一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量的方法，包括：(1)收集蛹蟲草菌絲，將目的基因CmSnf1利用引物進行PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoI/SalI雙酶切，連接至改造的pKD1載體，得到pKD1?CmSnf1載體；(2)將得到的pKD1?CmSnf1載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，通過平板培養(yǎng)選出含有目的基因的農(nóng)桿菌菌株；(3)將蛹蟲草芽生孢子和步驟(2)得到的農(nóng)桿菌菌株共培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)和篩選得到轉(zhuǎn)基因菌株，最后進行出菇即可。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到蛹蟲草轉(zhuǎn)基因菌株，提高了菌株降解昆蟲體壁、利用營養(yǎng)物質(zhì)的能力，有效減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量，為進一步篩選蛹蟲草的優(yōu)良品種打下基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于蛹蟲草栽培領(lǐng)域，特別涉及一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為傳統(tǒng)中藥，蟲草的研究和應(yīng)用一直備受關(guān)注。蟲草是由子囊菌門 (Ascomycoa)，肉座菌目（Hypocreales)，麥角菌科(Clavicipitaceae)蟲草屬(Cordyceps) 真菌的孢子寄生于昆蟲幼蟲身上并由夏季從蟲體生出子實體所形成的菌蟲復(fù)合體。其中最 著名的是寄生于高山蝙蝠蛾（Hepialusarmoricanus)幼蟲的冬蟲夏草 (Ophiocordycepssinensis)和寄生于鱗翅目蛹的蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)(Sung et al.，2007)。蟲草具有多種藥用功效，包括:抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎癥、殺蟲、抗微生 物、降血脂血糖、抗衰老、神經(jīng)保護、腎保護等功能，在腫瘤治療、器官移植、肝腎移植和心臟 保護等方面具有重要作用。其主要成分包括四類:1)核苷酸、2)多糖、3)多肽和糖蛋白、4)甾 醇和萜烯。其中多糖與抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、脂類代謝等作用有關(guān)，蟲草素有 利于抗腫瘤、殺蟲和抗微生物活性，留醇則具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性(Lee et al.，2011， International Immunopharmacology 11,1226-1233)。
[0003] 在生物技術(shù)上，我國的真菌學(xué)家王成樹課題組率先對蛹蟲草進行了全基因組測序 (Zheng et al.，2011，Genome Biology 12，R116)。我國同時也是蛹蟲草栽培大國。根據(jù)相 關(guān)的調(diào)查研究，目前我國人工蛹蟲草的主要產(chǎn)區(qū)在江門新會地區(qū)和遼寧地區(qū)。其中遼寧蛹 蟲草產(chǎn)量占到全國產(chǎn)量的七成以上，我國蛹蟲草市場規(guī)模近15億元。因此找到提高蛹蟲草 提高對能源利用的因子，縮短出菇時間在生產(chǎn)中具有非常重要的意義。
[0004] Snfl基因是Snfl蛋白激酶復(fù)合體的一個組分，是哺乳動物、植物、真菌等維持體內(nèi) 能源代謝所必需的（Hardieet al·，1998，Annual review of biochemistry67:821-855)， 其在真核生物中高度保守。在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，Snf 1是酵母為適應(yīng)葡 萄糖有限的環(huán)境下利用其他碳源，如蔗糖、乙醇、乳糖等多必需的；在赤酶菌 (Gibberel lasaubinetii)中，GzSnf 1基因的敲除影響了該菌的有性、無性生殖，改變了赤酶 對碳源的應(yīng)用（Leeet al·，2009, Eukaryot Cell8(l) :116-127);在青霉 (Penicilliumdigitatum)中，PdSnf 1基因在正常條件下并不參與CWDE基因的表達調(diào)控，然 而在以果膠為碳源的生長條件下，PdSnfl基因參與CWDE基因的表達調(diào)控;PdSnfl基因缺失 突變菌株在以不同碳源的條件下（如葡萄糖、蔗糖、果膠、果糖、甘油等），突變體的生長速度 變慢，菌絲生長受到不同程度的抑制（Zhang，et al ·，2013，ApplMicrobiolBiotechnol .D0I 10.1007/s00253-012-4593-z)。通過酵母Snfl的氨基酸同源性的比對，在已測序的蛹蟲草 CM01中找到其同源基因 CCM_05552,該基因與酵母的蛋白序列相似性為60%，與食用真菌草 菇的蛋白序列相似性為51%，香菇的蛋白序列相似性為38 %。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量的 方法，該方法通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到蛹蟲草轉(zhuǎn)基因菌株，提高了菌株降解昆蟲體壁、利用營養(yǎng) 物質(zhì)的能力，有效減少蛹蟲草出燕時間及提尚出燕廣量，為進一步篩選蛹蟲草的優(yōu)良品種 打下基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明的一種減少蛹蟲草出燕時間及提高出燕產(chǎn)量的方法，包括：
[0007] (1)收集蛹蟲草菌絲，將目的基因 CmSnfl利用引物
[0008] F:CCCTCGAGTTCGTTAGATGATAAGGCTATGAGGTA、
[0009] R:CGGAATTCCGTGTTCTTTGGGATGATGATTTC 進行 PCR 擴增，然后將 PCR 產(chǎn)物經(jīng) Xhol/ Sal I雙酶切，連接至pKDl載體，得到pKDl-CmSnfl載體；
[0010] (2)將得到的pKDl-CmSnfl載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，通過平板培養(yǎng)選出含有目的基因 的農(nóng)桿菌菌株；
[0011] (3)將蛹蟲草芽生孢子和步驟(2)得到的農(nóng)桿菌菌株共培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)和篩選得到轉(zhuǎn) 基因菌株，最后進行出菇即可。
[0012] 所述步驟⑴中的目的基因 CmSnfl的大小為2240bp，所述步驟（1)中的目的基因 CmSnfl的大小為2240bp，具體序列如SEQ ID No. 1所示。來源于蛹蟲草，已經(jīng)在GenBank注 冊，Gene ID: 18167570。
[0013]所述步驟（1)中的pKDl載體具體序列如SEQ ID No. 2所示。所用的克隆菌株為 DH5a，所用的雙元載體pKDl含有潮霉素抗性和蛹蟲草Hsp70基因的啟動子及綠色熒光蛋白， 改造自pBlueScriptII(SK+)。
[0014] 所述步驟(1)中的PCR反應(yīng)體系和條件為
[0015]
[0016] 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min;94°C變性3〇8,50°(：退火3〇8,72°(：延伸31^11，共30個循 環(huán);最后在72°C下補平10min，10°C保存。
[0017]所述步驟(2)中的平板培養(yǎng)采用50yg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基。
[0018] 所述步驟（3)中的誘導(dǎo)和篩選采用含30(^8/11^頭孢霉素和45(^8/11^潮霉素的1-100培養(yǎng)基。
[0019] 所述步驟(3)中的出菇具體為蟲體出菇或米飯培養(yǎng)基出菇。
[0020] 有益效果
[0021] 本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到蛹蟲草轉(zhuǎn)基因菌株，提高了菌株降解昆蟲體壁、利用 營養(yǎng)物質(zhì)的能力，有效減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量，為進一步篩選蛹蟲草的優(yōu)良 品種打下基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0022]圖1為過表達菌株的PCR驗證圖；
[0023]圖2為過表達菌株的熒光定量PCR驗證圖；
[0024] 圖3為過表達菌株和野生型菌株的出菇比較照片；其中，A:野生型菌株蠶蛹出菇； B:過表達菌株蠶蛹出菇;C:野生型菌株米飯培養(yǎng)基出菇;D:過表達菌株米飯出菇。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0026] 實施例1
[0027]蛹蟲草菌株所用培養(yǎng)基：
[0028] PDA培養(yǎng)基:購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。配方:馬鈴薯淀粉4.Og/L，葡萄糖 20.(^/1，瓊脂粉15.(^/1。
[0029] SDB培養(yǎng)基：購自碧迪醫(yī)療器械（上海)有限公司。配方:動物組織胃蛋白酶消化物 5. Og/L，胰酶消化酪蛋白胨5. Og/L，葡萄糖20.0 g/L。
[0030] M-100培養(yǎng)基：M-100Salt Solution 62.5mL/L，葡萄糖 10g/L，KN〇3 3g/L，瓊脂粉 15區(qū)/1。做覆蓋用時，瓊脂粉減為0.758/1。]\1-100331七3〇111衍〇11:10^〇4 168/1，恥23〇4 48/ L，KC18g/L，MgS〇4.7H20 2g/L，CaCl2 lg/L，M-100Trace Element Solution 8mL/L〇M-lOOTrace Element Solution：H3BO3 0.06g/L,MnCl2 · 4H2〇 0.14g/L,ZnCl2 0.40g/L, Na2Mo〇4 · 2H20 0.04g/L，F(xiàn)eCl3 · 6H2O 0.10g/L，CuS〇4 · 5H20 0.40g/L。
[0031] 細菌菌株所用培養(yǎng)基：
[0032] LB培養(yǎng)基：購自MDBio(青島生工生物科技有限公司）。配方:Tryptone 10g/L，NaCl 10g/L，Yeast extract 5g/L。若要配制固體培養(yǎng)基，則再添加 15g/L瓊脂粉。
[0033] 農(nóng)桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM(液體）：2 · 5 XMM Salt Solution 400mL/L，葡萄糖 1 · 8g/L， 甘油5mL/L，加水定容至940mL。高壓滅菌并冷卻至50°C后，每升加入40mL 1M MES(PH 5.5， 過濾除菌），20mL 10mM AS(乙酰丁香酮，DMS0(二甲基亞砜)配制，過濾除菌）。若配置固體培 養(yǎng)基，葡萄糖減為〇.9g/L，并加入瓊脂粉 15·(^/Ι^2·5ΧΜΜ Salt Solution:KH2P〇4 3.625g/ L,K2HP〇4 5.125g/L,MgS04· 7H20 1.250g/L,NaCl 0.375g/L,CaCl2 · 2H20 0.165g/L, FeS〇4· 7H20 0.0062g/L(先配制6.2g/L的溶液，用時移取lmL)，（NH4)2S〇4 1.250g/L。
[0034] 過表達載體的構(gòu)建
[0035] 1)目的基因的制備:收集蛹蟲草菌絲，提取基因組DNA，利用引物
[0036] F:CCCTCGAGTTCGTTAGATGATAAGGCTATGAGGTA；
[0037] R：CGGAATTCCGTGTTCTTTGGGATGATGATTTC；
[0038]
[0039] 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min;94°C變性3〇8,50°(：退火3〇8,72°(：延伸31^11，共30個循 環(huán);最后在72°C下補平10min，10°C保存。過產(chǎn)物回收柱。
[0040] 2)過表達載體的構(gòu)建：回收產(chǎn)物經(jīng)Xhol/Sal I雙酶切消化用1 %的瓊脂糖凝膠回收 純化，與PKD1質(zhì)粒的融合載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a;用含有卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基 37 °C 200rpm過夜培養(yǎng)。菌落PCR驗證，提取質(zhì)粒，得到pKDl-CmSnfl載體。
[00411 3)轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌:將lyL構(gòu)建好的載體加入到100yL農(nóng)桿菌AGL-1感受態(tài)中，液氮 中放置5min，使感受態(tài)徹底凍住;37°C溫育5min，使感受態(tài)徹底融化；向感受態(tài)中加入800yL LB液體培養(yǎng)基，28°C，220rmp振蕩培養(yǎng)2h;在超凈臺中將菌液均勻涂于LB固體培養(yǎng)基上(含 50yg/mL卡那霉素），28°C培養(yǎng)30h。選取3個長出的單菌落分別用GFP的驗證引物和CmSnfl的 驗證引物進行PCR驗證，檢驗轉(zhuǎn)化是否成功。
[0042] 實施例2
[0043]目的基因在蛹蟲草中的轉(zhuǎn)化
[0044](根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化）
[0045] 1)從LB平板(含50yg/mL卡那霉素)上挑選一新鮮培養(yǎng)的含目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL- 1單菌落，接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(含50yg/mL卡那霉素）中，220rpm，28 °C過夜培養(yǎng)。
[0046] 2)次日離心收集菌體，用等體積的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM重懸，移取適量的重懸液至 5mL液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基頂使0D660 = 0.14-0.2。
[0047] 3) 28 °C、220rpm振蕩培養(yǎng)4-6h，菌液濃度至0D660 = 0.5-0.8之間即可。
[0048] 4)蛹蟲草芽生孢子的培養(yǎng)和收集:在超凈工作中，將在PDA培養(yǎng)基上活化好(25°C， 20d)的新鮮菌絲轉(zhuǎn)移至均質(zhì)儀中，加入50mL SDB液體培養(yǎng)基，均質(zhì)30s(低速10s，高速10s， 低速l〇s)后，移取10mL至100mL SDB液體培養(yǎng)基中，25°C，150rmp，搖床培養(yǎng)7d至芽生孢子量 達到108-109。無紡布過濾收集芽生孢子，儲存在4°C待用，一個月內(nèi)可用。
[0049] 5)取上述農(nóng)桿菌菌液和用0.05%Tween 20稀釋至1X106個/mL的孢子懸液各100μ L充分混勻后涂布于頂平板，28 °C共培養(yǎng)2d。
[0050] 6)加入lmL 0.05%Tween 20溶液至上述平板，用涂布器充分洗滌(刮取)混勻共培 養(yǎng)物。將洗滌下來的培養(yǎng)物按每板200yL均勻涂布在含300yg/mL頭孢霉素和250yg/mL潮霉 素的M-100培養(yǎng)基上，25 °C培養(yǎng)3~5d至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，即得過表達菌株。
[0051 ] 7)挑取轉(zhuǎn)化子至含300yg/mL頭孢霉素的M-100培養(yǎng)基上，待其長至直徑為l-2cm時 小量提取基因組進行PCR驗證（圖1)，同時提取野生出發(fā)菌株和過表達菌株的RNA，進行反轉(zhuǎn) 錄為cDNA，進行表達量的驗證，實驗證明CmSnfl的基因轉(zhuǎn)錄水平得到提高（圖2)。
[0052] 實施例3
[0053] 過表達菌株出菇實驗
[0054] 1)蠶蛹出菇
[0055]分別收集野生型菌株和過表達菌株的新鮮芽生孢子懸浮液，濃度調(diào)至108,用無菌 注射器吸取300yL注射進蠶蛹體內(nèi)（選用鮮活的蠶蛹，并用75%酒精浸泡lmin殺菌）。然后將 蠶蛹放置于底層鋪有吸水紙(無菌水浸濕，無明水）的一次性方盒中（紫外照射lh殺菌），25 °C避光培養(yǎng)25d后轉(zhuǎn)移至生態(tài)培養(yǎng)箱中，23 °C光周期12:12 (光：暗）培養(yǎng)1月。觀察子實體生 長情況。
[0056] 2)米飯出菇
[0057] 將野生型菌株和過表達菌株在TOA培養(yǎng)基上25°C避光培養(yǎng)三周后，用直徑lcm的打 孔器打孔后，每瓶米飯培養(yǎng)基中接入4塊菌塊，25 °C避光培養(yǎng)至菌絲完全覆蓋米飯培養(yǎng)基后 轉(zhuǎn)移至生態(tài)培養(yǎng)箱中，23 °C光周期12:12 (光:暗)培養(yǎng)1月。觀察子實體生長情況。米飯培養(yǎng) 基配方如下：30g大米，45mL蒸餾水(含0.3%1?^〇4,0.15%]\%3〇4,2%葡萄糖），121°(：，111高 溫滅菌。
[0058] 結(jié)果顯示，蠶蛹出菇實驗，過表達菌株出菇數(shù)明顯多于野生型（見圖3)，出菇時間 提前7-10天;米飯培養(yǎng)基出菇也有提前，但相較于蠶蛹沒有那么明顯，出菇時間提前3-5天。
【主權(quán)項】
1. 一種減少蛹蟲草出燕時間及提高出燕產(chǎn)量的方法，包括： (1 )收集蛹蟲草菌絲，將目的基因 C m S n f 1利用引物F : CCCTCGAGTTCGTTAGATGATAAGGCTATGAGGTA、R: CGGAATTCCGTGTTCTTTGGGATGATGATTTC 進行 PCR 擴增，然后將PCR產(chǎn)物經(jīng)Xhol/Sall雙酶切，連接至改造后的pKDl載體，得到pKDl-CmSnfl載 體； (2) 將得到的pKDl-CmSnfl載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，通過平板培養(yǎng)選出含有目的基因的農(nóng) 桿菌菌株； (3) 將蛹蟲草芽生孢子和步驟(2)得到的農(nóng)桿菌菌株共培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)和篩選得到轉(zhuǎn)基因 菌株，最后進行出菇即可。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量的方法，其特征在 于:所述步驟(1)中的目的基因 CmSnfl的大小為2240bp，具體序列如SEQ ID No.l所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量的方法，其特征在 于:所述步驟(l)中的pKDl載體具體序列如SEQIDNo.2所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量的方法，其特征在 于：所述步驟（1)中的PCR反應(yīng)體系為：PCR MagicMix 2.0 25yL，引物各2yL，模板3yL， ddH2018yL;PCR 反應(yīng)程序為：94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 3〇8,50°(：退火3〇8,72°(：延伸31^11， 共30個循環(huán);最后在72°C下補平10min，10°C保存。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量的方法，其特征在 于:所述步驟(2)中的平板培養(yǎng)采用50yg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量的方法，其特征在 于:所述步驟(3)中的誘導(dǎo)和篩選采用含300yg/mL頭孢霉素和450yg/mL潮霉素的M-100培養(yǎng) 基。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種減少蛹蟲草出菇時間及提高出菇產(chǎn)量的方法，其特征在 于:所述步驟(3)中的出菇具體為蟲體出菇或米飯培養(yǎng)基出菇。
【文檔編號】C12N1/15GK106086058SQ201610472379
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】汪瀅, 王榮, 鮑大鵬, 馬元偉, 劉敏祥, 王瑩, 李燕, 茅文俊, 高英女
【申請人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院