Lamp用加樣反應(yīng)容器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)耗材，特別涉及LAMP實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域的一種加樣反應(yīng)容器。
【背景技術(shù)】
[0002]2000年日本學(xué)者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開(kāi)了一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，即“環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)”，其英文名稱為L(zhǎng)AMP (Loop-mediated isothermal amplificat1n)。短短幾年，該技術(shù)受到了世衛(wèi)組織WH0、各國(guó)學(xué)者和相關(guān)政府部門的關(guān)注，該技術(shù)已成功地應(yīng)用于SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測(cè)中。近十幾年，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于日本國(guó)內(nèi)各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等引起的疾病檢測(cè)、食品化妝品安全檢查及進(jìn)出口快速診斷中，并得到了歐美國(guó)家的認(rèn)同。
[0003]LAMP技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn):(I)靈敏度高，比傳統(tǒng)的PCR方法高2?5個(gè)數(shù)量級(jí)；(2)反應(yīng)時(shí)間短，30?60分鐘就能完成反應(yīng)；(3)無(wú)需特殊的儀器(試劑盒或?qū)嶒?yàn)方法研發(fā)階段除外)；(4)操作簡(jiǎn)單，不論是DNA還是RNA，檢測(cè)步驟均為:將反應(yīng)液、酶和模板混合于反應(yīng)管中，置于水浴鍋或恒溫箱中63°C左右保溫30?60分鐘，肉眼觀察結(jié)果。
[0004]由于LAMP技術(shù)特異性和靈敏度高、操作簡(jiǎn)單且對(duì)儀器設(shè)備要求低、檢測(cè)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，特別適合基層食品安全快速檢測(cè)、基層防疫部門和環(huán)保部門病原微生物快速檢測(cè)、醫(yī)院臨床病原微生物的快速檢測(cè)和基層科研機(jī)構(gòu)或個(gè)人的研發(fā)需要等。
[0005]LAMP技術(shù)同時(shí)也存在如下缺點(diǎn):⑴由于LAMP技術(shù)靈敏度高，由于目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)條件所限，LAMP實(shí)驗(yàn)多采用普通移液器和普通PCR管(板)或Eppendorf管等常規(guī)分子生物學(xué)耗材和設(shè)備，在配液、反應(yīng)和點(diǎn)樣過(guò)程中，很容易造成待檢測(cè)樣本氣溶膠泄露至移液器槍管中，或因受熱導(dǎo)致PCR管或EP管管蓋密封不嚴(yán)導(dǎo)致待測(cè)樣本泄漏致水浴鍋、恒溫箱或加樣區(qū)域空氣中，帶來(lái)病原微生物等污染風(fēng)險(xiǎn)并導(dǎo)致后續(xù)LAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性率升高；(2)LAMP快速檢測(cè)試劑盒的研發(fā)實(shí)驗(yàn)涉及到引物的選擇，引物濃度的調(diào)整，及反應(yīng)溫度和時(shí)間的優(yōu)化，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅通過(guò)肉眼觀察定性結(jié)果是不夠的，這就需要對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行量化分析，常用的分子生物學(xué)移液加樣方法同樣會(huì)增加病原微生物等泄露和污染風(fēng)險(xiǎn)，以及后續(xù)LAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。
[0006]針對(duì)上述不足，需要提供一種LAMP加樣反應(yīng)容器，避免LAMP反應(yīng)在配液和點(diǎn)樣過(guò)程中病原微生物等氣溶膠的泄露和污染，以及后續(xù)LAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0007]有鑒于此，本實(shí)用新型提供了一種LAMP加樣反應(yīng)容器，可有效避免LAMP反應(yīng)在配液和點(diǎn)樣過(guò)程中病原微生物等氣溶膠的泄露和污染，以及后續(xù)LAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。
[0008]本實(shí)用新型的目的是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]LAMP用加樣反應(yīng)容器包括加樣器和反應(yīng)器兩部分，加樣器由吸帽和吸管組成，吸管兩端開(kāi)口，其中一端與吸帽密封連接且相通；反應(yīng)器由封閉部件、反應(yīng)部分和加樣部分組成，其中反應(yīng)部分的兩端為開(kāi)放式結(jié)構(gòu)，具有兩個(gè)開(kāi)口，反應(yīng)部分的一端開(kāi)口與封閉部件活動(dòng)連接，另一端開(kāi)口與加樣部分連通，加樣器吸管能夠從與反應(yīng)器封閉部件活動(dòng)連接的一端開(kāi)口內(nèi)適配插入，將加樣器中的液體轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器反應(yīng)部分和/或加樣部分內(nèi)。
[0010]優(yōu)選地，加樣器的吸帽為乳膠材質(zhì)，為了方便觀察移液動(dòng)作，避免誤操作發(fā)生，吸管選用透明或半透明材質(zhì)，優(yōu)選透明有機(jī)玻璃或透明塑料材質(zhì)；吸管整體為圓柱形或者吸管主體為圓柱形、末端為尖嘴，其中，優(yōu)選吸管末端為尖嘴的設(shè)計(jì)，因?yàn)榧庾熳觳颗c接觸容器之間的接觸面積較小可有效減少掛壁；另外，為滿足LAMP常用反應(yīng)體系的需要，吸帽和吸管的容積設(shè)計(jì)為30-80 μ 1
[0011]優(yōu)選地，反應(yīng)器反應(yīng)部分包括圓柱形或圓臺(tái)形頸部和反應(yīng)部，其中所述頸部與封閉部件活動(dòng)連接，所述反應(yīng)部與加樣部分連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，反應(yīng)器封閉部件可以選用任意一種可與反應(yīng)器頸部密封活動(dòng)連接的部件。為確保密封效果，該封閉部件優(yōu)選密封橡膠塞或密封乳膠塞等彈性部件，優(yōu)選地，該封閉部件分兩層，內(nèi)層為密封橡膠塞或密封乳膠塞等彈性部件，外層為鋁箔等加固部分，加固部分中央為可去除的供所述加樣器吸管順利通過(guò)的同心圓結(jié)構(gòu)，加樣器吸管能夠從中適配插入并與其密封結(jié)合。使用時(shí)，只需將加固部分中央同心圓結(jié)構(gòu)去除，將加樣器吸管從中適配插入將液體轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器反應(yīng)部分和/或加樣部分內(nèi)，同時(shí)吸管與乳膠塞等彈性部件內(nèi)層同心圓結(jié)構(gòu)形成密封結(jié)合，該技術(shù)方案可有效減少氣溶膠的泄露和污染。
[0012]為了增大LAMP反應(yīng)液與反應(yīng)部外壁接觸面積，提高LAMP反應(yīng)效率，反應(yīng)器反應(yīng)部分外壁呈弧形，反應(yīng)器選用導(dǎo)熱性能良好的材質(zhì)，尤其是，為了方便觀察移液動(dòng)作，避免誤操作發(fā)生，反應(yīng)器優(yōu)選透明導(dǎo)熱塑料或透明有機(jī)玻璃材質(zhì)，另外，為滿足LAMP常用反應(yīng)體系的需要，反應(yīng)部分弧形反應(yīng)部厚度為0.05-0.15_，體積為50-200 μ I。
[0013]優(yōu)選地，反應(yīng)器加樣部分分為緩沖區(qū)、刻度區(qū)、尾部，其中緩沖區(qū)、刻度區(qū)、尾部依序連接，且刻度區(qū)上設(shè)置有刻度，同時(shí)尾部的末端通過(guò)密封結(jié)構(gòu)使尾部末端形成封閉式結(jié)構(gòu)，避免加樣部分內(nèi)的液體隨意流出。為了方便LAMP反應(yīng)結(jié)束后定量檢測(cè)點(diǎn)樣，加樣部分軸線與反應(yīng)部分頸部軸線之間夾角為θ，30° ( Θ <90°，其中，優(yōu)選夾角為直角的設(shè)計(jì)，直角的設(shè)計(jì)在進(jìn)行加樣時(shí)操作性更加友好。
[0014]為滿足LAMP常用反應(yīng)體系的需要，加樣部分中間刻度區(qū)直徑設(shè)計(jì)為l-2mm，體積為20-50 μ I ;為了方便檢測(cè)點(diǎn)樣，加樣部分密封尾部于刻度終止處設(shè)有可整齊去除的磨砂環(huán)或可移除的密封蓋或密封塞。
[0015]本實(shí)用新型還公開(kāi)了前述LAMP用加樣反應(yīng)容器的使用方法，包括如下步驟:
[0016]I)取下反應(yīng)器封閉部件，使用加樣器吸取配制好的LAMP反應(yīng)液，加樣器吸管通過(guò)與反應(yīng)器封閉部件活動(dòng)連接的一端開(kāi)口將配制好的LAMP反應(yīng)液加入到反應(yīng)器反應(yīng)部；2)將反應(yīng)器放入溫控設(shè)備中進(jìn)行LAMP反應(yīng)，溫控范圍60°C _65°C，反應(yīng)時(shí)間15min_60min ；3)LAMP反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)器加熱至94°C _100°C，滅活反應(yīng)液中活性物質(zhì)；4)滅活完成后，取出反應(yīng)器，觀察熒光或濁度，進(jìn)行定性判定；5)通過(guò)加樣器向反應(yīng)器中加入2-5 μ I上樣緩沖液并混勻，通過(guò)加樣部分加樣電泳，定量分析LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。
[0017]采用上述加樣器取代移液器可有效解決因使用移液器所造成的在前實(shí)驗(yàn)樣本氣溶膠對(duì)在后實(shí)驗(yàn)的影響，有效減少在后實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性率。
[0018]目前，實(shí)驗(yàn)室LAMP反應(yīng)體系構(gòu)建過(guò)程中用到的標(biāo)準(zhǔn)的加樣器和反應(yīng)容器組合為“移液器+吸頭+PCR反應(yīng)管”，由于在配液、反應(yīng)和點(diǎn)樣過(guò)程中，尤其是后續(xù)的電泳定量檢測(cè)操作步驟中，需要反復(fù)打