一種高效擴(kuò)增人類外周血nk細(xì)胞的簡易裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于實驗用具領(lǐng)域，尤其是一種高效擴(kuò)增人類外周血NK細(xì)胞的簡易
目.ο
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前治療癌癥的主流臨床手段，如手術(shù)、放化療，盡管可對多種癌癥顯示不同的治療效果，但其適用范圍仍存在局限。如，手術(shù)方法對實體瘤較為有效，但對彌散性癌細(xì)胞導(dǎo)致的癌癥效果不佳且容易產(chǎn)生手術(shù)殘留；放化療可控制彌散性癌癥，但對病人身體產(chǎn)生的負(fù)擔(dān)也較大。ΝΚ細(xì)胞為非MHCI型分子限制型自然殺傷細(xì)胞，無需經(jīng)歷抗原呈遞過程即可對多種腫瘤細(xì)胞顯示殺傷效果。ΝΚ細(xì)胞得益于其自然殺傷效果，可作為適用范圍很大的輔助治療手段，用于清除癌癥病人體內(nèi)術(shù)后殘留或放化療后殘留的癌細(xì)胞，減少或避免癌癥復(fù)發(fā)或新的轉(zhuǎn)移灶產(chǎn)生，從而達(dá)到改善預(yù)后效果的目的。
[0003]傳統(tǒng)的ΝΚ細(xì)胞培養(yǎng)方法采用的是添加游離的細(xì)胞因子的液體培養(yǎng)基中，但由于ΝΚ細(xì)胞表面缺少IL — 15R α，其表面表達(dá)的IL — 15R β、IL — 15R γ對IL — 15親和力不強(qiáng)，故此方法無法實現(xiàn)ΝΚ細(xì)胞的大量體外擴(kuò)增。另有ΝΚ細(xì)胞培養(yǎng)方法采用經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的Κ562工程細(xì)胞系，該細(xì)胞系表面可表達(dá)⑶137L、IL 一 15、IL 一 15Ra、IL 一 21，通過接觸式細(xì)胞膜刺激激活NK細(xì)胞，達(dá)到高倍率擴(kuò)增的目的，但經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的K562工程細(xì)胞本身為癌細(xì)胞，需經(jīng)過輻射滅活才可使用，有潛在的使用風(fēng)險和技術(shù)要求較高、造價高昂等不利限制。為擺脫使用K562工程細(xì)胞系的限制而同時保證細(xì)胞培養(yǎng)過程中獲得足夠供給臨床使用的NK細(xì)胞總量，本發(fā)明提供了一種高效擴(kuò)增人類外周血NK細(xì)胞的裝置。
【實用新型內(nèi)容】
[0004]本實用新型的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種增殖效率高、結(jié)構(gòu)簡單、實用方便的高效擴(kuò)增人類外周血NK細(xì)胞的簡易裝置。
[0005]本實用新型實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:
[0006]—種高效擴(kuò)增人類外周血NK細(xì)胞的簡易裝置，包括一培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶一側(cè)制有瓶口，在培養(yǎng)瓶內(nèi)兩相向側(cè)面固裝翅片，兩側(cè)的翅片交錯設(shè)置，在翅片上表面制有培養(yǎng)槽，在培養(yǎng)槽表面包裹一層助劑層。
[0007]而且，所述助劑層為細(xì)胞因子和激發(fā)單抗。
[0008]本實用新型的有益效果為:
[0009]1、本實用新型在原有細(xì)胞培養(yǎng)瓶的基礎(chǔ)上進(jìn)了改進(jìn)和加工，將培養(yǎng)瓶內(nèi)對應(yīng)的兩側(cè)壁制有翅板，兩側(cè)壁的翅板交叉設(shè)置，培養(yǎng)瓶內(nèi)設(shè)置翅板能夠使NK細(xì)胞更多接觸到光滑的翅板表面，能夠激發(fā)NK細(xì)胞增殖，提高NK細(xì)胞的培養(yǎng)效率。
[0010]2、本申請通過固相結(jié)合細(xì)胞因子和特制的NK培養(yǎng)液對NK細(xì)胞進(jìn)行共刺激，實現(xiàn)了 NK細(xì)胞表面的IL - 15和其它相關(guān)細(xì)胞因子受體的有效激活，從而獲得足夠供給臨床上NK細(xì)胞免疫療法需使用的細(xì)胞量，同時避免了使用K562工程細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞的潛在風(fēng)險和高昂成本，使更多一般硬件水平和技術(shù)水平的實驗室也可進(jìn)行NK細(xì)胞的高效體外擴(kuò)增。
[0011]3、本申請?zhí)峁┑暮喴籽b置不同于常規(guī)培養(yǎng)瓶，該培養(yǎng)瓶內(nèi)部固定有平行排列的凹心板狀結(jié)構(gòu)，可有效增大培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積，同時在一定程度上防止培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時常見的細(xì)胞沉降問題，保持培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞比較均勻的分布。
【附圖說明】
[0012]圖1為本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0013]圖2為圖1的A-A向剖視圖；
[0014]圖3為圖1的B-B向剖視圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合附圖并通過具體實施例對本實用新型作進(jìn)一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本實用新型的保護(hù)范圍。
[0016]—種高效擴(kuò)增人類外周血NK細(xì)胞的簡易裝置，包括一培養(yǎng)瓶1，培養(yǎng)瓶一側(cè)制有瓶口 2，在培養(yǎng)瓶內(nèi)兩相向側(cè)面固裝翅片3，兩側(cè)的翅片交錯設(shè)置，在翅片上表面制有培養(yǎng)槽5，在培養(yǎng)槽表面包裹一層助劑層4，所述助劑層為細(xì)胞因子和激發(fā)單抗，所述細(xì)胞因子和激發(fā)單抗包括 CD137L、IL — 15、IL — 15Ra、IL — 21、MICA。
[0017]在培養(yǎng)瓶內(nèi)壁及翅片本實用新型的操作過程如下:
[0018]成人外周血NK細(xì)胞分離培養(yǎng)。
[0019]采血體積60ml，III型抗凝劑抗凝，常規(guī)ficoll密度梯度力心分離PBMC，總PBMC計數(shù)1*108。流式細(xì)胞表型分析顯示⑶3-/⑶56+比例約為總PBMC的5%，即NK細(xì)胞數(shù)為5*106。
[0020]將分離后的PBMC以NKEM培養(yǎng)基洗滌一次后，重懸于100ml新鮮的NKEM，等量注入10個經(jīng)CD137L、IL — 15、IL 一 15Ra、IL 一 21、MICA包被的低細(xì)胞粘附性75T培養(yǎng)瓶，包被濃度分別為 50ng/ml、300U/ml、50ng/ml、300U/ml、50ng/ml，并將其置于 37 °C 5 % C02培養(yǎng)箱中，每2天更換半量新鮮的NKEM。
[0021]培養(yǎng)第7天，有核細(xì)胞總數(shù)達(dá)到約1.1*108，F(xiàn)ACS檢測結(jié)果⑶3_/⑶56+比例約為25%，此時更換新的經(jīng)CD137L、IL 一 15、IL 一 15Ra、IL 一 21、MICA包被的低細(xì)胞粘附性75T培養(yǎng)瓶，并將其置于37°C 5% 0)2培養(yǎng)箱中，每2天更換半量新鮮的NKEM。
[0022]培養(yǎng)第14天，有核細(xì)胞總數(shù)達(dá)到約2.0*108，F(xiàn)ACS檢測結(jié)果CD3-/CD56+比例約為50%。重新調(diào)整細(xì)胞密度為2.0*106/ml，并以每75T培養(yǎng)瓶10ml加入新的經(jīng)CD137L、IL 一15、IL 一 15Ra、IL 一 21、MICA包被的低細(xì)胞粘附性75T培養(yǎng)瓶，每2天更換半量新鮮的NKEMo
[0023]培養(yǎng)第21天，有核細(xì)胞總數(shù)達(dá)到約1.1*109，F(xiàn)ACS檢測結(jié)果⑶3_/⑶56+比例約為70%。此時已經(jīng)可以收獲體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞用于臨床。
【主權(quán)項】
1.一種高效擴(kuò)增人類外周血NK細(xì)胞的簡易裝置，包括一培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶一側(cè)制有瓶口，其特征在于:在培養(yǎng)瓶內(nèi)兩相向側(cè)面固裝翅片，兩側(cè)的翅片交錯設(shè)置，在翅片上表面制有培養(yǎng)槽，在培養(yǎng)槽表面包裹一層助劑層。
【專利摘要】本實用新型涉及一種高效擴(kuò)增人類外周血NK細(xì)胞的簡易裝置，包括一培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶一側(cè)制有瓶口，在培養(yǎng)瓶內(nèi)兩相向側(cè)面固裝翅片，兩側(cè)的翅片交錯設(shè)置,在翅片上表面制有培養(yǎng)槽，在培養(yǎng)槽表面包裹一層助劑層。所述助劑層為細(xì)胞因子和激發(fā)單抗。本申請?zhí)峁┑暮喴籽b置不同于常規(guī)培養(yǎng)瓶，該培養(yǎng)瓶內(nèi)部固定有平行排列的凹心板狀結(jié)構(gòu)，可有效增大培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積，同時在一定程度上防止培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時常見的細(xì)胞沉降問題，保持培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞比較均勻的分布。
【IPC分類】C12M1/24, C12M3/00
【公開號】CN204999921
【申請?zhí)枴緾N201520524723
【發(fā)明人】王之嬰, 朱江
【申請人】天津市康婷生物工程有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年7月20日