專利名稱：一種理想的血細胞髓過氧化物酶染色試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及是用于血細胞髓過氧化物酶(MPO)染色的試劑盒及其制備方法。
背景技術：
血細胞MPO染色是國際血液學標準化委員會(ICSH)推薦的最重要、最常用的血細胞化學染色方法之一，對急性白血病分型診斷有重要的臨床意義。同時血細胞MPO染色對尿液中管型、異常淋巴細胞的鑒別以及遺傳性髓過氧化物酶缺陷癥的診斷也有一定的臨床意義。
血細胞MPO染色方法以Washburn法與Pereira法報道最多，Washburn法染色效果良好，具有定位準確、不會擴散、不易褪色等優(yōu)點，但缺點是在試劑配方中含有致癌作用的聯(lián)苯胺成分。Pereira法則試劑安全，但該法有染色時間不易控制，經(jīng)常因擴散而致假陰性，容易褪色需及時檢查并不能回顧性閱片，以及因陽性產(chǎn)物易溶于水不能流水沖洗影響結果觀察等缺點，因此Pereira法雖然受到一些學者推薦，而在臨床上應用較少。
1997年，國內(nèi)首次推薦試劑安全、染色效果理想的3-氨基-9-乙基咔唑法以取代Washburn法。但3-氨基-9-乙基咔唑法并沒有引起重視，據(jù)了解在臨床上應用不多，也未見試劑盒可購買。其原因可能是推薦的3-氨基-9-乙基咔唑法中，固定液(由甲醛、丙酮以及pH6.6磷酸鹽緩沖液組成)、工作液(由pH5.0～5.2醋酸鹽緩沖液、二甲基亞砜、3-氨基-9-乙基咔唑、過氧化氫組成)、Mayer蘇木素染液(由蘇木素、無水乙醇、硫酸鋁鉀及黃色氧化汞等組成)所用試劑較多，配制麻煩，工作液臨用配制后，需過濾才能使用，比Washburn法與Pereira法要繁瑣多(葉應嫵，王毓三主編.全國臨床檢驗操作規(guī)程.第2版.南京.東南大學出版社，199775.)目前，血細胞MPO染色的試劑盒及臨床應用，仍以Washburn法為主(李順義.急性白血病實驗室分型診斷程序[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2003，26(9)575～577)，不僅聯(lián)苯胺試劑污染了環(huán)境，也使操作該項目實驗工作者的健康受到傷害。另一方面，上述3種方法染色步驟要固定、工作液作用及復染分別進行，染色前要配制新鮮的稀過氧化氫溶液，方法較為麻煩。而稀過氧化氫溶液的濃度與用量對染色的成功與否影響極大，經(jīng)常因這兩方面的不準確性造成染色失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題，是提供一種用于血細胞MPO染色的試劑安全、穩(wěn)定簡便而且染色效果理想的試劑盒，為此，本發(fā)明還要提供一種該試劑盒的制備方法。
本發(fā)明試劑盒的原理是Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液對血細胞有固定與染色作用，陳舊的并且與空氣有經(jīng)常接觸過的Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液還有過氧化氫樣作用。粒細胞和單核細胞中的髓過氧化物酶分解Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液中的過氧化氫樣的物質(zhì)，產(chǎn)生新生態(tài)的氧，后者與底物3-氨基-9-乙基咔唑作用產(chǎn)生黃棕色的復合物而定于胞漿中。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案(1)工作液每升工作液中由0.5-10.0g3-氨基-9-乙基咔唑和1000mlWright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液組成。
(2)緩沖液濃度為0.067mol/L、pH＝5.3-5.9磷酸鹽緩沖液。
所述的工作液中的Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液的制備方法為3種染液均按常規(guī)方法進行配制，但配制之后應與空氣有經(jīng)常接觸過，染液越陳舊過氧化氫樣作用越強，MPO染色效果越好。判斷上述3種染液是否達到MPO染色要求的標準為成熟粒細胞MPO反應應為強陽性。若不符合則應繼續(xù)放置一段時間待觀察。
所述的工作液的制備方法為取符合MPO染色要求標準的Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液1000ml加入0.5-10.0g 3-氨基-9-乙基咔唑后，顛倒混勻3-5min即可。
本發(fā)明所能達到的有益效果是固定、顯色及復染一步操作完成，使用時無需配制新鮮的稀過氧化氫溶液。試劑安全簡單、配制方便，染色效果具有定位準確、不會擴散、不易褪色、各類細胞容易鑒別等優(yōu)點。與Washburn法相比試劑安全，與Pereira法相比染色效果理想，與3-氨基-9-乙基咔唑法相比試劑簡單、配制方便、操作容易，是一種非常理想的血細胞MPO染色方法。
具體實施例方式
1、一種理想的血細胞MPO染色試劑盒，由以下物質(zhì)組成
工作液(由3-氨基-9-乙基咔唑和Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液組成) 1瓶緩沖液(濃度為0.067mol/L、pH＝5.3-5.9磷酸鹽緩沖液) 1瓶2、本試劑盒的制備方法是通過如下步驟實現(xiàn)(1)Wright染液、Wright-Giemsa染液、Giemsa染液的制備方法3種染液均按常規(guī)方法進行配制，但配制之后應與空氣有經(jīng)常接觸過，染液越陳舊過氧化氫樣作用越強，MPO染色效果越好。試劑安裝前，應進行預試驗，觀察染液是否達到MPO染色標準要求成熟粒細胞MPO反應應為強陽性，若符合即可安裝；若不符合則應繼續(xù)放置一段時間待觀察。
(2)工作液的制備方法取符合MPO染色標準要求的Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液1000ml加入3.0g3-氨基-9-乙基咔唑后，顛倒混勻3-5min即可安裝。
(3)緩沖液濃度為0.067mol/L、pH＝5.5磷酸鹽緩沖液，常規(guī)方法進行配制。
3、染色步驟在干燥新鮮骨髓涂片或外周血涂片上滴加工作液5-10滴，蓋滿血膜，約30s后，滴加緩沖液10-20滴，與工作液混和，在室溫下作用5-10min后，流水沖洗2-3min，濾紙吸干或待干，鏡檢。
4、結果判斷本法血細胞MPO反應陰性細胞著色與染色時間有關，染色時間較短時胞核呈淺藍色，較長時胞核相近于常規(guī)血細胞Wright染色或Wright-Giemsa染色或Giemsa染色，細胞漿多呈藍色，各類細胞容易鑒別。血細胞MPO反應陽性產(chǎn)物為黃棕色或棕黑色的顆?；虺恋?，定于細胞漿內(nèi)，有時蓋在核上。各類血細胞MPO反應情況與Washburn法、Pereira法相同分化差的原粒細胞為陰性，分化好的原粒細胞至中性成熟粒細胞均呈陽性；而且隨著細胞的成熟，陽性反應的程度逐漸增強，但衰老的粒細胞陽性程度減弱甚至呈陰性。嗜酸性粒細胞呈強陽性，嗜堿性粒細胞則為陰性。單核細胞系統(tǒng)為陰性或陽性。淋巴細胞系統(tǒng)、紅細胞系統(tǒng)以及巨核細胞系統(tǒng)的細胞均呈陰性，漿細胞、組織細胞呈陰性反應，有的吞噬細胞呈陽性反應。
權利要求
1.一種理想的血細胞髓過氧化物酶染色試劑盒，其特征在于，它由下列試劑組成(1)工作液每升工作液中由0.5-10.0g 3-氨基-9-乙基咔唑和1000mlWright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液組成。(2)緩沖液濃度為0.067mol/L、pH＝5.3-5.9磷酸鹽緩沖液。
2.根據(jù)權利要求1所述的血細胞髓過氧化物酶染色的試劑盒，其特征在于，工作液的制備方法可以在臨用時，取5ml Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液加入2.5-50mg 3-氨基-9-乙基咔唑，顛倒混勻3-5min后，備用。此時，血細胞髓過氧化物酶染色的試劑盒試劑組成為(1)Wright染液或Wright-Giemsa染液或Giemsa染液；(2)3-氨基-9-乙基咔唑；(3)濃度為0.067mol/L、pH＝5.3-5.9磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
一種理想的血細胞髓過氧化物酶(MPO)染色試劑盒，是用于血細胞MPO染色檢測使用的。只有工作液和緩沖液組成，工作液是選擇一種對血細胞有固定、染色，并具有過氧化氫樣作用的染液為溶劑，與底物制備而成。固定、顯色及復染一步操作完成，使用時無需配制新鮮的稀過氧化氫溶液。試劑安全簡單、配制方便，染色效果具有定位準確、不會擴散、不易褪色、各類細胞容易鑒別等優(yōu)點。
文檔編號C09B69/00GK1811370SQ200510137889
公開日2006年8月2日 申請日期2005年12月29日 優(yōu)先權日2005年12月29日
發(fā)明者潘智勇, 潭映霞 申請人:溫州醫(yī)學院