專利名稱：過冷促進(jìn)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有黃酮苷的過冷卻促進(jìn)劑、以及含有該黃酮苷的不凍性液體和玻璃化液。
背景技術(shù)：
我們已經(jīng)知道在寒冷地區(qū)生長(zhǎng)的樹木的細(xì)胞液能夠在低溫下保持液體狀態(tài)。其原因認(rèn)為是由于這樣的樹木的木質(zhì)部薄壁細(xì)胞內(nèi)的水為與外界分
離的水滴，根據(jù)水的物理特性能夠過冷卻到-4(TC (非專利文獻(xiàn)l)。也就是說，認(rèn)為即使細(xì)胞外有冰生成，由于包圍著木質(zhì)部薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁能夠作為屏障發(fā)揮防止細(xì)胞脫水以及細(xì)胞外的冰浸入細(xì)胞內(nèi)的功能，且細(xì)胞內(nèi)的水作為與外界獨(dú)立的水滴存在，從而進(jìn)行過冷卻。
另外，已給出越冬植物中含有的酚化合物能夠作為防冷凍物質(zhì)發(fā)揮功能的啟示(非專利文獻(xiàn)2)。
另外，公開了用于培養(yǎng)生殖細(xì)胞等的冷凍培養(yǎng)基中使用了類黃酮(專利文獻(xiàn)1)，以及將類黃酮用作作為內(nèi)燃機(jī)等的冷卻液使用的防凍液的成分(專利文獻(xiàn)2)。
此外，已知作為本發(fā)明過冷卻促進(jìn)劑的黃酮苷以非常多的種類作為二次代謝物存在于包括樹木的植物中或生物來源的物質(zhì)中(非專利文獻(xiàn)3)。專利文獻(xiàn)l:日本特表2000-500327 (W097/14785)專利文獻(xiàn)2:日本再表WO2004/074397非專利文獻(xiàn)l:化學(xué)S生物vol.43，No.5, 280-282 (2005)非專利文獻(xiàn)2:化學(xué)&生物vol.37，No.12, 778-780 (1999)非專利文獻(xiàn)3 : " FLAVONOIDS Chemistry, Biochemistry andApplications" published in 2006 by CRC Press Taylor and Francis Group

發(fā)明內(nèi)容
已知不屬于糖苷的苯酚物質(zhì)(類黃酮)可能具有過冷卻活性(非專利文獻(xiàn)2)，而黃酮苷(非專利文獻(xiàn)3)能夠促進(jìn)水的過冷卻活性卻還不為人所知。
本發(fā)明人在對(duì)在寒冷地區(qū)生長(zhǎng)的樹木的細(xì)胞液能夠在低溫下保持液體狀態(tài)的機(jī)理進(jìn)行研究的過程中，對(duì)成為其原因的物質(zhì)進(jìn)行了鑒定研究。結(jié)果本發(fā)明人成功地鑒定出了樹木中存在的過冷卻促進(jìn)物質(zhì)。
本發(fā)明人著眼于在自然界中數(shù)周長(zhǎng)時(shí)間地持續(xù)穩(wěn)定地過冷卻至-4(TC以下的樹木的木質(zhì)部薄壁細(xì)胞，從樹木的木質(zhì)部以過冷卻活性為指標(biāo)進(jìn)行成分提取。結(jié)果弄清楚了這些細(xì)胞穩(wěn)定地過冷卻的原因物質(zhì)為黃酮苷。進(jìn)而，基于已清楚的化學(xué)結(jié)構(gòu)特性，發(fā)現(xiàn)類似結(jié)構(gòu)的黃酮苷也具有顯著地促進(jìn)水溶液過冷卻能力的能力，從而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供一種過冷卻促進(jìn)劑，其含有下述通式表示的黃
式中，乂1 乂4中至少一個(gè)為除去了單糖或寡糖的還原末端部分的半縮醛羥基的氫原子的糖殘基、其它為羥基或氫原子，W RS分別相同或不同地表示氫原子、羥基或甲氧基。
本發(fā)明還提供一種不凍性液體，其為將該過冷卻促進(jìn)劑溶解于水或根據(jù)用途而含有添加物的水溶液中而形成的，所述不凍性液體中含有0.01g/L以上的所述過冷卻促進(jìn)劑。
本發(fā)明另外還提供一種玻璃化液，其為在單獨(dú)或組合地含有20 100體積％的抗凍劑且剩余為水或根據(jù)用途而含有添加物的水溶液的玻璃化液中，含有0.01g/L以上的該過冷卻促進(jìn)劑而成的。
本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑，通過添加生物來源或合成的黃酮苷而使水的過冷卻成為可能，因此能夠應(yīng)用到低溫保存或冷凍狀態(tài)的控制等。
本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑能夠?qū)⑺蚝兴奈镔|(zhì)的冷凍溫度從原來水的冷凍溫度降低15'C左右。該過冷卻促進(jìn)劑能夠使大量的水在低溫下長(zhǎng)期穩(wěn)定地過冷卻。另外，本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑通過與水混合，能夠成為在約-15。C左右下使用的不凍性液體，從而能夠在該不凍性液體中長(zhǎng)期低溫保持生物材料等。
本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑使水、根據(jù)用途而含有添加物的水溶液或含水的物質(zhì)溶解并冷凍，從而能夠作為控制冰晶大小的冷凍控制劑使用。通過有關(guān)物質(zhì)的添加，能夠?qū)⒗眠^冷卻而使冷凍開始溫度降低從而使形成的冰晶的大小減小。因此，通過將添加有有關(guān)物質(zhì)的水溶液或改變冷卻速度或改變添加物的組成或濃度以進(jìn)行冷凍，能夠用作多樣地改變冰的大小的冷凍控制劑。
進(jìn)而，通過在以高濃度含有抗凍劑的玻璃化液中添加本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑，可以降低玻璃化液的濃度，能夠減輕浸漬于玻璃化液所引起的毒性、能夠在液氮溫度等超低溫下高效地產(chǎn)生玻璃體、以及可以保存至今為止在超低溫的玻璃體中玻璃保存困難的生物材料等。


圖1是表示連香樹(Cercidiphyllumjaponicumtree)提取物的乙酸乙酯可溶級(jí)分的硅膠柱層析的圖。
圖2是表示硅膠柱層析級(jí)分的過冷卻活性的圖。橫軸表示載有液滴的銅板的溫度，縱軸表示冷凍的液滴的比例。
圖3是表示合并上述級(jí)分9和10的級(jí)分的高效液相色譜法的圖。
圖4表示化合物1的乙?；锏腲-NMR譜圖。
圖5表示化合物2的乙?；锏膇H-NMR譜圖。
圖6表示化合物3的乙?；锏膇H-NMR譜圖。。
圖7表示化合物4的乙?；锏膇H-NMR譜圖。
圖8是表示將豬肝臟小片在含有山奈黃素-7-0-葡糖苷(K7G)的低溫(-5。C和-8t:)的保存液中以過冷卻狀態(tài)保存后的細(xì)胞生存率的圖。橫軸表示保存時(shí)間(日數(shù))、縱軸表示生存率(％)。
圖9是表示將酸果蔓(酸果蔓)的莖頂(芽)在室溫下浸漬到75%玻璃化液中一定時(shí)間后的生存率(對(duì)照區(qū))與其后浸于液氮中隨即融解至室溫后的生存率(冷凍區(qū))的圖。A表示使用含有山奈黃素-7-0-葡糖苷的玻璃化液、B表示使用不含有山奈黃素-7-0-葡糖苷的玻璃化液的情況。橫軸表示浸漬時(shí)間(分鐘)，縱軸表示生存率(％)。
具體實(shí)施例方式
作為本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑的黃酮苷用下式表示:
R1
式中，x' xA中至少一個(gè)、優(yōu)選x1和f或者x2和x、更優(yōu)選x1和
X2、最優(yōu)選XZ為除去了單糖或寡糖的還原末端部分的半縮醛羥基的氫原子的糖殘基，天然中僅僅已知了在X1和XS或者X2和乂4上糖苷結(jié)合的糖殘
基，但是包括這些，并不排除能夠合成的多個(gè)位置的羥基(y等)被糖基化的糖殘基。
此外，半縮醛羥基是指例如結(jié)合在下式的單糖或二糖的基本骨架的Cl
碳上的羥基。
作為該單糖，可列舉出葡萄糖、甘露糖、半乳糖，作為寡糖可列舉出蕓香糖，棉籽糖等，但糖殘基優(yōu)選為葡萄糖、甘露醇、半乳糖的單糖。
該糖殘基以外的Xi xA為羥基或氫原子，優(yōu)選其中至少一個(gè)為氫原子，更優(yōu)選XS為羥基、X"為氫原子。
W W可以分別相同或不同地表示氫原子、羥基或甲氧基。
其中，W優(yōu)選為氫原子或羥基，更優(yōu)選為氫原子。
R"優(yōu)選為氫原子或甲氧基、更優(yōu)選為氫原子，R2、 R3、 RS和W優(yōu)選為氫原子。
本發(fā)明中使用的黃酮苷由于含有在樹木等的全部的生物體中，因此可以從這些生物體或生物來源的物質(zhì)中提取，也可以進(jìn)行合成。
這些樹木由于在寒冷地區(qū)生長(zhǎng)的樹木中大量地含有所述過冷卻促進(jìn)物質(zhì)，因此被認(rèn)為是適用的。作為這樣的針葉樹(aciculartree)，例如可列舉出落葉松(Larix kaempferi)、金鐘柏(Thuja occidentalis)、紅豆杉(Taxuscuspidata)、曰本賴卩杉(Cryptomeriajaponica)、曰光冷杉(Abies homolepis)、庫(kù)頁(yè)冷杉(Abies sachalinensis)、魚鱗云杉(Picea jezoensis)、紅皮云杉(Piceaglehnii)、五針?biāo)?Pinus parviflora)、 白松(Pinus strobus)、長(zhǎng)白松(Pinus sylvestris)、黑松(Pinus thunbergii)等，作為闊葉樹(broad leaf tree)可歹(J舉出曰本白樺(Betula platyphylla var. japonica)、 山木湯(Populussieboldii)、日本粟(Castanea crenata)、合花楸(Sorbus commixta)、玉玲花(Styrax obassia)、大卩十櫟(Quercus crispula)、春榆(Ulmus davidiana var.japonica)、連香樹(Cercidiphyllumjaponicum)等。此夕卜，無論量的多少，在寒冷地區(qū)以外的區(qū)域生長(zhǎng)的樹木也都含有。所述黃酮苷不僅能從這些樹種的包括邊材、芯材的木質(zhì)部中提取，而且也能從樹皮、冬芽和葉子中提取。另外，這些物質(zhì)通常被認(rèn)為存在于活細(xì)胞(薄壁細(xì)胞)內(nèi)，但也有存在于細(xì)胞外的可能性。另外，這些物質(zhì)不僅能夠穩(wěn)定地從生長(zhǎng)的樹木中，而且也能夠從枯死的樹木或長(zhǎng)期貯藏的木材中提取。
本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑顯示出-0.1 -15.0。C的過冷卻活性。
此外，在本發(fā)明中，過冷卻活性(也稱為抗冰核形成活性)可以用按照以下方法測(cè)定的數(shù)值來表示。準(zhǔn)備在含有冰核活性細(xì)菌(Enviniaananas)的滅活菌體的緩沖液中混合有0.5mg/mL被測(cè)定物的溶液。在能夠控制溫度的銅板上載置多個(gè)該溶液的2pL的液滴，以0.2。C/分鐘將銅板冷卻、肉眼觀察冷凍的液滴數(shù)，以使50%的液滴冷凍的溫度為冷凍溫度。以含有被測(cè)定物和冰核活性細(xì)菌的溶液的冷凍溫度與僅由冰核活性細(xì)菌和緩沖液構(gòu)成的溶液的冷凍溫度的差值(°C)為過冷卻活性。
過冷卻促進(jìn)劑(也稱為過冷卻物質(zhì))是指通過以低濃度(一般在1%體積或重量％以下)添加到水中，而具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過依賴于添加濃度的凝固點(diǎn)下降的過冷卻活性的物質(zhì)。鹽、糖、糖醇等一般性的物質(zhì)顯示出凝固點(diǎn)下降溫度的2倍左右的過冷卻活性，但過冷卻促進(jìn)物質(zhì)顯示出IO倍以上，有時(shí)顯示出IOO倍以上的過冷卻活性。
該本發(fā)明的黃酮苷的過冷卻活性比如下述那些其它的被稱為過冷卻物質(zhì)的物質(zhì)的過冷卻活性更優(yōu)異。
1)從各種植物(桃等)的種子提取的未鑒定的粗提取物顯示出-2.6 —8.1°C的水的過冷卻活性(Capleetal.， (1983) Cryoletters， 4, 59-64.)。但是，
8該值是在下述條件下獲得的其僅使用作為冰核形成物質(zhì)能力低的碘化銀，
且使用的冷卻速度也為rc/分鐘，其比本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑的冷卻速度
遠(yuǎn)遠(yuǎn)地快。因此，該條件是易于進(jìn)行暫時(shí)性的過冷卻的條件。
2) 從丁香提取的丁子酚或其類似物顯示出-0.2 -2.5'C的水的過冷卻 活性(Kawahara and Obata (1996) J. Antibact. AntifUng. Agents, 24, 95-100.)。 添加濃度為lmg/mL、且冷卻速度也為rC/分鐘，其比本發(fā)明的過冷卻促進(jìn) 劑的冷卻速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)地快。因此，該條件是易于進(jìn)行暫時(shí)性的過冷卻的條件。
3) 檜木醇及其類似物顯示出-0.4 -2.rC的水的過冷卻活性(Kawahara et al., (2000) Biosci. Biotechnol. Biochem.， 64, 2651-2656.)。添加濃度為 10mM、且冷卻速度也為rC/分鐘，其比本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑的冷卻速度 遠(yuǎn)遠(yuǎn)地快。因此，該條件是易于進(jìn)行暫時(shí)性的過冷卻的條件。
4) 從細(xì)菌提取的130kDa的甲殼素多糖顯示出0 ~4.2°C的水的過冷 卻活性(Yamashita et al., (2002) Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 948-954.)。 添加濃度為50jig/mL、使用的冷卻速度為lT/分鐘，其比本發(fā)明的過冷卻 促進(jìn)劑的冷卻速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)地快。因此，該條件是易于進(jìn)行暫時(shí)性的過冷卻的 條件。
5) 各種不凍蛋白質(zhì)顯示出最大-7.8。C的水的過冷卻活性(Duman(2002) J. Comp. Physiol.， 172， 163-168.)。但是能夠獲得該最大值的添加不凍蛋白質(zhì) 濃度并不清楚，而且是添加0.5M的高濃度的檸檬酸時(shí)得到的值。僅不凍蛋 白質(zhì)為-L2T，其僅僅促進(jìn)過冷卻。
本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑含有上述的黃酮苷。
該黃酮苷通常以水溶液形式使用，通?？梢允怪?.01g/L以上、優(yōu)選 0.01 30g/L、更優(yōu)選0.01 10g/L、進(jìn)一步優(yōu)選0.1 1.0g/L溶解到水中并作 為防凍性液體使用。
該防凍性液體通常是將該黃酮苷溶解到水中而獲得的，但也可以使用 根據(jù)用途而含有添加物的水溶液來代替水。作為這樣的添加物，例如可列 舉出動(dòng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)基的成份、生物材料的保存液成份等。水溶液中的 添加物的濃度可以根據(jù)用途適當(dāng)?shù)卮_定。
另外，該防凍性液體也可以含有其它的過冷卻促進(jìn)劑或抗凍劑。
含有抗凍劑時(shí)，可以單獨(dú)或組合地含有1 40體積％、優(yōu)選1 20體 積％的抗凍劑。
9抗凍劑是指通過添加到生物材料或浸漬有這些生物材料的水溶液中， 從而減輕冷凍造成的傷害的物質(zhì)。被稱為抗凍劑的物質(zhì)都具有降低濃度依 賴的凝固點(diǎn)、減輕冰晶的形成量、減輕冷凍材料的鹽濃度上升、容易地進(jìn) 行玻璃化等中的一個(gè)或復(fù)合的效果。
作為這樣的抗凍劑，例如可列舉出甲醇、乙醇、乙酰胺、DMSO、甲 醛、乙二醇、丙二醇、甘油、脯氨酸、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、 聚乙二醇、葡聚糖10-150、 PVP、白蛋白、聚糖體、HES等。
這樣的防凍性液體在完全不加入抗凍劑的情況下或在以對(duì)凝固點(diǎn)下降 幾乎沒有影響的濃度(1重量％左右以下)添加抗凍劑等添加物的情況下， 能夠長(zhǎng)時(shí)間(1 2周)在-15°C附近保持液體狀態(tài)。
通過將生物材料(植物或動(dòng)物的細(xì)胞或組織、食用或觀賞用等的魚貝 類、蔬菜等植物的本身等、或者是其一部分)放入該防凍性液體中進(jìn)行冷 卻，可在通常約5°C以下的低溫下使用，且在0°C以下、特別在約0 -15°C 的溫度范圍下不引起冷凍地長(zhǎng)期低溫保存。
該防凍性液體通過利用過冷卻降低冷凍開始溫度，能夠減小冰晶的大 小，另外通過單獨(dú)或與防凍劑等并用，能夠用作通過冷凍干燥來制備的醫(yī) 藥品或食品等的冷凍控制劑。
在來自含有上述物質(zhì)的樹木等生物材料的提取物(粗提取液等)中， 可以有同樣的應(yīng)用。
另一方面，以高濃度含有上述抗凍劑的水溶液被稱為玻璃化液，即使 在超低溫(例如液氮溫度)下水也不會(huì)形成晶體，從而成為玻璃化體(非 晶質(zhì)的冰)(新野孝南等編「植物超低溫保存7二二7VW農(nóng)業(yè)生物資源研 究所発行2006年)。
玻璃化液是指單獨(dú)或幾個(gè)組合地含有20 100體積％、優(yōu)選40 100 體積％的上述防凍劑，且其余為水的溶液。作為水可以使用動(dòng)植物培養(yǎng)液 等溶劑。
在用于動(dòng)植物的培養(yǎng)或保存的情況下，優(yōu)選混合30體積％以上、特別 優(yōu)選40體積％以上的水或動(dòng)植物培養(yǎng)液。目前，最常使用的玻璃化液PVS2 為在培養(yǎng)基溶液中添加有30體積％的甘油、15體積％的乙二醇、15體積 %的DMSO和0.4 M的蔗糖的玻璃化液。培養(yǎng)基溶液的種類或濃度可以根 據(jù)進(jìn)行培養(yǎng)或保存的材料而適當(dāng)變更。本發(fā)明中，在該玻璃化液中通常添加0.01g/L以上、優(yōu)選0.01 30g/L、 更優(yōu)選0.01 10g/L、進(jìn)一步優(yōu)選0.1 1.0g/L的本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑。
這樣的玻璃體能夠在玻璃化液的冷凍溫度以下，例如-15。C、特別是 -60°C -273。C的溫度范圍例如液氮溫度(77K)下保持非晶質(zhì)狀態(tài)。
玻璃化所引起的冷凍保持通常預(yù)先將欲保存的材料在室溫或0°C以上 的溫度下進(jìn)行短時(shí)間浸漬處理。通過該冷凍前處理能夠?qū)⒉牧现械乃诟?濃度的玻璃化液中脫去，同時(shí)玻璃化液與材料內(nèi)水分進(jìn)行置換。因此，若 將這些材料投入液氮中，則材料內(nèi)外的水不形成冰晶地發(fā)生玻璃化。若將 植物等生物材料放入玻璃化液然后投入液氮中，則生物材料內(nèi)外的水變成 玻璃體(非晶質(zhì)的冰)，從而在玻璃狀態(tài)下不發(fā)生冷凍所引起的傷害，因此 能夠?qū)⑸锊牧显诔蜏氐牟ＡЩ褐欣鋬霰３帧?br> 下面，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行例證，但并不是為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。
實(shí)施例1
從在北海道札幌地區(qū)生長(zhǎng)的連香樹采集樹枝。將該連香樹樹枝的木質(zhì) 部組織用鉛筆刀削成小片后，在液氮中冷凍，用乳缽和乳棒盡可能地粉碎 成小片。將得到的木質(zhì)部組織的粉碎物3.7Kg浸漬到甲醇中2周。以14,000G 離心分離得到的提取液(Hitachi: HIMCCF15R)，回收上清液。干燥上清 液，將干燥物93.8g溶解到300mL水中。
將該粗提取物的水懸浮液在2(TC下以14，000G離心分離，回收上清液。 將該上清液300mL與乙酸乙酯600mL混合，用分液漏斗將水可溶部分與 乙酸乙酯可溶部分分離并干燥。
它們的過冷卻活性用以下的方法進(jìn)行測(cè)定。在含有冰核活性細(xì)菌 (Erwinia ananas)的滅活菌體(和光純藥)的緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖 液，pH為7)中混合0.5mg/mL的被測(cè)定物，在經(jīng)溫度控制的銅板上載置2|iL 的液滴，以0.2T/分鐘的速度冷卻銅板并肉眼觀察冷凍的液滴數(shù)，以50% 的液滴冷凍的溫度為冷凍溫度。測(cè)定該冷凍溫度與上述緩沖液的冷凍溫度 的差值(。C)。得到水可溶部分的過冷卻活性為-2。C左右、乙酸乙酯可溶部 分的過冷卻活性為^TC左右。
將顯示有更高的過冷卻活性的經(jīng)干燥的乙酸乙酯可溶級(jí)分用己垸/2-丙醇/水、氯仿/甲醇/水在自制的硅膠柱層析中分離30段級(jí)分。該硅膠柱層析
如圖1所示。接著，按照與上述同樣的方法測(cè)定各級(jí)分物質(zhì)的過冷卻活性。
其結(jié)果如圖2所示，級(jí)分9和IO顯示出最大過冷卻值。
將上述得到的級(jí)分9和IO用高效液相色譜法(柱Wakosil5C18HG、 溶劑甲醇:水=1:1、流速為lmL/分鐘)分析，結(jié)果如圖3所示得到顯示7 個(gè)物質(zhì)存在的峰(1 7)。
在這些峰中，顯示了過冷卻活性的僅為4、 5、 6、 7的峰(以下分別稱 它們?yōu)榛衔? 4(Cj4 7))。它們的活性分別為-1.8"C(化合物1)、-7.7°C (化合物2)、 -0,2。C (化合物3)、 -2.5°C (化合物4)。
這4種物質(zhì)用質(zhì)量分析裝置(JMS-AX500: JEOL)進(jìn)行負(fù)-HRFAB-MS 分析。這些物質(zhì)各自的質(zhì)量為463.0893 (Cj4)、 447.0942 (Cj5)、 477.1038 (Cj6)、 447.0958 (Q7)，分子式分別預(yù)測(cè)為C21H20O12 (Cj4)、 C21H20O (Cj5)、 C22H22012 (Cj6)、 C21H20O (Cj7)。
進(jìn)而將這些物質(zhì)進(jìn)行乙?；?，利用高分解能核磁共振裝置(BRUKER: AMX-500)進(jìn)行反應(yīng)生成物的各種一維和二維NMR譜圖分析。乙?；?應(yīng)是通過將約10mg的干燥試樣溶解到200pL甲醇中，并向其中加入2mL 醋酸酐和lmL吡啶，在70°C下處理1.5小時(shí)而進(jìn)行的。將得到的乙?；?用分取TLC進(jìn)行純化，然后溶解到氘代氯仿中進(jìn)行'H-NMR、 13C-COM、 DEPT、 'H」HCOSY、 HMBC、 HSQC的NMR譜圖分析。
從這些物質(zhì)均顯示具有在250 270nm和300 380nm處的吸收峰的特 征性的UV譜預(yù)測(cè)它們具有黃酮醇骨架。各個(gè)乙?；锏?！H-NMR譜圖表 示在圖4 7中。
將化合物1 (Cj4)與化合物4 (Cj7)的乙酰化物的111-,11譜圖進(jìn)行 比較，化合物l中由乙酰基帶來的信號(hào)(S1.92 2.45)為8個(gè)，并可見由 結(jié)合在B環(huán)的2'、 5'、 6'的氫帶來的信號(hào)(5 7.33、 7.93、 7.96)。從該結(jié)果 和HMBC相關(guān)可知化合物1為槲皮素-3-0-P-葡糖苷(圖4)。
化合物2 (Cj5)與化合物4 (Cj7)的乙?；锏腲-NMR譜圖同樣地 顯示7個(gè)由乙?；鶐淼男盘?hào)(S 1.92 2.45)、由B環(huán)的2'、 3'、 5'、 6'位 的氫帶來的信號(hào)(5 7.27、 7.84)、由結(jié)合于芳香環(huán)的2個(gè)氫帶來的信號(hào)(S 6.73、 7.01)。另外，乙?；衔?的酸水解產(chǎn)物而得到的構(gòu)成糖的乙酰 化物的!H-NMR譜圖與乙酰化的葡萄糖的^-NMR譜圖一致(圖5)。從構(gòu)成糖的1位的氫與苷元的7位的碳之間存在HMBC相關(guān)可知化合物2為山 奈黃素-7-0-卩-葡糖苷。
將化合物3 (Cj6)與化合物4 (Cj7)的乙?；锏膇H-NMR譜圖進(jìn)行 比較，化合物3中結(jié)合于芳香環(huán)的氫為1個(gè)(S6.79)，并可見由甲氧基帶來 的信號(hào)(54.01)。從該結(jié)果和HMBC相關(guān)可知化合物3為8-甲氧基山奈黃 素-3-0-(3-葡糖苷(圖6)。
化合物4 (Cj7)的乙?；锏?H-NMR譜圖顯示出由7個(gè)乙?；鶐?的信號(hào)(S1.92 2.45)、由B環(huán)的2'、 3'、 5'、 6'位的氫帶來的信號(hào)(57.23、 8.04)、由結(jié)合于芳香環(huán)的2個(gè)氫帶來的信號(hào)(S 6.84、 7.30)。另外，還確 認(rèn)了 (3-葡萄糖殘基的存在(S 3.60、 3.96、 5.04、 5.17、 5.28、 5.53)。在結(jié) 合于葡萄糖異頭碳的氫和葡萄糖3位的碳之間可見HMBC相關(guān)。從以上的 結(jié)果可知化合物4為山奈黃素-3-0-p-葡糖苷(圖7)。
從這些質(zhì)量分析和NMR譜圖分析的結(jié)果得出結(jié)論這些物質(zhì)均是黃 酮苷，且苷元是槲皮素、山奈黃素、8-甲氧基山奈黃素中的一個(gè)，是在這 些苷元上連接有1個(gè)葡萄糖的糖苷。
艮口，經(jīng)提取的過冷卻促進(jìn)物質(zhì)為下式表示的黃酮苷。式中的編號(hào)表示 化合物的編號(hào)。合成例1
在本合成例中，合成化合物5 (白楊黃素-7-0-P-D-葡糖苷)。 將白楊黃素(Chrycin，東京化成工業(yè)株式會(huì)社制)0.51g (2.0mmo1)、 1.38g( 10mmol)K2CO3、 0.12g(0.4mmol)芐基三丁基氯化銨和CHC13( 10ml) 進(jìn)行磁力攪拌，在室溫下加入1.61g (3.8mmoD四-O-乙?；?a-D-溴化吡喃 葡糖苷(關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社制)，然后加熱回流2小時(shí)。進(jìn)而，加入上述溴 化物1.00g (2.4mmo1)繼續(xù)加熱回流1小時(shí)。將反應(yīng)混合物與20mL 2N鹽 酸震蕩后，分離有機(jī)層并干燥(MgS04)。減壓濃縮并將得到的殘余物從己 烷/乙醇中結(jié)晶化，得到白楊黃素7-O-P-D-四-O-乙?；拎咸擒?.03g (收率為88%)。生成物的分析值如下所示。
FAB-MS: m/z 585 (M+H+， 57%)， 331 (29), 255 (100). FAB-HR-MS: m/z 585.1599 (calc. for C29H28013+H+, 585.1609)
薩R (DMSO-d6) S1.97 (3H， s), 2.02 (9H， s), 4.11 (1H， br d， J=12.4),
144.19 (2H， dd, J=5.3, 12.4)， 4.35 (1H, m)， 5.01 (1H, t like, J=9.6), 5.10 (1H, dd， J=7.9, 9.6), 5.39 (1H， t like, J=9.6), 5.76 (1H， d， J=7.9)， 6.47 (1H， d, J=1.6)， 6.84 (IH， d, =1.6)， 7.08 (1H, s)， 7.55-7.65 (3H， m)， 8.09 (2H， d， J=7.9)， 12.85 (lH，s， OH).
將上述得到的白楊黃素7-0-P-D-四-0乙?；拎咸擒?.23g (0.39mmol)加入10mL CH3OH-Et3N (2:1)并加熱回流12小時(shí)，然后濃 縮干燥。將得到的粗結(jié)晶從己烷/乙醇中結(jié)晶化，得到目標(biāo)物0.12g (收率 為72%)。生成物(化合物5)的分析值如下所示。
FAB隱MS: m/z 417 (M+H+, 15% )， 307 (32), 255 (34)， 154 (100). FAB國(guó)HR-MS: m/z 417.1180 (calc. for C21H20O9+H+， 417.1182)
NMR (DMSO-d6) S3.1-3.6 (5H, m), 3.70 (1H, m)， 4.62 (1H， br s, OH),
5.08 (2H, d like, J=6.9, anomeric H, OH)， 5.15 (1H, br s， OH)， 5.43 (1H, br s, OH), 6.47 (1H， d， J=2.0)， 6.87 (1H, d, J=2.0), 7.06 (1H, s)， 7.45-7.70 (3H, m)，
8.09 (2H， d, J=6.5)， 12.72 (1H, br s， OH).
13CNMR (DMSO-d6) 560.5， 69.5， 73.0， 76.4, 77.1, 94.9， 99.6， 99.7， 105.4， 105,5, 126.4， 129.0， 130.4, 132.1， 156.9, 160.9， 163.0， 163.5, 182.0.
合成例2、 3
在本合成例中合成化合物6 (芹菜素7-0-P-D-吡喃葡糖苷)和化合物7 (芹菜素4',7-二-0-P-D-吡喃葡糖苷)。
(1)芹菜素7-0-P-D-四-0-乙?；拎咸擒蘸颓鄄怂?，，7-二-0卩-0-四-O-乙?；拎咸擒盏暮铣?br> 按照己報(bào)道(J. Chin. Chem. Soc., 48， 201-206 (2001))的方法，將柚 (柚皮素，東京化成工業(yè)株式會(huì)社制)進(jìn)行碘氧化，制備芹菜素。將芹菜 素1.66g (6.1mmo1)、 3.59g (9.2mmo1)四-O-乙?；?a-D-溴化吡喃葡糖苷 (關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社制)和2.54g (9.2mmo1) Ag2C03加入30mL喹啉/吡啶 (1:1)中，在室溫下攪拌1小時(shí)。進(jìn)而，追加上述溴化物1.21g (3.1mmo1) 和0.83g (3.0mmo1) Ag2C03并繼續(xù)反應(yīng)8小時(shí)。將反應(yīng)混合物在50mL丙 酮中稀釋、攪拌后進(jìn)行硅藻土過濾。減壓濃縮濾液并將得到的殘?jiān)偃芙?到lOOmL乙酸乙酯中，先與30mL的2N鹽酸再與飽和氯化鈉溶液振蕩， 然后分離有機(jī)層并干燥(MgSQ4)。減壓濃縮并將得到的殘余物進(jìn)行兩次硅膠柱層析(氯仿:甲醇=40:1和氯仿:乙酸乙酯=1:1)，得到芹菜素7-0-|3-D-四-O-乙?；拎咸擒?.00g(收率為27%)和芹菜素4'， 7-二-0-卩-0-四-0-乙?；拎咸擒?.21g (收率為4%)。生成物的分析值如下所示
(a) 芹菜素7-0-(3-D-四-0-乙?；拎咸擒?；
FAB-MS: m/z 601 (M+H + , 30% ), 331 (41), 271 (91), 169 (100). FAB-HR陽(yáng)MS: m/z 601,1541 (calc. for C29H28014+H+， 601.1558)
'H NMR (DMSO-d6) 51.97 (3H, s)， 2.02 (9H， s)， 4.11 (1, br d， J=12.5), 4.19 (1H, dd， J=5.3, 12.5)， 4.33 (1H, m)， 5.01 (1H, t like, J=9.7)， 5.09 (2H， dd, J=6.9， 9.7), 5.39 (1H, 9.7)， 5.74 (1H, d， J=7.9), 6.44 (IH, d, J=2.1), 6.79 (IH， d, J=2,l)， 6.89 (IH, s)， 6.92 (2H, d， J=8.7), 7.95 (2H, d, J=8.7)， 13.02 (1H， s， OH).
(b) 芹菜素4，，7-二-0-p-D-四-0-乙?；拎咸擒?br> FAB陽(yáng)MS: m/z 931 (M+H+, 44% ), 601 (33)， 271 (66), 169 (49), 43 (100). FAB-HR-MS: m/z 931.2524 (calc. for C43H46023+H+, 931.2508)
'H NMR (DMSO-d6) 51.97 (6H, s), 2.01 (18H， s)， 4.0-4,25 (4H， m)， 4.25-4.37 (2H, m)， 4.95-5.15 (4H, m), 5.3-5.5 (2H, m), 5.76 (2H, br d， J=7,9， anomeric H), 6.47 (1H， d, J=2.0)， 6.83 (IH, d, J=2.0), 7.05 (IH, s), 7.17 (2H， d， J=8.9)， U0 (2H， d， J=8.9)， 12.91 (1H， s， OH).
(2)化合物6 (芹菜素7-0-(3-D-吡喃葡糖苷)和化合物7 (芹菜素 4'，7-二-0-(3-D—吡喃葡糖苷)的合成
將上述得到的芹菜素7-0-(3-D-四-0-乙酰基吡喃葡糖苷0.21g (0.35mmoO加入10mL CH3OH-Et3N (2:1)中，加熱回流12小時(shí)后，濃 縮干燥。從甲醇中結(jié)晶化得到的粗結(jié)晶，得到目標(biāo)物0.11g (收率為73%)。
通過同樣的反應(yīng)，從上述得到的0.17g芹菜素4'， 7-二-0-(3-D-四-0-乙 ?；拎咸擒盏玫角鄄怂?',7-二-0-(3-D-吡喃葡糖苷(78mg) (71%)。生
成物的分析值如下所示
(c) 化合物6 (芹菜素7-0-p-D-吡喃葡糖苷) FAB-MS: m/z433 (M+H^ 9%)， 241 (96)， 185(100).
m/z 431 (M-H+， 7% ), 279 (20), 269 (24), 148 (100). FAB隱HR隱MS: m/z 431.0993 (calc. for C21H2o01{rH+, 431.0978) MS (FAB+): m/z 433 (M+H+), 185, 150， 93, 75， 57, 45. iH麗R (DMSO-d6) S3.0-3.6 (5H， m)， 3.70 (1H, dd, J=4.8， 9.4), 4.60 (1H，m, OH), 5.08 (2H, d like, J=5.1， anomeric H, OH)， 5.13 (IH， d， J=4.5， OH)， 5.39 (IH, d， J=4.5, OH), 6.43 (IH, d, J=2.1), 6.82 (IH, d, J=2.1), 6.89 (IH, s), 6.93 (2H, d, J=8.8), 7.95 (2H， d， J=8.8)， 10.40 (IH, br s, OH)， 12.95 (1H， s， OH).
13CNMR (DMSO-d6) 560.6， 69.5， 73.0, 76.4, 77.1， 94.7, 99.4, 99.8, 103.0, 105.2, 115.9， 120.9, 128.5, 156.7, 160.9, 161.2， 162.7， 164.0, 181.8. (d)化合物7 (芹菜素4，，7-二-0-j3-D-卩比喃葡糖苷)
FAB-MS: m/z 595 (M+H + ， 0.6% )， 271 (4)， 185 (56)， 93 (100). FAB-HR-MS: m/z 595.1688 (cak. for C27H30O15+H+, 595.1663)
NMR (DMSO-d6) S3,1-3.6 (10H， m)， 3.70 (2H， m)， 4.55-4.65 (2H， m, OH), 5.0-5.1 (4H, m, anomeric H x2, OH x2), 5.14 (2H， d like, J-4.0, OH), 5.35-5.45 (2H， m, OH)， 6.44 (1H， d, J=2.1)， 6.86 (1H， d， J=2.1), 6.99 (IH, s), 6.19 (2H， d, J=8.9), 8.06 (2H， d, J=8.9)， 12.88 (1H， s, OH).
13C麗R (DMSO-d6) 560.55， 60.60， 69.5, 69.6, 73.0， 73.1, 76.4， 76.5, 77.1， 94.8, 99.5, 99.7， 104.0, 105.3， 116.5， 123.5， 128.1, 156.8, 160.2, 160.9， 162.8, 163.4， 181.8.
合成例4
在本合成例中合成化合物8 (野漆樹苷(Rhoifolin)，芹菜素7-0-(3-新
橙皮糖苷)。
將柚皮苷二水合物(東京化成工業(yè)株式會(huì)社制)1.23g (2.0mmol)和 0.51g (2.0mmol)碘加入吡啶(5mL)中，攪拌下加熱回流9小時(shí)。將反應(yīng) 液降至室溫后，濾掉不溶物，減壓濃縮濾液。將得到的殘余物從含水乙醇 中結(jié)晶化，得到目標(biāo)物0.47g (收率為41%)。生成物的分析值如下所示
FAB-MS: m/z 579 (M+H+， 10% )， 277 (57)， 241 (63), 207 (72)， 185 (100). FAB畫HR隱MS: m/z 579.1712 (calc. for C27H30O14+H+, 579.1714)
!H NMR (DMSO-d6) 51.19 (3H, d， J=6.1)， 3.1-3.9 (9H， m)， 4.47 (IH, d, J=4.4， OH), 4.6-4.75 (3H， m， OH x3), 5.12 (IH, s， anomeric H), 5.16 (1H， d， J=4.4， OH), 5.22 (H, d, J=6.6, anomeric H), 5.34 (1H， d， J=4.4, OH), 6.36 (IH, br s), 6.78 (IH， br s)， 6.86 (IH, s), 6.93 (2H， d, J=8.6)， 7.93 (2H, d, J=8.6)， 10.40 (IH, s， OH), 12.96 (IH, s, OH).13C畫R (DMSO-d6) S18.1, 60,4, 68.3， 69.6, 70.35, 70.43, 71.8, 76.2, 77.0， 77.1, 94.4, 97.7, 99.2, 100.4, 103.1, 105.3, 115.9， 120.9， 128.4, 156.8, 160.9， 161.2， 162.3， 164.0， 181.7.
實(shí)施例2
按照與實(shí)施例1相同的方法測(cè)定合成例1 4中合成的黃酮苷(下式的 化合物5 8、式中的編號(hào)表示化合物的編號(hào)。)的過冷卻活性。其中，被測(cè) 定物的濃度為0.1mg/mL。
結(jié)果，化合物5 (白楊黃素-7-0-D-吡喃葡糖苷)的過冷卻活性為4.5"C、 化合物6 (芹菜素7-0-D-吡喃葡糖苷)的過冷卻活性為-12.0。C、化合物7 (齊菜素4，，7-二-0-D-吡喃葡糖苷)的過冷卻活性為-4.9。C 、化合物8 (野 漆樹苷)的過冷卻活性為-1.8。C。
實(shí)施例3
將O.Ol重量％的山奈黃素-7-葡糖苷(化合物2 (Q5)) , Extrasynthese 公司制)和1體積。/。DMSO (和光純藥工業(yè)制，特級(jí))加入緩沖液(UW液， 100mM乳糖酸、25mMKH2P04、 5mMMgS04、 30mM棉籽糖、2.5mM腺 苷、3mM GSH、 lmM別嘌呤醇、0.25mg/mL鏈霉素、10UI/mL青霉素) 以制備保存液。DMSO是用來提高山奈黃素-7-0-葡糖苷的融解性的，并被 認(rèn)為即使在4。C的保存試樣中也不會(huì)對(duì)生存率產(chǎn)生影響(圖8)。
18另夕卜，為了進(jìn)行比較，還準(zhǔn)備不加入山奈黃素-7-0-葡糖苷和DMSO的
混合液(uv液)。
將豬肝臟5百萬細(xì)胞/mL浸漬到上述保存液0.5cc中，并使之在-5°C 和-8。C下過冷卻，在保存l、 4、 7天時(shí)，利用臺(tái)盼藍(lán)染色(GIBCO制)對(duì) 細(xì)胞的生存率進(jìn)行評(píng)價(jià)。
結(jié)果如圖8所示?？芍ㄟ^利用山奈黃素-7-0-葡糖苷的過冷卻所致的 低溫保存，能夠保持動(dòng)物細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間生存率。
實(shí)施例4
使用PVS2的75%稀釋液(22.5體積％甘油、11.25體積％乙二醇、11.25 體積％的DMSO、 0.4M蔗糖、其余為MS培養(yǎng)基(Murashige & Skoog的培 養(yǎng)基，DUCHEFABIOCHEMIEBV制)作為玻璃化液，向其中加入0.05重 量％的山奈黃素-7-0-葡糖苷(化合物2， Extrasynthese公司制)(以下稱為"75 %玻璃化液")。將酸果蔓的莖頂置于PVS2液中，由于室溫下的浸漬，生 存率因化學(xué)毒性隨著處理時(shí)間顯著地下降，因此使用將如上所述的玻璃化 液成份減至75%的混合液。
為了進(jìn)行比較，還準(zhǔn)備不加入山奈黃素-7-0-葡糖苷的該混合液。
從酸果蔓(在北海道大學(xué)農(nóng)學(xué)研究院經(jīng)傳代培養(yǎng)的酸果蔓)取出莖頂 (芽)，將其在室溫下浸漬到上述混合液中。
通過降低玻璃化液的濃度，相對(duì)于在室溫下的浸漬時(shí)間，莖頂?shù)纳?率緩緩下降，顯示出較高的生存率(圖9A和B對(duì)照區(qū))。
另一方面，圖9A的冷凍區(qū)顯示出在室溫下浸漬到含有山奈黃素-7-O-葡糖苷的75%玻璃化液中一定時(shí)間(負(fù)載時(shí)間)后，投入液氮中冷凍過夜， 然后在室溫下溶解后的生存率。同樣地，圖9B的冷凍區(qū)表示浸漬到不含有 山奈黃素-7-0-葡糖苷的75%玻璃化液中后，投入液氮后的生存率。
在使用未混合山奈黃素-7-0-葡糖苷的玻璃化液進(jìn)行冷凍的情況下，冷 凍所造成的傷害是顯著的(圖9B冷凍區(qū))。
但是，通過向玻璃化液中加入山奈黃素-7-0-葡糖苷，可知顯著地減少 了冷凍產(chǎn)生的傷害(圖9A冷凍區(qū))，從而可以超低溫保持。
酸果蔓的芽頂?shù)壬锊牧嫌捎谕ǔ２ＡЩ旱幕瘜W(xué)毒性而至今為止不 能夠進(jìn)行玻璃化保存。但是，通過將本發(fā)明的過冷卻促進(jìn)劑添加到玻璃化液中，從而使得即使將玻璃化液的濃度降低到可以抑制化學(xué)毒性的影響的 程度，也能夠充分發(fā)揮玻璃化液的功能，能夠不會(huì)由高濃度的玻璃化液的 毒性和冷凍而造成損傷地將生物材料在超低溫下進(jìn)行冷凍保存。
權(quán)利要求
1、一種過冷卻促進(jìn)劑，其含有下述通式表示的黃酮苷式中，X1～X4中至少一個(gè)為除去了單糖或寡糖的還原末端部分的半縮醛羥基的氫原子的糖殘基、其它為羥基或氫原子，R1～R6分別相同或不同地表示氫原子、羥基或甲氧基。
2、 如權(quán)利要求1所述的過冷卻促進(jìn)劑，其中，所述乂2為葡萄糖、甘 露糖或半乳糖的糖殘基，X、XS和XA分別相同或不同地表示羥基或氫原子， R/ R6為氫原子。
3、 一種不凍性液體，其為將權(quán)利要求1或2所述的過冷卻促進(jìn)劑溶解 于水或根據(jù)用途而含有添加物的水溶液中而形成的，該不凍性液體中含有 0.01g/L以上的所述過冷卻促進(jìn)劑。
4、 如權(quán)利要求3所述的不凍性液體，其中，單獨(dú)或組合地含有1 40 體積％的抗凍劑。
5、 如權(quán)利要求3或4所述的不凍性液體，其中，含有生物材料，并被 冷卻至0 -15°C。
6、 一種玻璃化液，其為在單獨(dú)或組合地含有20 100體積％的抗凍劑 且剩余為水或根據(jù)用途而含有添加物的水溶液的玻璃化液中，含有0.01g/L 以上的權(quán)利要求1或2所述的過冷卻促進(jìn)劑而成的。
7、 如權(quán)利要求6所述的玻璃化液，其中含有40體積％以上的所述水或根據(jù)用途而含有添加物的水溶液。
8、如權(quán)利要求6或7所述的玻璃化液，其中，含有生物材料，并被冷 卻至液氮溫度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種過冷卻促進(jìn)劑。本發(fā)明人在對(duì)在寒冷地區(qū)生長(zhǎng)的樹木的細(xì)胞液能夠在低溫下保持液體狀態(tài)的機(jī)理進(jìn)行研究的過程中，對(duì)成為其原因的物質(zhì)進(jìn)行了鑒定研究。其結(jié)果鑒定出了樹木中存在的過冷卻促進(jìn)物質(zhì)。對(duì)鑒定出的黃酮苷和經(jīng)合成的類似結(jié)構(gòu)的黃酮苷的過冷卻能力進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)含有這些黃酮苷的過冷卻促進(jìn)劑能夠在低溫下長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定地使大量的水過冷卻。本發(fā)明的含有過冷卻促進(jìn)劑的水溶液可用作用于在低溫下保持生物材料的溶液。
文檔編號(hào)C09K3/00GK101490199SQ20078002679
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2007年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日
發(fā)明者春日純, 橋床泰之, 福士幸治, 荒川圭太, 藤川清三 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人北海道大學(xué);奧林巴斯株式會(huì)社