專利名稱：熒光納米粒微球的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于生物檢測的熒光微球的制備方法，尤其涉及一種聚合物基或二氧化硅基的、帶有熒光納米粒微球的制備方法。
背景技術(shù)：
熒光微球一般指微球表面標有熒光物質(zhì)(包括表面包覆)或微球體內(nèi)結(jié)構(gòu)性含有熒光物質(zhì)(如包埋或聚合)的微球。借助于熒光分析，熒光微球通常可利用該微球表面所含的特殊基團，作為探測劑用于測定與其有特異性結(jié)合的生物分子的存在，作為校正劑用于校正熒光基探測系統(tǒng)，以及作為示蹤劑用于追蹤含熒光微球的流體流動。
傳統(tǒng)的熒光物質(zhì)通常采用的是有機熒光染料，例如，熒光素，羅丹明，藻紅蛋白和類似的物質(zhì)。但這些熒光染料易受物理和化學因素的制約(1)不同顏色的染料其激發(fā)光的波長不同，導致同時擁有不同激發(fā)波長的兩個或更多熒光標記物需要復合的激發(fā)光源，對使用多熒光染料的方法增加了成本和復雜性。(2)有機染料在長時間暴露于激發(fā)光下時，其熒光強度會減退。這種現(xiàn)象叫光漂白，依賴于激發(fā)光的強度和照明的持續(xù)時間。(3)有機染料轉(zhuǎn)化成非熒光物質(zhì)是不可逆的。而且，染料物質(zhì)的降解產(chǎn)物是有機物，可能會影響生物檢測過程。(4)不同染料之間存在光譜交迭。這部分是由于有機染料的寬發(fā)射光譜和接近尾區(qū)的光譜呈現(xiàn)交迭。幾乎沒有低分子量的染料有大的Stokes位移和高的熒光輸出(Stokes位移定義為發(fā)射和吸收峰位的間距)。
為了克服上述含有機染料熒光微球的不足，近年來，含有半導體納米粒的熒光微球已經(jīng)有文獻報道。它們的優(yōu)點是共有一個激發(fā)波長光譜，能夠發(fā)射高量子產(chǎn)額的熒光并且發(fā)射光譜有大的Stokes位移。中國專利CN 1389539A(2003)公開了一種將表面修飾有不同官能基團的熒光納米粒復合到無機二氧化硅或有機聚合物微球的納米粒熒光微球制備方法。美國專利US 6,680,211(2004)公開了一種利用某些聚合物具有的溶脹特性，將熒光納米粒填入到溶脹的聚合物孔中，而后去溶脹得到物理包埋的聚合物基熒光微球的制備方法。然而，這些方法很難做到有均勻的微球分布及微球中均勻的熒光納米粒含量，不利于準確的定量熒光分析。
利用層層自組裝(layer-by-layer self-assembly)技術(shù)來構(gòu)造具有核殼結(jié)構(gòu)的功能性微球最近得到了長足的進展。這類核殼型微球的制備通常是以帶電的有機或無機微球為核，在其表面逐層吸附帶相反電荷的聚電解質(zhì)和/或納米粒子。得到的核殼型微球的殼厚度可以很容易地通過改變吸附循環(huán)的次數(shù)來控制，同時殼的尺寸與形狀可由所用核的尺度預先確定。這樣得到的核殼型微球具有與核顯著差異的特殊性質(zhì)(如不同的化學組成、良好的穩(wěn)定性、高的比表面積，以及不同的磁和光學性質(zhì))。美國專利US 6,833,192(2004)就采用了層層自組裝技術(shù)，在晶體粒子表面交替組裝了多層聚電解質(zhì)和/或納米粒子，形成了核殼型復合粒子，其中納米粒子可以是熒光納米粒。
通常熒光納米粒采用高熒光產(chǎn)額的II-VI族半導體納米粒，如CdS、CdSe、ZnSe、CdTe及CdSe/CdS和CdSe/ZnS等具有核殼結(jié)構(gòu)的納米粒。然而直接在水相中層層自組裝這些納米粒，因強的靜電排斥作用限制了納米粒吸附量。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種新的制備熒光納米粒微球的方法，以制備出熒光納米粒均勻分布的熒光納米粒微球。
本發(fā)明提出的制備熒光納米粒微球的方法是以聚合物或二氧化硅微球為核，采用層層自組裝技術(shù)，在微球表面交替組裝絡(luò)合有鎘離子或鋅離子的多層聚電解質(zhì)，而后引入硫離子、硒離子或碲離子，原位反應(yīng)得到均勻的熒光納米粒微球。
微球的尺寸在50nm～10μm，熒光納米粒的尺寸在1～15nm，其熒光峰位在400～650nm范圍內(nèi)。
本發(fā)明的熒光納米粒微球的制備方法包括如下步驟1.微球表面層層自組裝絡(luò)合M2+的多層聚電解質(zhì)(M為II族的Cd、Zn等元素)選用單分散的粒徑均勻分布的聚合物或二氧化硅微球為模板核，聚合物微球可選用如聚苯乙烯、聚甲基丙稀酸甲酯、三聚氰胺甲醛(MF)等。微球的粒徑小于10μm，較好的粒徑范圍為50nm～5μm，更好的粒徑范圍為100nm～500nm。
待組裝的聚電解質(zhì)陽離子聚電解質(zhì)選用聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)，聚二烯丙基二甲基氯化銨(poly(diallyldimethylammonium chloride)，PDDA)，聚烯丙基胺鹽酸鹽(poly(allylamine hydrochloride)，PAH)；陰離子聚電解質(zhì)選用聚4-苯乙烯磺酸鹽(poly(styrenesulfonate)，PSS)，聚乙烯硫酸鹽(poly(vinylsulfate))，聚丙烯酸(poly(acrylic acid)，PAA)。
M2+源鎘離子化合物選用Cd(NO3)2、CdCl2、Cd(ClO4)2、Cd(CH3COO)2等水溶液；鋅離子化合物選用Zn(NO3)2、Zn(CH3COO)2等水溶液。
制備過程i)將陽、陰離子聚電解質(zhì)分別和可溶性鹽，如NaCl或KCl等配制成溶液A和B。使溶液A(和B)中聚電解質(zhì)的濃度為0.1～5g/L，鹽的濃度為0.05～0.6mol/L。
ii)將濃度為0.001～0.1mol/L的M2+溶液分別與聚電解質(zhì)A(和/或B)溶液混合，振蕩吸附15min-12h，最好是1～6h，使離子與聚電解質(zhì)官能團產(chǎn)生絡(luò)合，得到絡(luò)合M2+的聚電解質(zhì)Ac(和Bc)溶液。M2+溶液的濃度越高，最后得到的熒光微球上的納米粒的尺寸越大，熒光峰位相應(yīng)紅移。
iii)將核微球攪拌分散在溶液Ac中。室溫下攪拌5～60min，最好是10～30min，形成模板微球吸附絡(luò)合M2+的聚電解質(zhì)的水溶性懸浮液，絡(luò)合M2+的聚電解質(zhì)的量必須大于在模板微球上吸附一個單分子層的量。模板微球與懸浮液的質(zhì)量比為0.5～5％，最好為1～2％。然后用離心，除去上清液，用去離子水水洗/離心/重新分散3～5遍。
iv)將步驟iii)中得到沉積物再分散在溶液Bc中，并按步驟iii)接下來的操作再進行一次。
v)將步驟iv)中得到沉積物再分散在溶液Ac中，并按步驟iii)接下來的操作再進行一次。如此循環(huán)多次，得到模板微球表面吸附聚電解質(zhì)多層膜的復合微球懸浮液。
2.組裝在微球表面的絡(luò)合M2+的多層聚電解質(zhì)與含X2-的水溶液原位反應(yīng)(X為VI族的S、Se、Te等元素)
含X2-的水溶液硫源可選用硫代乙酰胺(TAA)、Na2S水溶液；硒源可選用NaHSe、Na2SeO3水溶液；碲源可選用NaHTe、Na2Te水溶液。
將步驟1得到的復合微球懸浮液攪拌加熱到40～100℃，將配制好的0.001～0.1mol/L的含X2-的水溶液逐滴滴入懸浮液中反應(yīng)，X2-與M2+的摩爾比例保持在0.5～1.5，最好為1.1～1.2。反應(yīng)時間為15min～1h。停止反應(yīng)后，將生成的熒光微球用去離子水水洗/離心/重新分散3～5遍。
有益效果本發(fā)明的制備方法具有以下優(yōu)點(1)選用了均勻的聚合物或二氧化硅微球作模板，因此得到的熒光納米粒微球比較均勻；(2)熒光納米粒微球尺寸可通過選用不同尺寸的微球作模板，以及吸附聚電解質(zhì)的種類和層數(shù)加以控制，從而調(diào)節(jié)熒光微球的發(fā)光強度；(3)采用原位反應(yīng)的方法制得的納米粒子受到聚電解質(zhì)保護，可均勻分散在微球表層，不易引起團聚；(4)可以在同一微球表面組裝絡(luò)合不同M2+的聚電解質(zhì)，得到標有多種納米粒子的熒光微球；(5)可通過調(diào)節(jié)M2+與聚電解質(zhì)絡(luò)合的比例，控制微球表層熒光納米粒的尺寸，從而調(diào)節(jié)熒光發(fā)射峰位；(6)表面的聚電解質(zhì)有較強的功能性，對各種水溶液分散性較好，可以接生物活性物質(zhì)，如抗體、抗原、酶、蛋白質(zhì)或核酸，從而可以實現(xiàn)生物熒光檢測的目的。
具體實施例方式
下面將結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1步驟(1)將PSS，PDDA分別和NaCl配制成溶液A和B。溶液A(和B)中聚電解質(zhì)的濃度均為1g/L，鹽的濃度為0.5mol/L。
步驟(2)分別取濃度為0.01mol/L的Cd2+溶液50mL加入到50mL濃度為1g/L的聚電解質(zhì)PSS溶液中，取濃度0.01mol/L的Zn2+溶液50mL加入到50mL濃度為1g/L的聚電解質(zhì)PDDA溶液中，振蕩4h，使離子與聚電解質(zhì)官能團產(chǎn)生絡(luò)合，得到絡(luò)合Cd2+的聚電解質(zhì)PSS-Cd2+溶液和絡(luò)合Zn2+的聚電解質(zhì)PDDA-Zn2+溶液。
步驟(3)將2g平均粒徑為2μm的三聚氰胺甲醛(MF)微球攪拌分散在100mLPSS-Cd2+溶液中。室溫下攪拌30min，形成MF微球吸附聚電解質(zhì)PSS-Cd2+的水溶性懸浮液。然后用離心，除去上清液，用去離子水水洗/離心/重新分散4遍。
步驟(4)將步驟(3)中得到沉積物再分散在100mL PDDA-Zn2+溶液中，并按步驟(3)接下來的操作再進行一次。
步驟(5)將步驟(4)中得到沉積物再分散在溶液PSS-Cd2+中，并按步驟(3)接下來的操作再進行一次。如此循環(huán)4次，得到微球表面第一、三、五、七層為吸附PSS-Cd2+膜、第二、四、六、八層為吸附PDDA-Zn2+膜的復合微球懸浮液。
步驟(6)將復合微球懸浮液置于70℃水浴攪拌，再將配制好的0.01mol/L的硫代乙酰胺(TAA)溶液逐滴滴入懸浮液中反應(yīng)，S2-與Cd2+和S2-與Zn2+的比例保持在1.1。反應(yīng)0.5h后，溶液變?yōu)闇\黃綠色，停止反應(yīng)。將生成CdS/ZnS的熒光微球用去離子水水洗/離心/重新分散4遍。得到MF基熒光微球。其中熒光微球上的納米粒的平均尺寸為9nm，其熒光峰位為462nm。
實施例2用平均粒徑為200nm的聚苯乙烯微球取代實施例1中的MF微球，用100mL濃度為1g/L的PAH溶液取代實施例1中的100mL PDDA-Zn2+溶液，用“0.005mol/L的NaHSe溶液”取代步驟(6)中的“0.01mol/L的硫代乙酰胺(TAA)溶液”，其余重復實施例1中的第2～6步驟，最后得到生成CdSe的聚苯乙烯基熒光納米粒微球，其中得到熒光微球上的納米粒的平均尺寸在4nm，其熒光峰位在552nm。
實施例3用平均粒徑為100nm的SiO2微球取代實施例2中的聚苯乙烯微球，用“0.008mol/L的NaHTe溶液”取代實施例2中的“0.005mol/L的NaHSe溶液”其余重復實施例1中的第2～6步驟，最后得到生成CdTe的二氧化硅基熒光納米粒微球，其中得到熒光微球上的納米粒的平均尺寸在5nm，其熒光峰位在590nm。
權(quán)利要求
1.一種熒光納米粒微球的制備方法，所述的方法是以聚合物微球或二氧化硅微球為核，其特征在于，首先將帶有相反電荷的聚電解質(zhì)，分別與M2+離子絡(luò)合；再采用層層自組裝技術(shù)，將絡(luò)合好的帶相反電荷的聚電解質(zhì)逐層交替組裝在微球表面，其層數(shù)不受限制；而后引入X2-離子、進行原位反應(yīng)得到均勻的熒光納米粒微球；其中，M2+離子為II族的Cd2+、Zn2+中的一種或兩種，X2-離子為VI族的S2-、Se2-、Te2-中的一種。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光納米粒微球的制備方法，其特征在于，所述的帶有相反電荷的聚電解質(zhì)為陽離子聚電解質(zhì)選用聚乙烯亞胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚烯丙基胺鹽酸鹽中的一種；陰離子聚電解質(zhì)選用聚4-苯乙烯磺酸鹽、聚乙烯硫酸鹽、聚丙烯酸中的一種；M2+源為鎘離子化合物選用Cd(NO3)2、CdCl2、Cd(ClO4)2、Cd(CH3COO)2的水溶液中的一種，鋅離子化合物選用Zn(NO3)2、Zn(CH3COO)2的水溶液中的一種；所述的帶有相反電荷的聚電解質(zhì)在分別與M2+離子絡(luò)合過程中，將陽、陰離子聚電解質(zhì)分別和可溶性鹽的水溶液配制成溶液，配制好的聚電解質(zhì)溶液中，聚電解質(zhì)的濃度為0.1～5g/L，鹽溶液的濃度為0.05～0.6mol/L；將配制好的聚電解質(zhì)溶液與濃度為0.001～0.1mol/L的M2+溶液混合，振蕩吸附15min-12h，得到絡(luò)合M2+的聚電解質(zhì)溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的熒光納米粒微球的制備方法，其特征在于，微球的粒徑小于10μm。
4.如權(quán)利要求1所述的熒光納米粒微球的制備方法，其特征在于，在所述的將絡(luò)合好的聚電解質(zhì)組裝在微球表面的過程中，模板微球與絡(luò)合M2+的聚電解質(zhì)溶液的質(zhì)量比為0.5～5％。
5.如權(quán)利要求1所述的熒光納米粒微球的制備方法，其特征在于，在所述的引入X2-離子、進行原位反應(yīng)的過程中，將組裝在微球表面的絡(luò)合M2+的多層聚電解質(zhì)與含X2-的水溶液原位反應(yīng)，其中，含X2-的水溶液為硫源選用硫代乙酰胺、Na2S的水溶液中的一種；硒源選用NaHSe、Na2SeO3的水溶液中的一種；碲源選用NaHTe、Na2Te的水溶液中的一種；含X2-的水溶液濃度為0.001～0.1mol/L，X2-與M2+的摩爾比例為0.5～1.5，反應(yīng)時間為15min～1h。
6.如權(quán)利要求3所述的熒光納米粒微球的制備方法，其特征在于，微球的粒徑為50nm～5μm。
7.如權(quán)利要求6所述的熒光納米粒微球的制備方法，其特征在于，微球的粒徑為100nm～500nm。
8.如權(quán)利要求4所述的熒光納米粒微球的制備方法，其特征在于，模板微球與絡(luò)合M2+的聚電解質(zhì)溶液的質(zhì)量比為1～2％。
9.如權(quán)利要求5所述的熒光納米粒微球的制備方法，其特征在于，X2-與M2+的摩爾比為1.1～1.2。
全文摘要
本發(fā)明提出的制備熒光納米粒微球的方法，是以聚合物微球或二氧化硅微球為核，采用層層自組裝技術(shù)，在微球表面交替組裝絡(luò)合有鎘離子或鋅離子的多層聚電解質(zhì)，而后引入硫離子、硒離子或碲離子，原位反應(yīng)得到均勻的熒光納米粒微球。本方法可制備出熒光納米粒吸附量大、分布均勻、且標有多種納米粒子的熒光微球。
文檔編號C09K11/00GK1693412SQ20051002643
公開日2005年11月9日 申請日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者朱以華, 楊曉玲, 張素秋, 金誼, 郭飛 申請人:華東理工大學