一種培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。本發(fā)明培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括組分1和組分2；所述組分1由DMEM培養(yǎng)基、甲基纖維素、胎牛血清、GM?CSF和脂多糖組成；所述組分2由DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、白介素14和GM?CSF組成。本發(fā)明培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的方法，將單個(gè)核細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基按照2×106/mL的密度重懸，然后和所述培養(yǎng)基的組分1按照1:1的體積比混合后，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；期間每3天按照總體積的二分之一補(bǔ)加所述培養(yǎng)基的組分2。本發(fā)明所述本發(fā)明采用三維培養(yǎng)的方式，使巨噬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，模擬體內(nèi)環(huán)境，可以有效的提高巨噬細(xì)胞的增殖率和吞噬功能。
【專利說(shuō)明】
_種培養(yǎng)巨卩筵細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨噬細(xì)胞是三大抗原提呈細(xì)胞之一，是參與非特異和特異性免疫的重要細(xì)胞。它 們的主要功能是以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式對(duì)細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行噬菌作用（即吞噬 以及消化），并激活淋巴球或其他免疫細(xì)胞，令其對(duì)病原體作出反應(yīng)。由于巨噬細(xì)胞具有較 強(qiáng)的吞噬功能以及抗原提呈功能，所以在免疫學(xué)上具有較大的研究?jī)r(jià)值，但是由于巨噬細(xì) 胞增殖能力較差，所以無(wú)法獲得大量的巨噬細(xì)胞，也限制了其在臨床上的應(yīng)用。
[0003] 目前巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)主要是直接分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，然后將PBMC 細(xì)胞在含有30ng/mLGM-CSF、10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，收獲貼壁細(xì)胞，即為巨 噬細(xì)胞。
[0004] 然而現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞增殖倍數(shù)相當(dāng)有限。并且巨噬細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)與其巨噬 細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境不同，會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的特性發(fā)生改變，削弱其吞噬功能，減少增 殖，并且也很難消化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種培養(yǎng)巨噬細(xì)胞 的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括組分1和組分2;所述組分1由DMEM培養(yǎng)基、甲基 纖維素、胎牛血清、GM-CSF和脂多糖組成;所述組分2由DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、白介素 14和 GM-CSF 組成。
[0008] 本發(fā)明所述培養(yǎng)基所述組分1由DMEM培養(yǎng)基、甲基纖維素、胎牛血清、GM-CSF和脂 多糖組成。其中，甲基纖維素為白色或類白色纖維狀或顆粒狀粉末;無(wú)臭，無(wú)味。甲基纖維素 在水中溶脹成澄清或微渾濁的膠體溶液，呈現(xiàn)半固體狀。巨噬細(xì)胞在組分1中生長(zhǎng)呈現(xiàn)三維 培養(yǎng)的方式，不會(huì)貼壁，而是懸浮生長(zhǎng)，模擬體內(nèi)環(huán)境，可以很好地保持巨噬細(xì)胞的特性，有 效的提尚巨細(xì)胞的增殖率和吞功能。
[0009] 作為優(yōu)選，所述組分1由下述成分組成：
[0010]
[0011]所述組分2由下述成分組成：
[0012]
[0013] 在一些實(shí)施方案中，所述的培養(yǎng)基中所述組分1由下述成分組成：
[0014]
[0015] 在一些實(shí)施方案中，所述的培養(yǎng)基中所述組分1由下述成分組成：
[0016]
[0017] 在一些實(shí)施方案中，所述的培養(yǎng)基中所述組分1由下述成分組成：
[0018]
[0019] 在一些實(shí)施方案中，所述的培養(yǎng)基中所述組分2由下述成分組成：
[0020]
[0021]在一些實(shí)施方案中，所述的培養(yǎng)基中所述組分2由下述成分組成：
[0022]
[0023] 在一些實(shí)施方案中，所述的培養(yǎng)基中所述組分2由下述成分組成：
[0024]
[0025] 本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的方法，將單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)用DMEM培養(yǎng)基按 照2X 10%L的密度重懸，然后和所述培養(yǎng)基的組分1按照1:1的體積比混合后，37°C，5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng);期間每3天按照總體積的二分之一補(bǔ)加所述培養(yǎng)基的組分2。
[0026] 其中，本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為17天。
[0027] 進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)至第17天后加入和總體積相同 的PBS，800g離心10分鐘，去除上清，加入PBS清洗后收獲細(xì)胞。
[0028] 本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述單個(gè)核細(xì)胞可以由外周血或臍帶血分離得到。
[0029]在一些實(shí)施方案中，所述單個(gè)核細(xì)胞的制備方法為外周血或臍帶血加入生理鹽水 稀釋，緩慢加入到含淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，使稀釋的血液與淋巴細(xì)胞分離液分層清 晰，500-800g 離心 20-30min。
[0030] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。本 發(fā)明培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括組分1和組分2;所述組分1由DMEM培養(yǎng)基、甲基纖維素、胎 牛血清、GM-CSF和脂多糖組成；所述組分2由DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、白介素14和GM-CSF組 成。本發(fā)明培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的方法，將單個(gè)核細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基按照2 X 106/mL的密度重懸， 然后和所述培養(yǎng)基的組分1按照1:1的體積比混合后，37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng);期間每3 天按照總體積的二分之一補(bǔ)加所述培養(yǎng)基的組分2。本發(fā)明所述本發(fā)明采用三維培養(yǎng)的方 式，使巨噬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，模擬體內(nèi)環(huán)境，可以有效的提高巨噬細(xì)胞的增殖率和吞噬功能。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞增殖數(shù)量和流式數(shù)據(jù)高于現(xiàn)有培養(yǎng)方法。由于本發(fā)明 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞更接近體內(nèi)環(huán)境，細(xì)胞狀態(tài)更好，吞噬效果好于現(xiàn)有培養(yǎng)方法?，F(xiàn)有培養(yǎng)方法 巨噬細(xì)胞貼壁很緊，非常難以消化，而本發(fā)明在收獲巨噬細(xì)胞時(shí)不需要使用胰酶消化，操作 簡(jiǎn)便，并且減少了細(xì)胞的死亡率。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0032] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。
[0033] 實(shí)施例1:
[0034] 培養(yǎng)基配方:組分1
[0035]
[0036] 組分 2
[0037]
[0038]
[0039]培養(yǎng)方法：
[0040] 抽取外周血，用Ficoll法離心獲取其中的PBMC。
[00411 將PBMC用DMEM培養(yǎng)基按照2 X 106/mL的密度重懸，然后和組分1按照1:1的體積比 進(jìn)行混合，期間避免出現(xiàn)較大氣泡。
[0042] 將細(xì)胞放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0043]每3天按照總體積的二分之一補(bǔ)加組分2培養(yǎng)基，并且搖晃混勻，期間避免出現(xiàn)較 大氣泡。
[0044] 第17天加入和總體積相同的PBS，800g離心10分鐘，去除上清，加入PBS清洗一遍以 后收獲細(xì)胞。
[0045] 實(shí)施例2:
[0046] 培養(yǎng)基配方:組分1
[0047]
[0048] 組分 2
[0049]
[0050]培養(yǎng)方法：
[0051 ]按照實(shí)施例1所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)后收獲細(xì)胞。
[0052] 實(shí)施例3 [0053] 培養(yǎng)基配方:組分1
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058] 培養(yǎng)方法：
[0059] 按照實(shí)施例1所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)后收獲細(xì)胞。
[0060] 對(duì)比例：
[0061] 抽取一定量的外周血，用Ficoll法離心獲取其中的PBMC。
[0062] 將PBMC細(xì)胞用含有30ng/mL GM-CSF、10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基按照 1X106/ML 的密度重懸。
[0063] 將細(xì)胞放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0064] 每3天按照總體積的二分之一補(bǔ)充含有30ng/mL GM-CSF、10%FBS的RPMI 1640培 養(yǎng)基。
[0065]第17天去除培養(yǎng)上清，PBS清洗2遍后加入0.25%的胰酶進(jìn)行消化，消化5分鐘后加 入5倍于胰酶體積的FBS終止消化，離心去除上清，PBS清洗一遍以后收獲細(xì)胞。
[0066]試驗(yàn)例1:細(xì)胞計(jì)數(shù)、活力檢測(cè)和流式檢測(cè)
[0067]對(duì)實(shí)施例1-3及對(duì)比例收集的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、活力檢測(cè)和流式檢測(cè)。結(jié)果見表 1_3 〇
[0068]表1第17天收獲細(xì)胞后的計(jì)數(shù)結(jié)果
[0069]
[0070] ~表1結(jié)果顯示實(shí)施例1-3培養(yǎng)方k收獲的細(xì)胞數(shù)i遠(yuǎn)多于對(duì)比例"養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)。^ [0071]表2第17天收獲細(xì)胞后的細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果
[0072]
[0073] 細(xì)胞活力代表存活細(xì)胞的多少，數(shù)值越高表明存活的細(xì)胞越多，數(shù)值低則代表死 亡的細(xì)胞多。表2結(jié)果顯示實(shí)施例1-3培養(yǎng)方法收獲的細(xì)胞活力要遠(yuǎn)高于對(duì)比例培養(yǎng)的細(xì)胞 活力，表明本發(fā)明所述培養(yǎng)方法收獲的細(xì)胞活力高。
[0074] 表3第17天收獲細(xì)胞后的流式檢測(cè)結(jié)果
[0075]

[0076] ⑶11+⑶80+是巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志，數(shù)值越高，表明細(xì)胞中巨噬細(xì)胞的含量越多。表 3結(jié)果顯示實(shí)施例1-3培養(yǎng)方法收獲的細(xì)胞⑶11+CD80+數(shù)值要遠(yuǎn)高于對(duì)比例培養(yǎng)的細(xì)胞，表 明本發(fā)明所述培養(yǎng)方法收獲的細(xì)胞中巨噬細(xì)胞的含量高。
[0077] 試驗(yàn)例2:巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)：
[0078] 分別取lmL lX106/mL的實(shí)施例1-3以及對(duì)比例收獲的巨噬細(xì)胞懸液和lmL IX 107/mL/mL雞紅細(xì)胞懸液混勻后放入，于無(wú)菌的離心管中，37°C分別培養(yǎng)30、45、60和90min (期間每5min搖勻1次），然后取300yL到干凈的載波片上37°C貼附30min，取出后用37°C預(yù)熱 的PBS沖洗未被吞噬的雞紅細(xì)胞，沖洗去多余染液，晾干高倍鏡或油鏡下觀察并計(jì)數(shù)計(jì)算出 吞噬百分率。結(jié)果見表4。吞噬百分率的計(jì)算公式為：
[0079] 吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的MF數(shù)/MF總數(shù)
[0080] 表4巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0081]
[0082]吞噬百分率越高說(shuō)明巨噬細(xì)胞的吞噬功能越強(qiáng)。表4結(jié)果顯示實(shí)施例1-3培養(yǎng)方法 收獲的細(xì)胞吞噬百分率要高于對(duì)比例培養(yǎng)的細(xì)胞，表明本發(fā)明所述培養(yǎng)方法收獲的細(xì)胞中 巨噬細(xì)胞的吞噬功能更強(qiáng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種培養(yǎng)巨隧細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括組分1和組分2;所述組分1由DMBl培養(yǎng)基、甲基纖 維素、胎牛血清、GM-CSF和脂多糖組成;所述組分袖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、白介素14和GM- CSF組成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分1由下述成分組成： DM-EM培養(yǎng)基 62v7v%-80 v/v % 胎牛血清 18 v/v%-30v/v% 甲基奸維素 2 %-8 v/v % GM-CSF 40 ng/mL-90 ng/mL 月貧多糖 80p.g/L -3〇Op.g/L; 所述組分2由下述成分組成： DMEM培養(yǎng)基 85 v'/v %-% V/V % 胎牛血凌 15#v %-5 v/v% 白介素 14 10 ng/mL -35 ng/mL GM-CSF 10 ng/mL -40 ng/niL。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分1由下述成分組成： DMEM培養(yǎng)基 77v/v% 胎牛血清 20v/v % 甲基纖維素 3 v/v % GM-CSF 60 ng/mL 月胃多糖 200μ§化。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分1由下述成分組成： DMEM培養(yǎng)基02 v/v: % 胎牛血清 30 v/v % 甲基奸維素 8 v/v % GM-CSF 40 ng/mL 脂多搪 80yg/L。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分1由下述成分組成： DMEM培養(yǎng)基 80 v/v % 胎牛血清 甲基坪維素 2 v/v % GM-CSF 90 ng/mL 脂多糖 30〇ii.tg/L。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分2由下述成分組成： DMEM培養(yǎng)基 90v/v% 胎牛血清 10 v/v % 白介素14 20ng/mL GM-CSF 30ng/mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分2由下述成分組成： DMEM培養(yǎng)基 85v/v% 雕牛血潰 15 v/v % 白介素 14 10 iig/mL GM-CSF lOng/mL。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述組分2由下述成分組成： DMEM培養(yǎng)基 95 v/v % 胎牛血清 5 v/v % 白介素14 35 ng/mL GM-CSF 40 ng/mL。9. 一種培養(yǎng)巨隧細(xì)胞的方法，將單個(gè)核細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基按照2Xl(yVmL的密度重懸， 然后和權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基的組分1按照1:1的體積比混合后，37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng);期間每3天按照總體積的二分之一補(bǔ)加權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基的組分2。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，培養(yǎng)時(shí)間為17天。
【文檔編號(hào)】C12N5/0786GK106085961SQ201610616747
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月28日 公開號(hào)201610616747.9, CN 106085961 A, CN 106085961A, CN 201610616747, CN-A-106085961, CN106085961 A, CN106085961A, CN201610616747, CN201610616747.9
【發(fā)明人】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 萬(wàn)樺, 張維敏
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司