 實(shí)施例1 YNM-3對(duì)主要玉米莖基腐病菌和苗期根腐病菌的抑制作用
[0049] 采用平皿對(duì)峙培養(yǎng)法測定本發(fā)明枯草芽孢桿菌菌株YNM-3對(duì)4種本實(shí)驗(yàn)室分離并 保存的玉米莖基腐病原菌和苗期根腐病病原菌禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、輪生 鏡刀菌(Fusarium verticillioides)、離懦抱菌(Cochliobolus sativas)和立枯絲核菌 (Rhizotonia solani)的抑菌效果。將本發(fā)明YNM-3菌株轉(zhuǎn)接至LB平板培養(yǎng)基上30°C下活化 2d;將保存的4種病原真菌在PDA培養(yǎng)基上活化5d，然后在菌落邊緣用直徑5mm的打孔器打取 菌齡一致的菌片，菌絲朝下轉(zhuǎn)接到另一 PDA平板培養(yǎng)基中央，在菌片四周距菌片2.5cm處接 種YNM-3菌株，以空白為對(duì)照，每處理4次重復(fù)，置于25 °C恒溫培養(yǎng)5d，測量病原菌處理菌落 半徑和抑菌帶寬，計(jì)算抑菌率。
[0050] 抑菌率計(jì)算公式為：
[0051]
[0052]結(jié)果（見表2)Y匪-3菌株對(duì)玉米莖基腐病和苗期根腐病的4種病原菌的抑菌帶寬 6.0~12.0mm，抑菌率為57.8 %~79.0%。說明本發(fā)明ΥΝΜ-3菌株對(duì)4中病原菌都具有較好的 抑制作用。
[0053]表2本發(fā)明菌株YNM-3對(duì)4種植物病原真菌的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果
[0054]
[0055] 實(shí)施例2本發(fā)明YNM-3微生物菌劑液體制劑和顆粒劑的制備 [0056]按照如下步驟進(jìn)行：
[0057] (1)菌種活化：將保存于-40 °C的菌株YNM-3在LB平板培養(yǎng)基上、在30 °C下進(jìn)行活 化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上擴(kuò)繁備用;LB平板培養(yǎng)基和LB斜面培養(yǎng)基都按照常規(guī)方 法制作。
[0058] (2)種子液的制備：按常規(guī)方法制作LB液體培養(yǎng)基，在250mL三角瓶中裝入LB液體 培養(yǎng)基l〇〇mL，高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入步驟（1)活化好的TOM-3菌株 一接種環(huán)，在30°C、搖床轉(zhuǎn)速170r/min條件下振蕩培養(yǎng)22h小時(shí)，得種子液；
[0059] (3)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：按照如下重量百分比配制發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉1~2%;酵 母膏0.2~0.5%;黃豆粉 1 ~2%;Na2HP〇4 0.1 ~0.2%;CaC03 0.1 ~0.2%;Kcl 0.08~ 0.15%;MgS〇4 0.1 ~〇·3%;ΝΗ4Ν〇3 0.1 ~0.2%kg;MnS〇4 0.01 ~1.03%;其余為水，混合均 勻；121°C滅菌30min，降溫到30°C備用。
[0060] (4)發(fā)酵培養(yǎng):重量百分比0.5~1%的比例向步驟(3)配制的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種步 驟(2)所得種子液1.5L;初始pH值用Hcl調(diào)為7,在溫度為30°C、攪拌速度為170r/min、0~8h 通氣比1:0.4; 8~15h通氣比1:1; 15~22h通氣比1:0.6的條件下發(fā)酵培養(yǎng)。
[0061] (5)發(fā)酵培養(yǎng)12h以后，每隔60分鐘從步驟(4)的三角瓶中取樣進(jìn)行鏡檢，對(duì)視野中 的芽孢和總菌體數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算芽孢率；芽孢率達(dá)到90%即可停止發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵 液。所得發(fā)酵液即為本發(fā)明微生物菌劑的液體制劑。
[0062] (6)將上述所得發(fā)酵液濃縮，與草炭1:1混合均勻后，通過制粒機(jī)制成不同濃度的 顆粒劑；
[0063] 實(shí)施例3 YNM-3防治玉米莖基腐病溫室對(duì)比試驗(yàn) [0064]按照如下方法進(jìn)行：
[0065]所用土壤為滅菌土，于玉米粒培養(yǎng)基上培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)室分離并保存的玉米莖基腐病 和苗期根腐病的主要病原菌禾谷鐮刀菌、輪生鐮刀菌和立枯絲核菌，播種前等量混合土壤 接種，將培養(yǎng)物與滅菌土以體積比1:10混合均勻，花盆直徑l〇cm，每盆播種5粒玉米種子，品 種為鄭單958,4次重復(fù)。苗后3葉期和5葉期分別用稀釋10倍的實(shí)施例2制備的TOM-3發(fā)酵液 灌根2次，每盆250ml，對(duì)照用先正達(dá)公司種衣劑2.5%咯菌腈+1.0%精甲霜靈15ml拌種10kg 種子，以接種病原菌不防治為空白對(duì)照，待空白對(duì)照明顯發(fā)病時(shí)，拔苗洗凈根部調(diào)查發(fā)病級(jí) 另IJ，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。
[0066] 結(jié)果（見表3)Y匪-3對(duì)玉米莖基腐病根部和莖基部的防治效果分別為37.4%和 82.9%，化學(xué)藥劑防治效果為51.4%和69.2%，本發(fā)明防治效果與化學(xué)防治效果之間沒有 顯著差異。說明本發(fā)明枯草芽孢桿菌菌株ΥΝΜ-3及其微生物菌劑對(duì)玉米莖基腐病有很好的 防治效果。
[0067]表3本發(fā)明菌株ΥΝΜ-3對(duì)玉米莖基腐病防效試驗(yàn)結(jié)果
[0068]
[0069」 *ρ = 0·05
[0070] 實(shí)施例4本發(fā)明菌株ΥΝΜ-3防治苗期玉米莖基腐病田間小區(qū)對(duì)比試驗(yàn)
[0071] ( -）試驗(yàn)處理：
[0072] (1)實(shí)施例2制備的本發(fā)明ΥΝΜ-3微生物菌劑的液體制劑；
[0073] (2)藥劑對(duì)照1:2.5 %咯菌腈+1.0 %精甲霜靈；
[0074] (3)藥劑對(duì)照3:2.4 %咯菌腈+2.4 %苯醚甲環(huán)唑；
[0075] (4)空白對(duì)照。
[0076](二)試驗(yàn)方法：
[0077] 本試驗(yàn)于2012-2014年在河北農(nóng)科院植保所試驗(yàn)地進(jìn)行。試驗(yàn)地為玉米莖基腐病 和苗期根腐病發(fā)生嚴(yán)重地塊。在播種前，用實(shí)施例2制備的TOM-3液體制劑浸種60min，以 2.5 %咯菌腈+1. Ο %精甲霜靈拌種和2.4 %咯菌腈+2.4 %苯醚甲環(huán)唑按照種子重量的 0.15%拌種為化學(xué)藥劑對(duì)照1和化學(xué)藥劑對(duì)照2,以及空白對(duì)照;3次重復(fù)，隨機(jī)排列，播種后 21d拔苗調(diào)查玉米根部發(fā)病級(jí)別，計(jì)算病情指數(shù)。
[0078]結(jié)果(見表4)YNM_3處理后玉米苗期莖基腐病病情指數(shù)在3年試驗(yàn)中均顯著低于空 白對(duì)照，防效顯著，平均防效為40.8% ;2012年試驗(yàn)結(jié)果YNM-3浸種處理的防效顯著高于兩 個(gè)藥劑處理，2013年和2014年試驗(yàn)YNM-3浸種處理的防效與兩個(gè)藥劑處理沒有顯著差異，說 明YNM-3浸種對(duì)玉米莖基腐病苗期侵染和苗期根腐病的防效優(yōu)于或等同于化學(xué)藥劑。
[0079]表4本發(fā)明YNM-3菌株對(duì)玉米莖基腐病的田間小區(qū)防治效果
[0080]
[0081] 實(shí)例5 YNM-3對(duì)成株期玉米莖基腐病的田間防治效果
[0082] (一）試驗(yàn)處理：
[0083] (1)實(shí)施例2制備的YNM-3顆粒劑；
[0084] (2)化學(xué)藥劑(滿適金）：2.5%咯菌腈+1.0%精甲霜靈(購自先正達(dá)公司）；
[0085] (3)空白對(duì)照。
[0086] (二)試驗(yàn)方法
[0087] 本試驗(yàn)在河北省農(nóng)林科學(xué)院植保所病圃田進(jìn)行。在播種前溝施實(shí)施例2制備的 Y匪-3顆粒劑(有效含量5億個(gè)菌體/克）10kg/畝，對(duì)照化學(xué)藥劑采用種衣劑2.5%咯菌腈+ 1.0%精甲霜靈(購自先正達(dá)公司）15mL/10kg種子包衣，設(shè)不防治為空白對(duì)照。每處理重復(fù)3 次，隨機(jī)排列，于收獲前調(diào)查玉米莖基腐病的病株率。
[0088] 表5 YNM-3顆粒劑對(duì)玉米莖基腐病成株期田間防治效果試驗(yàn)結(jié)果
[0089]
[0090]~結(jié)果(表5)本發(fā)明TOM-3顆粒劑對(duì)玉米莖基腐病防效達(dá)到88.31 %，高于對(duì)照化學(xué)_ 藥劑的防效42.05 %。說明本發(fā)明YNM-3微生物菌劑的顆粒劑對(duì)玉米莖基腐病有突出的防治 效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is)菌株YNM-3，己于2012年12月4日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.6933。2. 利用權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的微生物菌劑，其特征在于其活性成分為 枯草芽孢桿菌菌株YNM-3菌體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于其劑型是液體制劑或顆粒劑。4. 權(quán)利要求3所述的微生物菌劑的液體制劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 將低溫保存的Y匪_3菌株在LB平板培養(yǎng)基上、在30°C下活化，挑取單菌落在LB斜面 培養(yǎng)基上擴(kuò)繁，備用； (2) 向LB液體培養(yǎng)基100mL中接種一接種環(huán)步驟（1)中活化好的YNM-3菌株，在30~32 °C、轉(zhuǎn)速為160~180r/min條件下震蕩培養(yǎng)20~30h，得種子液； (3) 向發(fā)酵罐加入發(fā)酵培養(yǎng)基，按照重量百分比0.5~1%的比例接種步驟(2)所得的種 子液，初始pH值用HC1調(diào)為6.5~7.0，在溫度為30~32°(：、攪拌速度為160~18(^/1^11、0~811 通氣比1:0.4; 8~15h通氣比1:1; 15~22h通氣比1:0.6的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為 24~72h; (4) 在步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)12h以后，每隔60分鐘從發(fā)酵培養(yǎng)液中取樣進(jìn)行鏡檢，對(duì)視野 中的芽孢和總菌體數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算芽孢率;芽孢率達(dá)到90 %即停止發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵 液;所得發(fā)酵液即為本發(fā)明微生物菌劑的液體制劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于其步驟(2)或（3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí) 間為24~48h。6. 上根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于其步驟(2)或（3)中所述的攪拌速度 為170r/min〇7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成 成分及其重量百分比為:玉米粉1~2%，酵母膏0.2~0.5%，黃豆粉1~2%，Na 2HP〇4 0.1~ 0.2%，CaC03 0.1 ~0.2%，Kcl 0.08~0.15%，MgS〇4 0.1 ~0·3%，ΝΗ4Ν〇3 0.1 ~0.2%kg， MnS〇4 0.01 ~1.03%，其余為水。8. 權(quán)利要求3所述的微生物菌劑的顆粒劑，包括將權(quán)利要求4制備的發(fā)酵液濃縮，與草 炭1:1混合均勻后，通過制粒機(jī)制成不同濃度的顆粒劑。9. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株YNM-3在防治玉米莖基腐 病或苗期根腐病上的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑在防治玉米莖基腐病或苗期根腐病上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK106085928SQ201610743943
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月29日
【發(fā)明人】孔令曉, 紀(jì)莉景, 鹿秀云, 王亞嬌, 栗秋生, 王連生
【申請人】河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所