利用真菌激發(fā)子誘導(dǎo)從樺褐孔菌中提取白樺脂酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用真菌激發(fā)子誘導(dǎo)從樺褐孔菌中提取白樺脂酸的方法，包括：將可產(chǎn)孢子的絲狀真菌進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)后離心、洗滌得到菌絲體，破碎細胞，離心取沉淀，然后用蒸餾水配制成濃度為8?12mg/mL的細胞碎片溶液，滅菌，得到真菌激發(fā)子；將活化的樺褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液體培養(yǎng)基，于24?26℃發(fā)酵培養(yǎng)8?14天，在發(fā)酵第4?8天加入真菌激發(fā)子，發(fā)酵完成后，分離菌體和發(fā)酵液，通過后處理從菌體和發(fā)酵液中分離純化得到白樺脂酸。本發(fā)明通過在發(fā)酵中期加入真菌激發(fā)子刺激樺褐孔菌的生長，無需引入基因工程菌株或外加酶，后處理簡單，能有效提高樺褐孔菌中白樺脂酸的產(chǎn)量。
【專利說明】
利用真菌激發(fā)子誘導(dǎo)從樺褐孔菌中提取白樺脂酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵及代謝領(lǐng)域，尤其涉及一種利用真菌激發(fā)子誘導(dǎo)從樺褐孔 菌中提取白樺脂酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 樺褐孔菌(Inonotus obliquus)是一種十分珍稀而名貴的藥用真菌，屬于真菌門、 擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬。主要分布于俄羅斯、芬蘭、波蘭、日 本北海道等北半球北煒40°~50°的地區(qū)和我國的黑龍江大興安嶺、吉林長白山一帶。從16 世紀以來，俄羅斯、波蘭、芬蘭等國家的民間就廣泛使用樺褐孔菌來治療各種疑難雜癥，如 各種癌癥、心臟病和糖尿病等。
[0003] 樺褐孔菌是生長在寒帶的木腐菌，引起白樺、銀樺、榆樹、赤楊的白腐。在木材中的 樺褐孔菌菌絲在零下40°C也不會凍死，是極耐寒的種類。樺褐孔菌含有多糖、三萜類、樺褐 孔菌醇、多種氧化三萜類化合物、栓菌酸、多種羊毛留醇型三萜類化合物、葉酸衍生物、芳香 族的香草酸、丁香酸及γ羥基苯甲酸，還有報道稱已分離出單寧化合物、類固醇、生物堿類 化合物、黑色素類、低分子多酚類及木質(zhì)素類化合物。其中，白樺脂酸，是一種非常重要的天 然活性物質(zhì)。
[0004] 白樺脂酸(Betulinic acid，BA)，又名樺木酸，是一種五環(huán)三砲類化合物。廣泛分 布于多種植物中，如鼠李科的酸棗仁、樺木科的白樺樹皮、豆科的皂角刺、薔薇科的光皮木 瓜、五加科刺五加、大戟科重陽木、錦葵科木芙蓉花等。最早分離于生長在非洲東部的鼠李 科常綠植物的樹皮。在我國，白樺脂酸最豐富的自然資源是白樺樹皮。近年來的研究表明， 白樺脂酸具有諸多的生物活性，如抗腫瘤、抗HIV、抗炎、抗菌、抗瘧疾等，尤其是在抗腫瘤方 面，特別是針對黑色素瘤，有突出的表現(xiàn)。同時還具有作用機制特異、分子質(zhì)量小、低毒性等 優(yōu)點，有廣泛的應(yīng)用開發(fā)前景，是一類很有潛力的藥物先導(dǎo)化合物。目前，白樺脂酸的來源 主要有三種:第一，從天然植物中提取分離得到。第二，以白樺脂醇為前體，通過有機合成得 到白樺脂酸。第三，以白樺脂醇為前體，通過微生物生物轉(zhuǎn)化形成白樺脂酸。
[0005] 目前，有研究表明，樺褐孔菌中可以分離到白樺脂酸。但是，在實驗的過程中，發(fā)現(xiàn) 從樺褐孔菌中直接提取白樺脂酸時，得到的量非常低，幾乎沒有，所以希望找到一種更為高 效的提高白樺脂酸產(chǎn)量的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種利用真菌激發(fā)子誘導(dǎo)從樺褐孔菌中提取白樺脂酸的方法，該方 法無需引入基因工程菌株或外加酶，后處理簡單，能有效提高樺褐孔菌中白樺脂酸的產(chǎn)量。
[0007] -種利用真菌激發(fā)子誘導(dǎo)從樺褐孔菌中提取白樺脂酸的方法，包括：
[0008] (1)將可產(chǎn)孢子的絲狀真菌進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)后離心、洗滌得到菌絲體，破碎細 胞，離心取沉淀，然后用蒸餾水配制成濃度為8-12mg/mL的細胞碎片溶液，滅菌，得到真菌激 發(fā)子；
[0009] (2)將活化的樺褐孔菌（Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液體培養(yǎng)基，于24-26 °C發(fā)酵培養(yǎng)8-14天，在發(fā)酵第4-8天加入真菌激發(fā)子，發(fā)酵完成后，分離菌體和發(fā)酵液，通 過后處理從菌體和發(fā)酵液中分離純化得到白樺脂酸；
[0010] 其中，所述可產(chǎn)孢子的絲狀真菌為刺盤孢菌、黑曲霉、米曲霉和尖孢鐮刀菌中的至 少一種。
[0011] 白樺脂酸屬于一種次生代謝產(chǎn)物，主要在樺褐孔菌的代謝過程中產(chǎn)生，樺褐孔菌 的發(fā)酵周期一般為12天。真菌激發(fā)子是來源于真菌的一類化學(xué)物質(zhì)，具有誘導(dǎo)細胞中防衛(wèi) 基因的表達并促進細胞中特定次生代謝產(chǎn)物的合成等功能，在植物或微生物的次級代謝產(chǎn) 物合成的研究過程中，被廣泛用做誘導(dǎo)物質(zhì)。本發(fā)明在研究中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵中期加入真菌激 發(fā)子可有效提高樺褐孔菌中白樺脂酸的含量。
[0012] 本發(fā)明中，所述真菌激發(fā)子可采用如下方法制備:將可產(chǎn)孢子的絲狀真菌接種于 PDA培養(yǎng)基并在25±1°C培養(yǎng)7d，然后轉(zhuǎn)入TOB液體培養(yǎng)基中，25°C條件下震蕩培養(yǎng)3d(搖床 轉(zhuǎn)速為140r/min);培養(yǎng)完成后，于3500r/min離心10min，菌絲體用蒸餾水洗滌3次，用 50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH為7.2)洗滌3次，采用超聲波細胞粉碎機破碎細胞(300W，Imin X 5)，3500r/min離心10min后取沉淀，在顯微鏡下觀察時，菌絲體應(yīng)均為碎片狀;然后用上述 緩沖液洗滌3次，蒸餾水洗滌3次;用蒸餾水配制成一定濃度的細胞碎片溶液，高壓蒸汽滅菌 后，得到真菌激發(fā)子;放4 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0013] 所述樺褐孔菌（Inonotus obliquus)CFCC 83414菌株購自中國林業(yè)微生物菌種保 藏管理中心，菌株編號CFCC 83414。
[0014] 所述樺褐孔菌（Inonotus obliquus)CFCC 83414活化用的固體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡 萄糖瓊脂合成培養(yǎng)基和麩皮水浸提液的混合物。馬鈴薯葡萄糖瓊脂合成培養(yǎng)基可以為市售 產(chǎn)品。
[0015] 所述固體培養(yǎng)基中原料質(zhì)量百分比組成可以為:馬鈴薯浸出粉1%，葡萄糖2%，瓊 月旨1.8%，氯霉素0.01 %，余量為麩皮水浸提液;其中，麩皮水浸提液為麩皮按照4-6%質(zhì)量 百分比濃度加入水中，經(jīng)熬制、除雜后得到。
[0016] 固體培養(yǎng)基可以通過如下方法制備:將麩皮按照4-6%質(zhì)量百分比濃度加入水中， 熬制0.4-0.6小時后用八層紗布過濾除去大顆粒;然后加入馬鈴薯葡萄糖瓊脂合成培養(yǎng)基， 混勻，煮沸，分裝在玻璃管中，之后在121°C下滅菌20min，滅菌后擺成斜面待其凝固。
[0017] 所述液體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖合成培養(yǎng)基和麩皮水浸提液的混合物。馬鈴薯葡 萄糖合成培養(yǎng)基可以為市售產(chǎn)品。
[0018] 所述液體培養(yǎng)基中原料質(zhì)量百分比組成可以為：馬鈴薯浸出粉0.8%，葡萄糖2%， 余量為麩皮水浸提液;其中，麩皮水浸提液為麩皮按照4-6%質(zhì)量百分比濃度加入水中，經(jīng) 熬制、除雜后得到。
[0019] 液體培養(yǎng)基可以通過如下方法制備:將麩皮按照4-6%質(zhì)量百分比濃度加入水中， 熬制0.4-0.6小時后用八層紗布過濾除去大顆粒;然后加入馬鈴薯葡萄糖合成培養(yǎng)基，混 勻，分裝，之后在121°C下滅菌20min。采用此培養(yǎng)基配方，更有利于菌體的生長和代謝。
[0020] 所述發(fā)酵溫度可以為25°C，發(fā)酵時間可根據(jù)發(fā)酵方式不同而不同。當采用發(fā)酵罐 發(fā)酵時，培養(yǎng)時間可以為8-10天；當采用三角瓶發(fā)酵時，發(fā)酵時間可以為11-14天。本發(fā)明研 究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵罐處理效果更好，發(fā)酵罐與三角瓶相比，不易污染，通氣量大，溶氧充分，同時， 由于樺褐孔菌是好氧真菌，故用發(fā)酵罐生長更快，發(fā)酵周期更短。
[0021] 三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)時，前2-3天轉(zhuǎn)速設(shè)為Orpm/min，然后再以90-110rpm/min的轉(zhuǎn)速 培養(yǎng)2-3天，之后再以150-180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)。先靜置2-3天，是因為剛接種后，培養(yǎng)基中 菌體較少，所需要的氧氣也較少;然后再以90-110rpm/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2-3天，是因為這個時 期，菌體已經(jīng)在逐漸增多，所以要適當增大轉(zhuǎn)速，以滿足其對氧氣的需求。之后再以150-180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，是因為此時其菌體量已經(jīng)達到其最大值，所以要適當加大轉(zhuǎn)速。這樣 設(shè)置轉(zhuǎn)速，更有利于菌體生長和代謝。
[0022] 優(yōu)選地，所述可產(chǎn)孢子的絲狀真菌為黑曲霉。通過對刺盤孢菌、黑曲霉、米曲霉和 尖孢鐮刀菌這四類真菌的激發(fā)子進行初步比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑曲霉激發(fā)子誘導(dǎo)效果最佳。
[0023] 所述真菌激發(fā)子的加入時間可以為發(fā)酵第4-5天。因為此時添加，發(fā)酵后得到的白 樺脂酸的量最多。
[0024]以每升發(fā)酵液計，所述真菌激發(fā)子的添加量可以為10-90mg;優(yōu)選為30-60mg;更優(yōu) 選為45mg。因為加入激發(fā)子的量過少時，誘導(dǎo)效果不明顯;激發(fā)子加入量過高時，將會抑制 白枠脂酸的廣生。
[0025]所述后處理包括將菌體破碎后用乙酸乙酯萃取，同時將發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取， 之后合并萃取液，濃縮，得到白樺脂酸。
[0026]所述菌體破碎、萃取方法為：將菌體先用無菌水洗滌兩次，之后加入適量的無菌 水，用超聲破碎儀破碎5次，每次lmin(300W)，然后加入等量的乙酸乙酯進行萃取，于23-27 °〇超聲提取0.8_1.2h，萃取2_3次，合并，得到萃取液。
[0027]所述發(fā)酵液萃取方法為：將發(fā)酵液用等量的乙酸乙酯萃取，于23-27Γ超聲提取 0.8-1.2h，萃取2-3次，合并，得到萃取液。
[0028] 本發(fā)明在樺褐孔菌發(fā)酵過程中，于合適的時機添加誘導(dǎo)劑真菌激發(fā)子，以提高白 樺脂酸產(chǎn)量，具備如下有益效果：
[0029] (1)通過在發(fā)酵中期添加真菌激發(fā)子，有效促進了樺褐孔菌及其發(fā)酵液中白樺脂 酸產(chǎn)量的提高，可以提高幾倍到幾十倍不等。
[0030] (2)真菌激發(fā)子是來源于真菌的一類化學(xué)物質(zhì)，具有誘導(dǎo)細胞中防衛(wèi)基因的表達 并促進細胞中特定次生代謝產(chǎn)物的合成等功能。真菌激發(fā)子在添加前需要將菌體破碎成碎 片并滅菌。
【附圖說明】
[0031]圖1為白樺脂酸標準品的液相色譜圖。
[0032]圖2為菌體破碎液的液相色譜圖。
[0033]圖3為發(fā)酵液的液相色譜圖 [0034]圖4為本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0035] 為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例來闡釋本發(fā)明。下述實施例中所用的材料、試 劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0036] 以下實施例中：樺褐孔菌（Inonotus obliquus)CFCC 83414菌株購自中國林業(yè)微 生物菌種保藏管理中心，菌株編號CFCC 83414。
[0037] 實施例1
[0038] 1、真菌激發(fā)子的制備
[0039]先將黑曲霉接種于PDA斜面培養(yǎng)基上并在25±1°C培養(yǎng)7d，然后轉(zhuǎn)入PDB液體培養(yǎng) 基中，25°C條件下震蕩培養(yǎng)3d(搖床轉(zhuǎn)速為140r/min)。真菌培養(yǎng)物應(yīng)在培養(yǎng)結(jié)束后取， 3500r/min離心10min，菌絲體用蒸餾水洗滌3次，用50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)洗滌3 次，用JY96-II V超聲波細胞粉碎機破碎細胞(3001，111^11\5)，350(^/1^11離心101^11后取沉 淀。在顯微鏡下觀察時，菌絲體應(yīng)均為碎片狀。然后用上述緩沖液洗滌3次，蒸餾水洗滌3次。 用蒸餾水配制成10mg/mL的黑曲霉細胞碎片溶液，高壓蒸汽滅菌后，得到真菌激發(fā)子，放4°C 冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0040] 2、固體培養(yǎng)基的制備
[0041] 將麩皮按照5%質(zhì)量百分比濃度加入水中，熬制0.5小時后用八層紗布過濾除去大 顆粒，得到麩皮水浸提液;然后加入PDA合成培養(yǎng)基(市售），混合均勻后，將其煮沸后分裝在 玻璃管中，每管IOmU之后在121°C下滅菌20min。滅完菌后擺斜面至斜面凝固。
[0042] 其中，原料質(zhì)量百分比組成為：馬鈴薯浸出粉1%，葡萄糖2%，瓊脂1.8%，氯霉素 0.01 %，余量為麩皮水浸提液。
[0043] 3、菌種的活化
[0044]將樺褐孔菌CFCC 83414接種到斜面上，在25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天左右，待其長 滿整個斜面。
[0045] 4、液體培養(yǎng)基的制備
[0046] 將麩皮按照5% (以水的體積計）的比例加入水中，并且熬制半個小時后用八層紗 布過濾除去大顆粒，得到麩皮水浸提液;然后加入TOB合成培養(yǎng)基(市售），混合均勻后，分裝 在500mL的錐形瓶中，每瓶分裝IOOmU之后在121°C下滅菌20min。
[0047] 其中，原料質(zhì)量百分比組成為：馬鈴薯浸出粉0.8%，葡萄糖2%，余量為麩皮水浸 提液。
[0048] 5、接種
[0049] 每個搖瓶接種1塊Icm2的樺褐孔菌CFCC 83414菌種。
[0050] 6、發(fā)酵
[00511 在25°C溫度下培養(yǎng)，先靜置2~3天，然后再以IOOrpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2-3天，之后再以 180rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)。
[0052] 7、真菌激發(fā)子的加入
[0053]正常的發(fā)酵過程中，在發(fā)酵第6天加入真菌激發(fā)子，每瓶加0.45mL，使得發(fā)酵液中 真菌激發(fā)子的濃度為45mg/L。
[0054] 8、菌體和發(fā)酵液的分離和提取
[0055] 將發(fā)酵液及菌體倒入50mL離心管，在3500r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，將發(fā)酵液和 菌體細胞分離。菌體用去離子水洗2次后稱其濕重，之后每管加入15mL左右的去離子水，用 超聲破碎儀破碎5次，每次Imin，加入等量的乙酸乙酯，25 °C下超聲Ih，萃取2次;對于每個樣 品，發(fā)酵液每個樣取50mL，用量筒稱量其體積，然后加入等量的50mL乙酸乙酯萃取，25°C溫 度下超聲Ih，之后用離心機離心，轉(zhuǎn)速為3500r/min，時間為IOmin，每個樣品萃取2次。之后 用旋蒸儀進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，直到將其蒸干為止，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的參數(shù)如下:轉(zhuǎn)速為120r/min， 水浴的溫度為50°C。
[0056]得到的晶體用l-2mL甲醇(色譜純)溶解，用0.22μπι的有機系的微孔濾膜過濾除雜， 之后等待進樣。
[0057] 9、白樺脂酸濃度的測定:反相液相色譜法(RP-HPLC)。
[0058]其色譜檢測條件：
[0059] 色譜柱DiamonsiICl8(250mmX4.6mm，5μηι);
[0060] 流動相為乙腈/水(v/v = 91/9);
[0061] 流速 1.0mL/min;
[0062] 檢測波長210nm;
[0063] 柱溫 25°C;
[0064] 進樣量 20yL;
[0065] 跑樣時間25min，梯度洗脫。
[0066] 繪制標準曲線:取Iml標準品進樣，在色譜檢測條件下測定對應(yīng)的峰面積值(A)，以 峰面積值A(chǔ)為縱坐標，白樺脂酸的濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，經(jīng)統(tǒng)計處理求得白樺脂酸 濃度與峰面積的線性回歸方程為:A = 9.46836C+0.18939 (R2 = 0.99798)。
[0067]實驗組在發(fā)酵中期時加入真菌激發(fā)子，對照組未進行任何處理。測定結(jié)果表明，對 照組中濕重菌體中白樺脂酸的含量為0.1004yg/g，添加真菌激發(fā)子的實驗組中白樺脂酸的 含量為2.9316yg/g。對照組發(fā)酵液中白樺脂酸的含量為0.1180yg/mL，而添加真菌激發(fā)子的 實驗組發(fā)酵液中白樺脂酸的含量為0.7895yg/mL。
[0068]由結(jié)果可知，添加真菌激發(fā)子的實驗組白樺脂酸的含量顯著高于自然發(fā)酵的對照 組?？梢娺m量的加入真菌激發(fā)子能起到提高白樺脂酸含量的作用。
[0069] 實施例2
[0070]參照實施例1的樺褐孔菌發(fā)酵工藝，在加入真菌激發(fā)子階段，每瓶加入濃度為 I Omg/mL的黑曲霉細胞碎片溶液0.9mL，使得發(fā)酵液中激發(fā)子的濃度為90mg/L。其他條件同 實施例1。
[0071 ]白樺脂酸濃度的檢測方法同實施例1。
[0072] 按照本實施例的方法，發(fā)酵12天后檢測到實驗組濕菌體中白樺脂酸的含量為 2.8679yg/g，對照組中白樺脂酸的含量為0.1004yg/g。
[0073] 實驗組在發(fā)酵中期時加入油酸，對照組未進行任何處理。測定結(jié)果表明，對照組發(fā) 酵液中白樺脂酸的濃度為〇. 1180yg/mL，添加激發(fā)子的實驗組發(fā)酵液中白樺脂酸的濃度為 0.0230yg/mL〇
[0074] 從實施例1-2的結(jié)果表明，添加45mg/L的真菌激發(fā)子發(fā)酵的樺褐孔菌菌體或發(fā)酵 液中白樺脂酸的含量均高于自然發(fā)酵的對照；而添加90mg/L的真菌激發(fā)子發(fā)酵的樺褐孔 菌，僅菌體中白樺脂酸的含量高于自然發(fā)酵的對照。說明加入合適濃度的真菌激發(fā)子后，菌 體和發(fā)酵液中白樺脂酸的含量均會有明顯的提高。
[0075] 實施例3
[0076]參照實施例1的樺褐孔菌的發(fā)酵工藝，將樣品分成五組，其中四組為在發(fā)酵的不同 階段，第4、5、6、7天分別加入真菌激發(fā)子，每次每瓶發(fā)酵液均加入lOmg/mL的激發(fā)子溶液 0.45mL，使得發(fā)酵液中真菌激發(fā)子的濃度為45mg/L，另外一組為空白對照。其他條件同實施 例1〇
[0077] 白樺脂酸濃度的檢測方法同實施例1。
[0078] 本實施例除了測發(fā)酵液和菌體中白樺脂酸外，又測了各個處理組的生物量。生物 量的測量則按照以下的方法進行：當菌體和發(fā)酵液分離后，將菌體放入50mL的離心管中，離 心管要事先稱重，并編好標號，先于-80 °C的冰箱中預(yù)凍一天，然后在真空冷凍干燥機上凍 干48小時將其水分全部除去，之后稱取其質(zhì)量。減去離心管的質(zhì)量，即可得到菌體的干重。
[0079] 按照本實施例的方法，發(fā)酵12天后測得的不同真菌激發(fā)子添加時間的實驗結(jié)果見 表1。
[0080] 從表中數(shù)據(jù)可以看出，不同的真菌激發(fā)子添加時間對樺褐孔菌生物量的影響不 大，但對白樺脂酸的含量影響較大。第4天添加真菌激發(fā)子時發(fā)酵液中白樺脂酸的濃度最 高，為0.1259yg/mL;第7天添加真菌激發(fā)子時，菌體中白樺脂酸的含量最高，為3.2299yg/g; 而白樺脂酸總含量最高的為第4天添加真菌激發(fā)子時。綜合考慮以上實驗結(jié)果，可知添加真 菌激發(fā)子的最佳時間為第4天。
[0081 ]表1不同真菌激發(fā)子添加時間對發(fā)酵結(jié)果的影響 L 〇〇83 J 實施例4
[0084] 本實施例采用發(fā)酵罐進行發(fā)酵。培養(yǎng)基的制備和菌種的活化均同實施例1。
[0085] 與之前的實施例相比，本實施例的以下步驟有所不同：
[0086 ] 1、種子液的制備
[0087] 接種Icm2活化的菌種于裝有IOOmL培養(yǎng)基的500mL的錐形瓶中，在25°C、180rmp的 條件下于搖床中培養(yǎng)48h后得到種子液。
[0088] 2、發(fā)酵液的前處理
[0089]按實施例1的方法，配好4L的培養(yǎng)基，并滅菌。并且滅適量的大豆油作為消泡劑。將 酸堿電極校準之后，將發(fā)酵罐接入，平衡4~6個小時以上，使培養(yǎng)基達到預(yù)設(shè)好的溫度25 cC。
[0090] 3、接種
[0091] 在接種口周圍點上酒精，然后迅速將種子液加入發(fā)酵罐中，種子液按10% (以發(fā)酵 罐中培養(yǎng)基的體積計）的比例加入，即400mL。接種后將發(fā)酵罐的溫度設(shè)置為25°C，并接上消 泡劑一一大豆油。發(fā)酵9天。
[0092] 4、發(fā)酵液和菌體的分離提取
[0093] 發(fā)酵液和菌體的分離步驟同實施例1，但提取步驟與實施例1有些差異。為了找到 一種更為合適的提取方式，因此將菌體破碎液分成不同的處理方式進行萃取。分別為:25°C 下超聲Ih; 60 °C下超聲Ih; 25 °C下不超聲，直接萃取;液氮研磨，不超聲。本實施例還有一部 分菌體做了凍干處理，凍干過程參照實施例3,菌體破碎液的提取方式為25°C下超聲提取 lh〇
[0094] 蒸發(fā)濃縮步驟和白樺脂酸的檢測方法也同實施例1。
[0095] 不同的萃取處理方式的結(jié)果見表2。
[0096] 表2不同樸理方式對溫菌體中白樺脂酸提取量的影晌
[0099]結(jié)果表明，提取的溫度，以及是否超聲都會對結(jié)果有影響。將前兩組數(shù)據(jù)對比可 知，25°C的提取效果比60°C的效果好。將第一組和第三組數(shù)據(jù)對比可知，同樣的溫度下，超 聲提取的效果會更好一些。將最后兩組數(shù)據(jù)對比可知，液氮研磨的效果并不是太好。綜合以 上四種方法，可知25°C下超聲提取Ih這種方法最好。
[0100]以上的結(jié)果均為濕重，另外一組干重菌體檢測到的白樺脂酸的含量為612.56yg/ g°
[0101] 對于發(fā)酵液，本實施例僅用了 25°C下超聲提取Ih這一種方法進行提取，測得的白 樺脂酸的含量為3.8742yg/mL。
[0102] 本實施例表明，用發(fā)酵罐發(fā)酵的菌體和發(fā)酵液中白樺脂酸的量均比用搖瓶發(fā)酵的 高很多，意味著用發(fā)酵罐的擴大培養(yǎng)效果更好。
【主權(quán)項】
1. 一種利用真菌激發(fā)子誘導(dǎo)從樺褐孔菌中提取白樺脂酸的方法，包括： (1) 將可產(chǎn)孢子的絲狀真菌進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)后離心、洗滌得到菌絲體，破碎細胞，離 心取沉淀，然后用蒸餾水配制成濃度為8-12mg/mL的細胞碎片溶液，滅菌，得到真菌激發(fā)子； (2) 將活化的樺褐孔菌（Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液體培養(yǎng)基，于24-26°C 發(fā)酵培養(yǎng)8-14天，在發(fā)酵第4-8天加入真菌激發(fā)子，發(fā)酵完成后，分離菌體和發(fā)酵液，通過后 處理從菌體和發(fā)酵液中分離純化得到白樺脂酸； 其中，所述可產(chǎn)孢子的絲狀真菌為刺盤孢菌、黑曲霉、米曲霉和尖孢鐮刀菌中的至少一 種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖合成培養(yǎng) 基和麩皮水浸提液的混合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵采用發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵時間為8-10天。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵采用三角瓶發(fā)酵，發(fā)酵時間為11-14天;培養(yǎng)時，前2-3天轉(zhuǎn)速設(shè)為Orpm/min，然后再以90-110rpm/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2-3天，之后 再以150-180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述可產(chǎn)孢子的絲狀真菌為黑曲霉。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌激發(fā)子的加入時間為發(fā)酵第4-5 天。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以每升發(fā)酵液計，所述真菌激發(fā)子的添加 量為 10_90mg。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以每升發(fā)酵液計，所述真菌激發(fā)子的添加 量為 3〇-60mg。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述后處理包括將菌體破碎后用乙酸乙酯 萃取，同時將發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，之后合并萃取液，濃縮，得到白樺脂酸。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，萃取方法為：置于23-27Γ下超聲提取 0.8~1.2h〇
【文檔編號】C12R1/69GK106086147SQ201610528555
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】陳啟和, 李豪, 胡競進
【申請人】浙江大學(xué)