一種胞苷脫氨酶基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種胞苷脫氨酶基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]吉西他濱是目前常用的化療藥物之一，其作為非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌的一線治療藥物已取得較好的療效，也可與卡鉑、紫杉醇等藥物聯(lián)合，用于治療膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤等多種腫瘤(Fitzgerald SM，Goyal RK , Osborne ff R , e tal.1dentificat1n of funct1nal single nucleotide polymorphism haplotypes inthe cytidine deaminase promoter[J].Hum Genet,2006,119(3):276-283),Sugiyama E，Kaniwa N，Kim SR,et al.Pharmacokinetics of gemcitabine in Japanese cancerpatients: the impact of a cytidine deaminase polymorphism!! J].J Clin Oncol，2007，25(1):32-42)。然而，不同患者在接受吉西他濱治療時(shí)，即使采用相同的單位體表面積劑量，療效和不良反應(yīng)仍差別明顯，從而限制了吉西他濱在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。除了患者本身疾病、性別、年齡等差異外，與吉西他濱相關(guān)的胞苷脫氨酶的基因CDA多態(tài)性是一個(gè)重要影響因素。CDA基因多態(tài)性會(huì)影響吉西他濱的藥代動(dòng)力學(xué)，通過損害CDA對(duì)吉西他濱的解毒功能，導(dǎo)致藥物毒副作用的增加，CDA活性減弱的癌癥患者在接受吉西他濱治療時(shí)易導(dǎo)致更高的毒性發(fā)生。CDA存在兩種基因多態(tài)性A79C和G208A，其突變型會(huì)導(dǎo)致⑶A活性減弱，使腫瘤患者在接受吉西他濱治療時(shí)易發(fā)生更高的毒副作用(Yue L,Saikawa Y,Ota K，etal.A funct1nal single-nucleotide polymorphism in the human cytidinedeaminase gene contributing to ara_C sensitivity[J].Pharmacogenetics，2003，13(I):29-38)o
[0003]目前檢測(cè)基因多態(tài)性的方法很多，包括反向點(diǎn)雜交、等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)、直接測(cè)序法等，但都因費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜或特異性和敏感性不理想而未能廣泛使用，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0004]本實(shí)用新型要解決的技術(shù)問題為目前市場(chǎng)上針對(duì)胞苷脫氨酶基因CDA單核苷酸多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)特異性不強(qiáng)，成本高且操作復(fù)雜的問題，本實(shí)用新型能較好的應(yīng)用于CDA基因A79C和G208A兩個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，且體積小，便于運(yùn)輸攜帶和使用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采用以下技術(shù)方案:
[0006]—種胞苷脫氨酶基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括盒體1、海綿襯墊2，所述的海綿襯墊2置于盒體I內(nèi)，海綿襯墊2上設(shè)有的容器孔裝有多個(gè)裝有試劑的試劑管，分別為裝有胞苷脫氨酶基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)液的試劑管3、裝有A79C野生型陽性對(duì)照、突變型陽性對(duì)照、雜合子陽性對(duì)照的試劑管4-6、裝有G208A野生型陽性對(duì)照、突變型陽性對(duì)照、雜合子陽性對(duì)照的試劑管7-9、裝有陰性對(duì)照的試劑管10。
[0007]所述的海綿襯墊上容器孔數(shù)量較佳的為8個(gè)，容器孔在所述的海綿襯墊上分兩排排列，每排4個(gè)，上述的裝有胞苷脫氨酶基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)液的試劑管為2ml試劑管，裝有各類陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的試劑管均為0.5ml試劑管。
[0008]上述的胞苷脫氨酶基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)液主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、特異性引物、探針、Mg2+和dUTP。
[0009]優(yōu)選地，所述的陽性對(duì)照包括A79C野生型陽性對(duì)照、突變型陽性對(duì)照、雜合子陽性對(duì)照，G208A野生型陽性對(duì)照、突變型陽性對(duì)照、雜合子陽性對(duì)照。
[0010]本實(shí)用新型所述的所有陽性對(duì)照為本領(lǐng)域常規(guī)的陽性對(duì)照，本實(shí)用新型優(yōu)選的為含有CDA基因DNA序列且包含相應(yīng)多態(tài)性檢測(cè)位點(diǎn)上游和下游檢測(cè)引物及引物之間的基因組DNA序列的質(zhì)粒。
[0011 ]優(yōu)選地，所述CDA基因多態(tài)性檢測(cè)引物包括:
[0012]厶79(:上游引物，其序列為:5’-丁厶0^厶0厶丁6600^6厶厶6(:-3’；
[0013]厶79(:下游引物，其序列為:5’-6(:11^00^66厶6666厶6厶厶-3’；
[0014]6208厶上游引物，其序列為:5’-丁厶6厶厶厶厶丁60^60^001；(:1'-3’；
[0015]6208厶下游引物，其序列為:5’-厶1'1'1^^6660厶厶1760^1^6(:-3’。
[0016]優(yōu)選地，所述胞苷脫氨酶基因CDA單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)探針包括:
[0017]A79C野生型檢測(cè)探針，其序列為:5 ’-TGCTCCCAGGAGGCCAAGAAGTCA-3 ’，其5 ’端標(biāo)記物為J0E，3’標(biāo)記物為BHQ1;
[0018]A79C突變型檢測(cè)探針，其序列為:5 ’-TGCTCCCAGGAGGCCAAGCAGTCA-3 ’，其5 ’端標(biāo)記物為CY5，3 ’標(biāo)記物為BHQ2 ；
[0019]G208A野生型檢測(cè)探針，其序列為:5 ’-AACGGACCGCTATCCAGAAGGCCGT-3 ’，其5 ’端標(biāo)記物為ROX，3 ’標(biāo)記物為BHQl ；
[0020]G208A突變型檢測(cè)探針，其序列為:5 ’-AACGGACCACTATCCAGAAGGCCGT-3 ’，其5 ’端標(biāo)記物為TAMRA，3 ’標(biāo)記物為BHQ2。
[0021]本實(shí)用新型的保存溫度優(yōu)選的為-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0022]本實(shí)用新型較佳的應(yīng)用方法為:
[0023]1.試劑準(zhǔn)備:將待檢樣本的基因組DNA取5yL加入35yL PCR反應(yīng)液中待擴(kuò)增；
[0024]2.擴(kuò)增檢測(cè):進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)；
[0025]3.檢測(cè)結(jié)果分析:在同時(shí)滿足7個(gè)對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)的情況下，對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[0026]優(yōu)選地，所述的PCR擴(kuò)增檢測(cè)步驟包括:
[0027]1.熒光通道選擇:每個(gè)樣品選擇JOE、CY5、ROX和TMRA 4個(gè)檢測(cè)通道；
[0028]2.反應(yīng)條件設(shè)定:反應(yīng)體積設(shè)定為40yL，UNG酶反應(yīng)條件為37 V加熱5分鐘，預(yù)變性條件為95°C加熱5分鐘，變性條件為95°C，15秒，以及退火、延伸及檢測(cè)熒光條件為60°C，I分鐘，共40個(gè)循環(huán)。
[0029]應(yīng)用本實(shí)用新型的有益效果為:本實(shí)用新型提供的CDA基因單核苷酸多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，通過使用優(yōu)化設(shè)計(jì)的特異性檢測(cè)引物和探針及PCR擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)條件，有效克服了常規(guī)檢測(cè)方法步驟繁瑣，假陽性和假陰性易出現(xiàn)的缺點(diǎn)，大大提高CDA基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的特異性、敏感性。
[0030]本實(shí)用新型提供的CDA基因單核苷酸多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒設(shè)計(jì)合理，內(nèi)部結(jié)構(gòu)及各離心管排列有序，大小適宜，便于運(yùn)輸和使用。
【附圖說明】
[0031]圖1為本實(shí)用新型胞苷脫氨酶基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032]圖2為本實(shí)用新型檢測(cè)A79C位點(diǎn)野生型、G208A位點(diǎn)野生型樣本結(jié)果示意圖，其中a為JOE通道檢測(cè)曲線，c為ROX通道檢測(cè)曲線；
[0033]圖3為本實(shí)用新型檢測(cè)A79C位點(diǎn)野生型、G208A位點(diǎn)突變型樣本結(jié)果示意圖，其中a為JOE通道檢測(cè)曲線，d為TAMRA通道檢測(cè)曲線；
[0034]圖4為本實(shí)用新型檢測(cè)A79C位點(diǎn)野生型、G208A位點(diǎn)雜合子樣本結(jié)果示意圖，其中a為JOE通道檢測(cè)曲線，c為ROX通道檢測(cè)曲線，d為TAMRA通道檢測(cè)曲線；
[0035]圖5為本實(shí)用新型檢測(cè)A79C位點(diǎn)突變型、G208A位點(diǎn)野生型樣本結(jié)果示意圖，其中b為CY5通道檢測(cè)曲線，c為ROX通道檢測(cè)曲線；
[0036]圖6為本實(shí)用新型檢測(cè)A79C位點(diǎn)突變型、G208A位點(diǎn)突變型樣本結(jié)果示意圖，其中b為CY5通道檢測(cè)曲線，d為TAMRA通道檢測(cè)曲線；
[0037]圖7為本實(shí)用新型檢測(cè)A79C位點(diǎn)突變型、G208A位點(diǎn)雜合子結(jié)果示意圖，其中b為CY5通道檢測(cè)曲線，c為ROX通道檢測(cè)曲線，d為TAMRA通道檢測(cè)曲線；
[0038]圖8為本實(shí)用新型檢測(cè)A79C位點(diǎn)雜合子、G208A位點(diǎn)野生型結(jié)果示意圖，其中a為JOE通道檢測(cè)曲線，b*CY5通道檢測(cè)曲線，c為ROX通道檢測(cè)曲線；
[0039]圖9為本實(shí)用新型檢測(cè)A79C位點(diǎn)雜合子、G208A位點(diǎn)突變型樣本結(jié)果示意圖，其中a為JOE通道檢測(cè)曲線，b*CY5通道檢測(cè)曲線，d為TAMRA通道檢測(cè)曲線；
[0040]圖10為本實(shí)用新型檢測(cè)A79C位點(diǎn)雜合子、G208A位點(diǎn)雜合子結(jié)果示意圖，其中a為JOE通道檢測(cè)曲線，b*CY5通道檢測(cè)曲線，c為ROX通道檢測(cè)曲線，d為TAMRA通道檢測(cè)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0041]為了能夠更清楚地描述本實(shí)用新型的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)行進(jìn)一步的描述。
[0042]本實(shí)用新型所述的胞苷脫氨酶基因CDA單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試劑盒包括胞苷脫氨酶基因⑶A單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)反應(yīng)液、A79C和G208A兩個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的野生型陽性對(duì)照、突變型陽性對(duì)照、雜合子陽性對(duì)照以及陰性對(duì)照。
[0043]所述的陽性對(duì)照為本領(lǐng)域常規(guī)的陽性對(duì)照，本實(shí)用新型優(yōu)選的為含有CDA基因DNA序列且包含相應(yīng)多態(tài)性檢測(cè)位點(diǎn)上游和下游檢測(cè)引物及引物之間的基因組DNA序列的質(zhì)粒，各試劑管中陽性對(duì)照的體積均為0.1ml，離心管規(guī)格為0.5ml。
[0044]所述的陰性對(duì)照為去離子水