一種ercc1基因多態(tài)性擴增檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本實用新型屬于生物技術領域，具體涉及一種ERCCl基因多態(tài)性擴增檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 鉑類藥物是對具有生物活性的含鉑化合物藥物的總稱，是最常用的腫瘤化療藥物 之一，包括順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等。其藥理學機制主要是通過引起腫瘤細胞內(nèi)DNA的交聯(lián)， 形成鏈內(nèi)/鏈間DNA加合物抑制細胞，阻礙DNA合成與復制，從而抑制腫瘤細胞的生長。但因 治療過程中伴發(fā)嚴重的胃腸道反應、腎及神經(jīng)毒性，臨床往往因為患者無法耐受而被迫終 止鉑類藥物的治療，同時也發(fā)現(xiàn)相當一部分患者對鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性。對鉑類藥物的抵 抗可通過以下機制發(fā)生:減少藥物積聚、通過共輒結(jié)合解除藥物毒性，提高對鉑類藥物誘導 產(chǎn)生的DNA加合物的耐受性，或者提高DNA修復能力?？茖W研究證明鉑類藥物的療效和副作 用存在顯著地個體差異：患者本身遺傳特征的差異是主要的原因之一，主要涉及DNA修復相 關基因和解毒酶相關基因的多態(tài)性及表達量。經(jīng)大量研究證實，ERCCl基因是鉑類藥物療效 檢測主要革巴標之一(Evans WE1Relling MVjPharmacogenomics:translating functional genomics into rational therapeutics·Science[J]·1999，286:487-491)〇
[0003] 切除修復交叉互補基因 l(excision repair cross-complementing rodent repair deficiency ,complementation group I，ERCC1)是核苷酸外切修復家族中的重要 成員。核苷酸切除修復(NER)是最重要的細胞修復，在NER途徑中，ERCCl基因發(fā)揮了重要作 用，對腫瘤細胞的影響表現(xiàn)為對鉑類藥物的敏感性的高低不同。ERCCl基因多態(tài)性可以改變 ERCCl的DNA修復能力，其第118密碼子OT突變后，能夠影響ERCCl基因表達的蛋白質(zhì)水平， 其中T等位基因 ERCClmRNA水平更高，則會有更強的DNA修復能力?？蓪е禄颊咩K類藥物化療 的敏感性下降，療效降低。因此，檢測ERCCl基因第118密碼子OT基因多態(tài)性具有很強的臨 床實用價值（Shirota Yl ,Stoehlmacher J，Brabender J ERCCland thymidylate synthase mRNAlevels predict survival for colorectal cancer patients receiving combination oxaliplatin and fluorouracil chemotherapy.J Clin Oncol.2001Dec I; 19(23):4298-304)。 【實用新型內(nèi)容】
[0004] 本實用新型的目的：提供一種ERCCl基因多態(tài)性擴增檢測試劑盒，能較好的應用于 ERCCl基因第118密碼子OT基因多態(tài)性檢測，體積小，便于運輸攜帶和使用，克服了目前對 ERCCl檢測特異性不強，檢測成本高且方法較復雜的不足之處。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本實用新型采用以下技術方案：
[0006] 一種ERCCl基因多態(tài)性擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：盒體 (1 )、襯墊(2 )，所述的襯墊(2)置于盒體（1)內(nèi)，襯墊(2)上設有容器孔裝有DNA提取試劑的可 立凍存管(3)，裝有PCR反應液的可立凍存管(4)、裝有陽性對照1的可立凍存管(5)、裝有陽 性對照2的可立凍存管(6 )、裝有陽性對照3的可立凍存管(7 )、裝有陰性對照的可立凍存管 (8)。試劑盒結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0007] 上述的裝有DNA提取液和PCR反應液的可立凍存管為2ml可立凍存管，裝有陽性對 照1、陽性對照2、陽性對照3、陰性對照的可立凍存管均為0.5ml可立凍存管。
[0008] 上述的PCR反應液包括DNA聚合酶、UNG酶、引物、探針及Mg2+，所述的探針為TaqMan MGB探針（美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)）。
[0009] 優(yōu)選地，所述的陽性對照包括3組，陽性對照1為含野生型純合子ERCCl序列的質(zhì) 粒;陽性對照2為含突變體純合子ERCCl序列的質(zhì)粒；以及陽性對照3為等比例混合的陽性對 照1和陽性對照2。
[0010]進一步優(yōu)選地，所述的檢測試劑盒的檢測樣本為m)TA(乙二胺四乙酸)抗凝全血。
[0011] 根據(jù)所述的ERCCl基因多態(tài)性檢測試劑盒的檢測方法，其主要特點是，所述的檢測 方法包括樣本的基因組DNA提取，以樣本基因組DNA為模板的擴增檢測，檢測結(jié)果的分析。
[0012] 優(yōu)選地，所述的樣本處理步驟包括：
[0013] 1.將含Iml樣本的離心管充分振蕩，12000rpm離心5分鐘，棄上清。
[0014] 2.沉淀中加入ImL生理鹽水，旋渦振蕩器上振蕩分散沉淀，12000rpm離心5分鐘，棄 上清。
[0015] 3.往沉淀中加入已振蕩混勻的DNA提取液50yL，旋渦振蕩器上振蕩打散沉淀，99 °C 干浴或者水浴10分鐘。
[0016] 4. 12000rpm離心5分鐘，在不觸動管子底部的沉淀物的情況下吸取上清液用于 PCR反應。
[0017] 更優(yōu)選地，所述的PCR擴增步驟包括：
[0018] 1.樣品設置:在儀器軟件的相應樣本設置窗口內(nèi)填寫各樣本的名稱。
[0019] 2.熒光通道選擇:每個樣品選擇FAM和VIC 2個通道。參比熒光設置為none。
[0020] 3.反應條件設定:反應體積設定為50yL，反應條件如下:UNG酶反應條件:37 °C加熱 5分鐘，預變性條件為95°C加熱5分鐘，變性條件為95°C，15秒，以及退火、延伸及檢測熒光條 件為60°C，1分鐘，共40個循環(huán)。
[0021 ]進一步優(yōu)選地，所述的四個對照組檢測標準如下：
[0022] 陰性對照:FAM通道和VIC通道無明顯擴增曲線，且Ct顯示為Undet。
[0023] 陽性對照I: VIC通道有擴增曲線，且Ct〈36;FAM通道無明顯S型擴增曲線，且Ct顯示 為Undet〇
[0024] 陽性對照2: FAM通道有擴增曲線，且Ct〈36; VIC通道無明顯S型擴增曲線，且Ct顯示 為Undet〇
[0025] 陽性對照3:FAM、VIC通道有典型的擴增曲線，且Ct〈36;
[0026] 上述四個條件必須同時滿足，否則，本次試驗無效。
[0027]進一步優(yōu)選地，所述的ERCCl的基因多態(tài)性位點為第118密碼子OT位點。
[0028] 采用了該實用新型檢測試劑盒，其優(yōu)點在于：
[0029] 1.操作簡單、快速，本實用新型核酸抽提部分采用煮沸法，操作簡單，僅需要一般 實驗室所使用的離心機和水浴鍋或金屬浴即可，在35分鐘內(nèi)便可完成樣本核酸的抽提處理 全過程，且擴增部分可一次進行最多96個樣本的測試（含3個陽性對照和1個陰性對照樣 本)。
[0030] 2.降低耗材的使用以便降低檢測成本，采用本實用新型的方法在操作的全過程中 需要的耗材只有核酸抽提所使用的1.5ml離心管、擴增使用的八連管或96孔板以及移液器 吸頭。
[0031 ] 3.檢測結(jié)果準確，降低假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，在擴增步驟加入陰性對照和陽性對照， 以此可以有效提高對假陽性和假陰性出現(xiàn)的判斷。
[0032] 4.對實驗污染的有效減少，a.本實用新型采用熒光探針PCR方法，既將核酸的PCR 擴增所用試劑組分一次性加入反應管中并采用熒光PCR儀進行擴增反應，為全封閉反應檢 測環(huán)境;b.加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)并以dUTP替代dNTP等PCR污染控制措施可有效防 止PCR的污染;c.采用TaqMan MGB探針以提高檢測特異性；用于檢測ERCCl基因多態(tài)性的等 位基因特異性核酸引物和用于檢測ERCCl基因多態(tài)性的寡核苷酸探針，探針為TaqMan MGB 探針，TaqMan MGB探針與傳統(tǒng)的TaqMan探針相比，其在擴增檢測過程中可有效降低背景信 號的