青霉素結合蛋白Bt?pbp2X及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新型的青霉素結合蛋白Bt?pbp2X及其編碼基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的蛋白。本發(fā)明的蛋白質可以用于制備青霉素類抗生素檢測試劑，應用于青霉素類抗生素殘留的快速檢測，其不需要復雜的儀器設備，樣品前處理過程非常的簡單，并且對于檢測人員技術及知識水平有特定要求，非常適于現(xiàn)場快速檢測。
【專利說明】
青霉素結合蛋白Bt-pbp2X及其應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種青霉素結合蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002] 隨著我國大眾生活水平的不斷提高，人們對食品安全的關注度越來越高，食品中 抗生素過量殘留的問題已經(jīng)引起人們的強烈反響。內酰胺類抗生素指其分子結構中含有 內酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環(huán)類、碳青霉烯和 青霉烯類酶抑制劑等，以及新發(fā)展的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)內酰胺類等其他非典型β_ 內酰胺類抗生素。它是現(xiàn)有在食品中添加的抗生素中使用最普及的一類。長期攝入內酰 胺類抗生素過量殘留的食品將嚴重導致人們身體健康，抗生素過量殘留能破壞胃腸道等菌 群的平衡，引起長期的腹瀉、維生素缺乏及影響其他治療藥物的療效;攝入內酰胺類抗生 素過量殘留的食品會導致一部分人群的過敏反應，較輕者表現(xiàn)為蕁麻疹、發(fā)熱、關節(jié)腫痛及 蜂窩組織炎等病癥，嚴重時可引起喉頭水腫、呼吸困難、過敏性休克，甚至危及生命的危害； 長期攝入抗生素過量殘留的食品會增強體內細菌對人體的耐藥性，以至于出現(xiàn)預想的超級 細菌，當人體出現(xiàn)疾病時，可增加治療難度甚至導致治療失效。
[0003] 隨著乳品中抗生素殘留問題的日益嚴峻，我國對乳品質量的監(jiān)管也日趨嚴格， 2007年我國通過了《生鮮乳品收購標準修正案》，其中明確將抗生素殘留檢驗列為強制檢測 項目并明確制定了各類抗生素在牛乳中的最高殘留限量。
[0004] 目前，國內乳品行業(yè)廣泛應用的牛乳中青霉素殘留的檢測方法主要依據(jù)國標 GB4789.27-94《鮮乳中抗生素殘留量檢測方法》進行，包括試管法和平板法。商檢系統(tǒng)的行 業(yè)標準檢測方法為杯碟法。盡管微生物法在基層單位使用廣泛，但該法的精確度、準確度都 不夠高，且檢測過程煩瑣，耗時較長，不易篩選到敏感菌株，易受其它抗菌藥物的影響，根本 無法適應牛乳抗生素殘留檢測需要。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種青霉素類抗生素結合蛋白。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的在于提供編碼所述青霉素類抗生素結合蛋白的基因。
[0007] 本發(fā)明的第三個目的在于提供所述蛋白在檢測青霉素類抗生素中的應用。
[0008] 本發(fā)明從蘇云金芽孢桿菌中得到了一種新型的與青霉素具有高親和力的蛋白質 Bt-pbp2X，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，序列全長699個氨基酸，表觀分子量為 76101.4Da，等電點約為8.80,該蛋白質是一種細菌細胞壁合成過程中具有轉肽和轉糖催化 作用的雙功能，該酶參與細菌細胞壁肽聚糖的生物合成，并在合成過程中發(fā)揮糖基轉移酶 活性，該酶第30到582氨基酸類似于細胞分裂蛋白FtsI，第60到212氨基酸為二聚體結構域 pfam03717,第262到565氨基酸轉肽酶結構域pfam00905。
[0009] 應當理解，此領域相關技術人員可以根據(jù)此發(fā)明公開的蛋白Bt-pbp2X的氨基酸序 列（SEQ ID No.2)，在不影響其生物活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基 酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第80位的Asn替換為Asp，將第190位的 Glu替換為Gly或Ala，將第240位的Gin替換為Thr，將第320位的Lys替換為His，將第56~105 位氨基酸缺失，將第1位Met增加6個His組氨酸純化標簽或增加 GST標簽。因此，本發(fā)明的Bt-pbp2X蛋白還包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸， 具有與Bt-pbp2X同等活性的由Bt-pbp2X衍生得到的蛋白質。
[0010]進一步本發(fā)明提供編碼上述青霉素結合蛋白Bt-pbp2X的基因。
[0011]優(yōu)選地，所述核苷酸序列為：（1)序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或（2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，編碼Bt-pbp2X的核苷 酸序列。
[0012] 此外，應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域相關 技術人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達的密碼子。
[0013] 本發(fā)明的基因和蛋白質可以從蘇云金芽孢桿菌中克隆或分離得到，或者通過DNA 或肽合成的方法得到。
[0014] 可將本發(fā)明基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發(fā)明蛋白的重組表達 載體，進而可以通過本領域所熟知的轉基因方法轉入到其他菌種中，使其具有表達所述蛋 白的能力。
[0015] 在本發(fā)明的一個實施例中，將PCR擴增得到的Bt-pbp2X基因插入到表達載體 pET28a( + )上構建得到重組表達載體pET28a( + )-pbp2X，并最終轉化大腸桿菌表達宿主 E.coli BL21(DE3)，使其能誘導表達獲得Bt-pbp2X蛋白。
[0016] 進一步，此發(fā)明提供了一種專門用于檢測食品中青霉素類抗生素殘留的檢測試 劑，其包括所述的Bt_pbp2X蛋白。所述的用于檢測的食品可以是固態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)等。固態(tài) 食品可以通過簡單的研磨、粉碎等方式處理后溶于相應溶劑，使食品中青霉素得以釋放，并 用于青霉素的檢測。半固態(tài)食品直接向其中加入相應的溶劑使青霉素釋放，并進行檢測。液 態(tài)食品可以是飲料、牛奶等，一般可以直接進行檢測。
[0017] 本發(fā)明提供的Bt-pbp2X蛋白質具有與β-內酰胺環(huán)類抗生素進行特異性結合的能 力，可將其應用用于食品中β-內酰胺環(huán)類抗生素殘留的檢測，用此技術研發(fā)的產(chǎn)品不需要 特殊的儀器設備，樣品前處理過程簡單方便，并且對檢測人員的技術以及知識水平要求低， 方便用于食品以及家庭進行現(xiàn)場的快速檢測。
【附圖說明】
[0018] 圖1是PCR擴增Bt-pbp2X基因的凝膠電泳圖，其中Μ是DNAMaker，l、2為以蘇云金芽 孢桿菌BMB171為模板PCR擴增得到的Bt-pbp2X基因。
[0019] 圖2是重組質粒pET28a( + )-pbp2X圖譜。
[0020]圖3是pET28a( + )-Bt-pbp2X的驗證，Μ為DNA Maker，l、2為pET28a( + )-Bt-pbp2X，經(jīng) EcoRV，Xhc^酶切結果，片段大小分別為3.9kb，3.4kb。
[0021 ]圖4是Bt-pbp2X蛋白質的純化結果，其中，Μ是蛋白分子量標準，1是誘導上清，2是 純化蛋白。
[0022]圖5是不同青霉素濃度與Bt_pbp2X蛋白質發(fā)生特異性相互作用后微熱泳變化。 [0023]圖6是使用Bt_pbp2X蛋白質測定青霉素含量標準曲線。
【具體實施方式】
[0024]實施例1 Bt_pbp2X蛋白的制備 [0025] 1、蘇云金芽孢桿菌總DNA提取
[0026] (1)將蘇云金芽孢桿菌菌株BMB171接種于5ml PA瓶中28°C過夜活化，次日按1%接 種量轉接至50ml液體培養(yǎng)基中LB培養(yǎng)基中，28°C，200r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌 體，STE洗一次。
[0027] (2)加5.75ml Solution I(25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，50mM葡萄糖）和 250yL溶菌酶(200mg/mL)冰浴過夜，
[0028] (3)加 3ml 10%SDS 于 50-60°C 水浴 30min;隨后加入 3.6ml5MNaCl，冰上 lOmin 后直 接加入苯酸:氯仿:異戊醇（25:24:1)去除蛋白質；1200〇1'/111；[11，離心15111；[11后取上清，加2倍 體積無水乙醇沉淀。70 %乙醇洗滌一次。
[0029] (4)干燥沉淀，用200yL ddH20或TE溶30min。并用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢 測總DNA的濃度和質量。
[0030] 2、引物設計與合成
[0031]根據(jù)蘇云金芽孢桿菌BMB171中預測的基因序列，設計上下游引物，并在上游引物 引入酶切位點及其保護堿基，下游引物引入酶切位點及其保護堿基，引物由北京奧科生物 科技有限公司合成。
[0032] 上游引物CCGCATATGATGAAGTGGACAAAAAG (下劃線為Ndel酶切位點，灰色背景為保 護堿基）
[0033] 下游引物CCGCTCGAGTTAGTCTCCTAAAGTTAA (下劃線為Xhol酶切位點，灰色背景為保 護堿基）
[0034] 3、PCR擴增Bt-pbp2X基因，具體反應體系如下：
[0035] DNA 模板，0.5yL
[0036] 上游引物，1此
[0037] 下游引物，1此
[0038] 10倍Buffer，2.5yL
[0039] dNTP 混合物（2.5mmol/L)，2yL
[0040] pfu Tap酶，lyL
[0041] ddH20，17yL
[0042] 反應條件如下：95°C預變性5min; 95°C0.5min，55 °C0.5min，72°C2min，30個循環(huán)； 72°C延伸lOmin，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收目的片段(圖1)。
[0043] 4、Bt_pbp2X蛋白表達菌株的構建
[0044] 回收的PCR產(chǎn)物37°CNdeI和Xhol雙酶切4小時，載體pET-28a也經(jīng)過Ndel和Xhol雙 酶切4小時，T4連接酶將外源基因與pET-28a連接成pET28a( + )-pbp2X重組載體（圖2)，經(jīng) EcoRV，XhoI酶切驗證為3.9kb，3.4kb符合預期（圖3)，轉入E. coli DH5a菌株;提取含有Bt-pbp2X基因的重組載體pET28a (+) -pbp2X轉化大腸桿菌表達宿主E · co 1 i BL21 (DE3)。
[0045] 5、Bt_pbp2X 蛋白的誘導
[0046] 將含有重組質粒pET28a( + )-pbp2X的E.coli BL21(DE3)在平板上挑取單菌落，接 種含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C過夜活化培養(yǎng)，約14小時后，將菌液按1 /100比例 加入新鮮的卡拉霉素 LB液體培養(yǎng)基，200r/min培養(yǎng)至0D6q() = 0.8~1.0，加入IPTG誘導（IPTG 終濃度為〇. lmM)200r/min，16°C培養(yǎng)12小時，將培養(yǎng)瓶置于冰上5分鐘；4°C，12000r/min離 心收集菌體，預冷的ddH 20重懸菌體沉淀，再次離心收集菌體，備用。
[0047] 6、Bt_pbp2X 蛋白的純化
[0048] 用4°C的Soluble Binding BufTer(10mM咪挫，NaCl 0.5M，20mM Tris_HCl，pH = 7.9)重懸菌體，置于冰上超聲波破碎至懸液變澄清;4°C，12000r/min離心60分鐘，收集上清 液，經(jīng)〇.45μπι微孔濾膜過濾后緩緩加入到Ni瓊脂糖凝膠柱中，隨后使用15倍柱體積的 Soluble Binding Buffer沖洗柱子，洗脫雜蛋；然后用Elution Buffer(500mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris-HCl，pH = 7.9)洗脫柱子，收集洗脫液。隨后15KDa截流管去除咪唑，得到純 化蛋白質Bt-pbp2X，SDS-PAGE鑒定提取蛋白為單一條帶無明顯雜蛋白（圖4)。經(jīng)測序鑒定為 本發(fā)明Bt_pbp2X。
[0049] 實施例2微量熱泳動儀(MST，NanoTemper Technologies)測定Bt_pbp2X測定青霉 素相互作用
[0050] 微量熱泳動儀(MST)是基于下述原理:將蛋白進行熒光標記，采用紅外激光光源產(chǎn) 生一個溫度場，小分子化合物與熒光標記的蛋白結合后導致蛋白電荷、構象等發(fā)生改變，則 熒光標記的蛋白在溫度場中的熱泳動快慢發(fā)生變化，這種變化反應在熒光值的變化上。將 小分子稀釋為一定的梯度濃度，若小分子與焚光標記的蛋白有結合，貝U焚光標記蛋白的熱 泳動變化也呈一定的規(guī)律性，由此可以擬合出二者的結合曲線，求得小分子和蛋白的解離 常數(shù)(Kd值)。
[0051 ] l、Bt-pbp2X蛋白的熒光標記
[0052] 依據(jù)試劑盒說明書，將純化后的Bt-pbp2X蛋白濃度稀釋16μΜ，使A柱進行buffer exchange，取100yL蛋白樣品加入94yL Labe 1 ing buffer和6yLRED_NHS染料混勾，于室溫黑 暗中孵育30min。孵育結束后，用B柱(分子篩)將游離的未結合染料和已經(jīng)標記的蛋白樣品 分離，最終獲得約500yL標記的Η亞基蛋白樣品用于相互作用分析。
[0053] 2、Bt_pbp2X蛋白與青霉素相互作用測定
[0054]測定已經(jīng)標記的Bt_pbp2X蛋白樣品熒光值，篩選不同的稀釋濃度調節(jié)熒光值在 200-1500范圍之間。經(jīng)篩選確定，將蛋白樣品用roS稀釋20倍并加入終濃度為0.1 %的吐溫-20以減小蛋白在毛細管內壁的附著。將青霉素溶于PBS緩沖溶液中配制成將小分子配體，即 青霉素溶解于PBS中配制成母液，再用PBS稀釋不同的濃度梯度。濃度梯度為0.00375、 0·0075、0·015、0·03、0·0625、0·125、0·25、0·5、1·0、2·0、4·0、8·0、16·0、32·0、64·0、128·0μ Μ的標準溶液。稀釋后的蛋白樣品和小分子配體化合物于12000rpm，4°C下離心5min，隨后分 別取上清，然后用PBS將小分子配體化合物進行梯度稀釋，共16個濃度梯度。將蛋白樣品上 清與16個不同濃度的小分子配體化合物1:1混合，填充16根毛細管，進行微量熱泳動分析。
[0055] 3、相關性分析
[0056] 相關性分析使用統(tǒng)計軟件SPSS進行，采用雙變量皮爾遜相關性分析，雙尾（two-tailed)檢驗，在0.05水平上檢驗其顯著性。經(jīng)測定Bt-pbp2X蛋白與青霉素親和常數(shù)Kd = 10.36nmol/L(圖 5)。
[0057] 實施例3 Bt_pbp2X蛋白檢測青霉素標準曲線的繪制
[0058] 1、青霉素標準樣品的制備
[0059]青霉素溶于PBS緩沖溶液配置成濃度為lyg/m L的標準使用溶液，向已知無抗牛奶 中加入此溶液調配含青霉素濃度一定的標準樣品。隨后，標準樣品置于搖床15min充分混 勻。
[0060] 2、Bt-pbp2X 包被酶標板
[00611向酶標板微孔中加入l00yL青霉素結合蛋白Bt-pbp2X溶液(4yg/mL)，4°C放置過 夜，以使Bt-pbp2X蛋白固定于微孔表面。傾去孔內液體，每孔加入PBS緩沖溶液(300yL，洗滌 3遍，濾紙上拍干。
[0062] 3、酶標板的封閉
[0063] 每空加入150yL 2%BSA封閉液，37°C孵育3小時，使用roS緩沖溶液洗滌3次后，濾 紙上拍干。
[0064] 4、加入標準溶液樣品
[0065] 將青霉素溶于roS緩沖溶液中配制成質量梯度為0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、 16.0、32.0、64.0、128.0、256. Oyg/L的標準溶液。每孔中加入50yL不同梯度的標準溶液，再 加入50yL辣根過氧化物酶標記的青霉素(HRP-Amp)，37°C孵育30min，傾去孔內液體，用TOST 溶液洗滌4次后，濾紙上拍干。
[0066] 5、加入酶解底物顯色
[0067] 加入100此新配置的四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB)，避光37°C孵育lOmin。立即向每孔中 加入50yL 2M H2SO4終止液，藍色變黃色。
[0068] 6、測定吸光值
[0069] 使用酶標儀lOmin內測測定微孔在450nm處的吸光A450。反應過程中，青霉素和 HRP-Amp競爭性結合Bt-pbp2X，若樣品中含有青霉素越多，HRP-Amp結合在受體上的量越少， 最終導致酶解液的吸光度變小，即樣品中的青霉素濃度與微孔中酶解液的吸光度值成反 比。
[0070] 7、標準曲線建立
[0071] 以標準樣品濃度為橫坐標，標準樣品的％吸光度值為縱坐標，用SPSS軟件，繪制標 準曲線。當青霉素濃度在0到256yg/的時候，吸光度與青霉素濃度有線性關系44 5〇 =-0·12781η(〇ΜΡ)+1·1067，Κ2 = 0·9757(圖 6)。
[0072]實施例4利用Bt_pbp2X蛋白測定與牛奶中青霉素殘留 [0073] 1、檢測樣品的前處理
[0074]脫脂奶樣本直接上樣檢測，純牛奶樣本5000轉/分，離心5分鐘，脫脂后直接檢測。 [0075] 2、牛奶中青霉素殘留含量的測定
[0076]按照實施例2方法依次配置不同濃度的青霉素標準脫脂牛奶樣品，酶標儀測定微 孔在450nm處的吸光度A45Q，以標準樣品濃度為橫坐標，標準樣品的％吸光度值為縱坐標，用 Origin 8軟件，繪制標準曲線。取不同濃度下牛奶樣品，使用酶標儀測定微孔在450nm處的 吸光A45Q。重復3次，每次6個平行，帶入標準曲線公式計算出牛奶中青霉素的含量。
[0077] 3、準確性(添加回收率)的測定
[0078]在不含有青霉素的脫脂牛奶中添加一定量的青霉素，添加終濃度為5、10、20ng/ mL，然后用實施例3方法檢測樣品中青霉素的含量，每個樣品做6個平行樣(n = 6)。測定結果 表明，此方法具有很好的精密度及回收率，牛奶中添加濃度為5ng/mL時，回收率平均達到 94.4%±6.32%;添加濃度為10ng/mL時，回收率平均達到93.8 % ± 5.72 % ;添加濃度為 20ng/mL時，回收率平均達到93.4 % ± 5.24 % ;在添加濃度為Ong/m L中，沒有出現(xiàn)假陽性， 也沒有假陰性(表1)。
[0079]表1:準確性(添加回收率)的測定 [0080]
【主權項】
1. 一種與青霉素類抗生素結合的蛋白質，其氨基酸序列是： 1. SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或 2. SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同 等活性的蛋白。2. 編碼權利要求1所述蛋白的基因。3. 如權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。4. 含有權利要求2或3所述基因的表達載體。5. 由權利要求4所述表達載體轉化的宿主細胞。6. 如權利要求5所述的宿主細胞，其為大腸桿菌。7. 含有權利要求所述蛋白的檢測試劑。8. 權利要求1所述蛋白在檢測青霉素殘留中的應用。9. 一種檢測青霉素類抗生素殘留的方法，其是用權利要求1所述蛋白與樣品中的青霉 素相結合，并檢測結合的結果。10. 根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于，將所述蛋白與標準品中的青霉素結合，并 建立標準曲線，根據(jù)標準曲線確定樣品中青霉素的含量。
【文檔編號】C12N9/10GK106085982SQ201610697616
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月18日 公開號201610697616.8, CN 106085982 A, CN 106085982A, CN 201610697616, CN-A-106085982, CN106085982 A, CN106085982A, CN201610697616, CN201610697616.8
【發(fā)明人】鞠守勇, 陳其國, 朱虹翼, 徐順高, 王超
【申請人】武漢職業(yè)技術學院