一種檢測胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐熱性的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測胞外蛋白酶酪蛋白水解活性 及耐熱性的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物在牛乳生產(chǎn)鏈過程中分泌的胞外耐熱蛋白酶會(huì)導(dǎo)致牛乳及制品產(chǎn)生凝膠， 沉淀和變苦?，F(xiàn)有的脫脂乳平板篩查技術(shù)，利用向培養(yǎng)基中添加脫脂乳，通過對微生物的培 養(yǎng)，觀察是否有水解圈的形成來判斷微生物的酪蛋白水解活力，操作簡單，但是只能檢測微 生物是否有酪蛋白水解活力，而不能精確定量地檢測和比較酪蛋白水解活力?，F(xiàn)有的偶氮 酪蛋白檢測技術(shù)，利用微生物對偶氮酪蛋白底物的降解，釋放具有特定紫外吸收波長的產(chǎn) 物，通過檢測產(chǎn)物的紫外吸收值，同時(shí)結(jié)合檢測菌體生長濃度，可以實(shí)現(xiàn)對微生物酪蛋白水 解活力的定量檢測，但是由于需要同時(shí)檢測菌體濃度，導(dǎo)致檢測過程復(fù)雜且不能實(shí)現(xiàn)批量 檢測。最近報(bào)道的偶氮酪蛋白檢測技術(shù)直接對培養(yǎng)基上清進(jìn)行檢測，可以不依賴菌體濃度， 能夠?qū)Π獾鞍酌傅睦业鞍姿饣盍Χ繙y試，但未能對其酪蛋白水解活力及耐熱性同時(shí) 進(jìn)行定量、批量檢測未能實(shí)現(xiàn)對胞外蛋白耐熱性的檢測，且在菌株復(fù)壯培養(yǎng)中，培養(yǎng)基體積 在5-8毫升，需要用試管培養(yǎng)，不利于批量操作。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0003] 本實(shí)用新型要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測胞外蛋白酶酪蛋白水 解活性時(shí)不能同時(shí)批量地檢測胞外蛋白酶耐熱性的缺陷，提供了一種檢測胞外蛋白酶酪蛋 白水解活性及耐熱性的試劑盒。本實(shí)用新型試劑盒可以同時(shí)對微生物胞外蛋白酶酪蛋白水 解活性及耐熱性進(jìn)行定量測試，通過得到的不同樣品之間的酪蛋白水解活性差異和耐熱性 差異可以更加精確比較菌株之間的差異。
[0004] 本實(shí)用新型是通過下述技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題：
[0005] -種檢測胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐熱性的試劑盒，其包括:盒蓋、盒體、襯 墊、裝有偶氮酪蛋白溶液的容器、裝有三氯乙酸溶液的容器、裝有氫氧化鈉溶液的容器和酶 標(biāo)板，所述襯墊設(shè)置于所述盒體內(nèi)，所述襯墊上設(shè)有容器孔和槽，所述裝有偶氮酪蛋白溶液 的容器和所述三氯乙酸溶液的容器置于所述容器孔內(nèi)，所述酶標(biāo)板置于所述槽內(nèi)。
[0006] 所述偶氮酪蛋白溶液可以為本領(lǐng)域常規(guī)的偶氮酪蛋白溶液，所述偶氮酪蛋白溶液 較佳地含有偶氮酪蛋白、3-嗎啉丙磺酸(MOPS)和氯化鈣，更佳的含有5g/L偶氮酪蛋白、50mM 3-嗎啉丙磺酸(MOPS)pH 6.7和ImM氯化鈣。所述三氯乙酸可以為本領(lǐng)域常規(guī)的三氯乙酸溶 液，較佳地為2M三氯乙酸溶液。所述氫氧化鈉溶液可以為本領(lǐng)域常規(guī)的氫氧化鈉溶液，較佳 地為1M氫氧化鈉溶液。所述酶標(biāo)板為本領(lǐng)域常規(guī)的酶標(biāo)板，較佳地為96孔酶標(biāo)板或384孔酶 標(biāo)板，更佳地為96孔酶標(biāo)板。所述容器為本領(lǐng)域常規(guī)的容器，較佳地為塑料試劑瓶或離心 管，更佳地為1.5mL離心管。所述容器孔的數(shù)量為一個(gè)到多個(gè)，較佳地為3個(gè)或4個(gè)。
[0007] 所述試劑盒較佳地還可以包括裝有細(xì)菌培養(yǎng)基的容器，所述細(xì)菌培養(yǎng)基可以為本 領(lǐng)域常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)基，較佳地為MPC培養(yǎng)基，所述MPC培養(yǎng)基包括5 . Og/L胰化蛋白胨、 2.5g/L酵母提取物和1.0g/L葡萄糖。所述細(xì)菌培養(yǎng)基可以用于對待檢測的細(xì)菌樣品進(jìn)行復(fù) 壯培養(yǎng)。
[0008] 所述試劑盒較佳地還可以包括使用說明書，所述使用說明書記載使用所述試劑盒 同時(shí)、批量檢測微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐熱性的方法，該方法包括以下步驟：
[0009] (1)將微生物培養(yǎng)液離心、取上清液；
[0010] (2)將一部分步驟（1)所述上清液90-100°C加熱l-3min，得經(jīng)過熱處理的上清液， 剩余的步驟(1)所述上清液為未經(jīng)過熱處理的上清液；
[0011] (3)將步驟（2)中所述經(jīng)過與未經(jīng)過熱處理的上清液與反應(yīng)緩沖液按體積比1: 0.5-1: 2分別混合，所述反應(yīng)緩沖液的組分為2-4.5g/L偶氮酪蛋白、25-45mM嗎啉丙磺酸 (MOPS)和1.5-3mM氯化鈣，35-45 °C反應(yīng)2-3h，加入1.5-3M三氯乙酸溶液或三氟乙酸終止反 應(yīng)，離心，取上清轉(zhuǎn)移至多孔板，向所述上清中加入強(qiáng)堿溶液至強(qiáng)堿終濃度為0.2-0.5M，分 別檢測450nm吸光值；
[0012] (4)將步驟(3)所得450nm吸光值分別換算為步驟(2)所述經(jīng)過熱處理與未經(jīng)過熱 處理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性，所述換算的方法為將樣品在450nm處的吸 光值減去空白對照在450nm的吸光值得吸光值增值，再將所述吸光值增值換算為每毫升樣 品每小時(shí)的吸光值增值即得所述胞外蛋白酶酪蛋白水解活性;所述胞外蛋白酶的耐熱性為 所得經(jīng)過熱處理與未經(jīng)過熱處理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。
[0013] 本實(shí)用新型的積極進(jìn)步效果在于:本實(shí)用新型試劑盒1)可以同時(shí)對微生物胞外蛋 白酶酪蛋白水解活性及耐熱性進(jìn)行定量測試，通過得到的不同樣品之間的胞外蛋白酶酪蛋 白水解活性和耐熱性差異可以更加精確比較菌株之間的差異;2)所有處理操作，都可以在 1.5ml的離心管中進(jìn)行，節(jié)省了試管到離心管的轉(zhuǎn)移步驟，菌株培養(yǎng)以及處理后可以直接離 心，使得操作更加便捷;3)節(jié)省了培養(yǎng)基的使用;4)通過酶標(biāo)板的使用能夠?qū)崿F(xiàn)批量操作； 5)不需要考慮菌體濃度，可以直接檢測菌液上清，比較一定體積單位中胞外蛋白酶酪蛋白 水解活性及耐熱性。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本實(shí)用新型實(shí)施例1和2中的檢測胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐熱性的試 劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖俯視圖，其中，1為盒蓋，2為盒體，3為襯墊，4為裝有偶氮酪蛋白溶液的容 器，5為裝有三氯乙酸溶液的容器，6為裝有氫氧化鈉溶液的容器，7為96孔酶標(biāo)板，8為槽。裝 有偶氮酪蛋白溶液的容器4、裝有三氯乙酸溶液的容器5、裝有氫氧化鈉溶液的容器6和裝有 細(xì)菌培養(yǎng)基的容器7置于容器孔內(nèi)，96孔酶標(biāo)板7置于槽8內(nèi)。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面舉個(gè)較佳實(shí)施例，并結(jié)合附圖來更清楚完整地說明本實(shí)用新型。
[0016] 本實(shí)用新型實(shí)施例中用到的培養(yǎng)基如下：
[0017] MPC培養(yǎng)基:5. Og/L胰化蛋白胨、2.5g/L酵母提取物和1. Og/L葡萄糖
[0018] MPC固體培養(yǎng)基:在上述MPC培養(yǎng)基中加入脫脂乳粉至lg/L，瓊脂至18g/L，調(diào)pH值 7·0±0· 1，115°C滅菌 15min
[0019] 滅菌脫脂乳:取lOg脫脂乳粉溶于1L水中，115°C，15min滅菌即得
[0020]本實(shí)用新型中以下實(shí)施例所用到的菌株均為假單胞菌(Pseudomonas sp)，編號(hào)分 別為 N2-3、N5-3、N9-2、M41、M46、J937、N96、D11、D13、M13、N97、D62、D72、D81、D104、D15、D19、 044、1435、1436、1737、021、022、046、084、0105、仰35、1225和町1。以上菌株由本實(shí)驗(yàn)室從原 料乳中分離獲得，分離方法包括以下步驟:對原料乳用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，取1〇_2~1〇_5 四個(gè)稀釋度樣品各l〇〇yL，涂布于MPC固體培養(yǎng)基上，挑單菌落劃線，重復(fù)兩次，所得的菌株 即為實(shí)驗(yàn)菌株。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] -種檢測胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐熱性的試劑盒，其形狀和結(jié)構(gòu)如圖1所 示，其包括:盒蓋1、盒體2、襯墊3、裝有偶氮酪蛋白溶液的容器4、裝有三氯乙酸溶液的容器 5、裝有氫氧化鈉溶液的容器6和96孔酶標(biāo)板7,所述裝有偶氮酪蛋白的容器4、裝有三氯乙酸 溶液的容器5和裝有氫氧化鈉溶液的容器6嵌入3個(gè)容器孔內(nèi)，所述96孔酶標(biāo)板7置于槽8內(nèi)。 裝有偶氮酪蛋白溶液的容器4中為含有5g/L偶氮酪蛋白、50mM MOPS pH6.7和ImM氯化鈣的 溶液，裝有三氯乙酸溶液的容器5中為2M三氯乙酸溶液，裝有氫氧化鈉溶液的容器6中為1M NaOH溶液。該試劑盒還包括使用說明書，使用說明書記載了使用所述試劑盒同時(shí)、批量檢測 微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐熱性的方法。
[0023] 實(shí)施例2用實(shí)施例1試劑盒檢測一般細(xì)菌胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐熱性
[0024] (1)將凍存的假單胞菌菌株N2-3、N5-3和N9-2從-20 °C冰箱中取出置于冰盒上，以 2%體積比的接種量接種到含lmLMPC培養(yǎng)基的EP管中，30°C培養(yǎng)箱200rpm振蕩復(fù)壯培養(yǎng) 24h，得復(fù)壯細(xì)菌培養(yǎng)液;取所述復(fù)壯細(xì)菌培養(yǎng)液100yL轉(zhuǎn)接至含lmL滅菌脫脂乳的EP管中30 °C 200rpm振蕩培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)好的菌液25 °C 12000rpm離心15min，得上清液；
[0025] (2)取100yL步驟（1)上清液于金屬浴中100°C加熱2min，4°C冷卻30s后，另取100yL 步驟(1)上清液不加熱備用；
[0026] (3)將步驟(2)經(jīng)過加熱與未經(jīng)加熱的上清液分別與反應(yīng)緩沖液100yL混合，40°C 反應(yīng)2h，所述反應(yīng)緩沖液的組分為4.5g/L偶氮酪蛋白、45mMM0PS和1.5mM氯化鈣。兩組樣品 均用20yL2M的三氯乙酸終止反應(yīng)，25°C10000rpm離心15min;取離心后的上清150yL至96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板中，加50yL 1M氫氧化鈉溶液，立即用酶標(biāo)儀測450nm的吸光值；
[0027] (4)將步驟(3)測得的樣品吸光值減去同一空白樣品（菌液上清由去離子水替代） 的吸光值即得吸光值增值(DAhASOnm處每毫升樣品每小時(shí)的吸光值增值即為蛋白酶活