專利名稱：以動物血球粉為原料制備血紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血紅素的制備方法。
背景技術(shù)：
血紅素是醫(yī)藥中的一種高效補鐵劑，含鐵量高，可以直接被腸黏膜細胞吸收，不產(chǎn) 生任何消化道刺激癥狀，生物利用率高，吸收率比一般鐵劑高約3倍。在治療缺鐵性貧血癥 同時也是抗貧血和抗腫瘤藥物的重要原料。在食品行業(yè)中，血紅素作為色素染劑，無毒、無 副作用，安全可靠。以豬血為原料，可生產(chǎn)有重要醫(yī)藥價值、食用價值的血紅素。作為副產(chǎn) 品，還可以綜合利用得到抗衰老、抗腫瘤、治療高血壓、糖尿病的SOD ；止血作用的凝血酶； 微生物培養(yǎng)基的蛋白胨等。從血液紅細胞中提取制備血紅素的的方法，目前已有廣泛的研究和報道。如冰醋 酸法(鐘耀廣利用冰醋酸提取血紅素的研究[J].食品科學2004，20 (4) :90-95)，丙酮提 取法(劉規(guī)等天然補鐵劑-血紅素鐵的研究進展[J]中國食品添加劑，2005，4 :5-8)，等電 位法(陳合等新型食品原料制備技術(shù)與應(yīng)用[M].北京化學工業(yè)出版社，2004)，以及酶 水解法和選擇溶劑法等。其中的丙酮法可分為酸性丙酮法(宋照軍等血紅素提取純化新 技術(shù)研究[J].廣州食品工業(yè)科技，2004，20(1) 6-11)和堿性丙酮法(吳寶慶等血紅素的 制備與應(yīng)用[J].精細與專用化學品，1999，9 :20-21)。其中酸性丙酮法，是在鮮血球中加入 鹽酸丙酮震蕩靜置，即可得到粗品血紅素；堿性丙酮法，則是在PH 12的強堿性環(huán)境和40 80°C加熱24h后，再調(diào)整pH至3 5，得到濃縮的血紅素復合體。上述傳統(tǒng)的血紅素生產(chǎn)方法，都是直接以豬、羊等動物屠宰后的新鮮血液(全血) 或紅細胞為原料進行提取。但新鮮動物血液的收集，運輸，保存存在明顯的條件限制。例如， 即使是來源相對集中的鮮豬血，其作為原料既存在原料運輸、貯存困難，且因原料中水分含 量過高，提取時易造成試劑的大量消耗，產(chǎn)品收率低、純度低、成本高。而加入抗凝劑后，即 使在4°C環(huán)境下保存，1周后也明顯開始腐敗，15天基本完全腐敗。腐敗后的血液極不利于 血紅素的提取。此外，上述文獻報道/使用的制備方法，除存在產(chǎn)品純度不高，需進一步純化的問 題外，還分別存在各自不同的問題和不足。例如，冰醋酸法雖具有簡單易行的特點，但收率 低，提取溫度高(100 105°C)，血蛋白和溶劑回收難，增加了生產(chǎn)成本，廢液處理不當還造 成污染。酶解法受影響的因素多，且酶解時間相對較長，一般在8小時以上，得到的血紅素 純度和得率均較低(純度 25%，收率<60%)。堿性丙酮法對溫度和時間都有較高的要 求，因而酸性丙酮法是目前使用最多的方法。公開號CN1594337A的中國專利文獻及李秀玲等人研究提出的利用蛋白沉淀劑 沉淀血紅蛋白(李秀玲等高純度血紅素制備工藝的改進[J].四川大學學報(醫(yī)學版)， 2004,35(5) =738-738, 744)中公開了一種對動物全血或紅細胞先以蛋白沉淀劑進行沉淀 得到血粉，再以其為原料，經(jīng)酸性丙酮法提取血紅素成分的方法，并給出了包括三氯醋酸溶 液、磺基水揚酸溶液、單寧酸溶液、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、氯仿、氯化鋇、硫酸銨、硫酸銅、硫酸鋅等諸多可供選擇的有機、無機類蛋白沉淀劑。該方法可以使丙酮的用量降至老工藝的 一半，產(chǎn)品純度可達99%以上，每升紅細胞能得到血紅素5 6g，鐵含量為5. 85%，收率約 為 68%。公開號101085777A的中國專利文獻中提出的羊血血紅素生產(chǎn)方法，是在新鮮羊 血中加入抗凝劑并離心分離血球，于200-220°C下經(jīng)噴霧干燥制成血球粉，再以該血球粉為 原料，經(jīng)酸性丙酮法提取、分離了得到血紅素。周淡宜等在“血紅素制備工藝的實驗研究”([J].藥物生物技術(shù)，2002，9(2) 103-104)中，還報道過以由低溫干燥得到的全豬血粉或血球粉為原料制備血紅素的方法。 雖然以低溫凍干得到的血球粉不存在血紅素被變性蛋白包裹的問題，但由于低溫冷凍干燥 技術(shù)的能耗相對較高，因此在工業(yè)化應(yīng)用中并不廣泛。而在采用高溫噴霧干燥時，由于血球 中的血紅蛋白部分在高溫條件下會因變性而將血紅素包裹起來，導致一般方法都難以使血 紅素被充分釋放和提取出來。即使采用酶解法等方式處理，最終得到產(chǎn)品的血紅素含量一 般也只能達到30%左右。這是影響和制約目前各種提取制備方法的重要因素。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明提供了一種以動物血球粉，特別是以由高溫噴霧干燥得到的豬血 粉為原料制備血紅素的方法，可以滿意地解決上述問題。本發(fā)明以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，是由新鮮動物血液分離得到的血 球粉為原料，經(jīng)酸性丙酮法提取和分離得到血紅素。其中，對所說的血球粉原料，首先是用 包括脲或鹽酸胍等胍類化合物等常用的變性蛋白溶解劑水溶液，將該血球粉原料充分溶解 后，再向溶解液中加入蛋白沉淀劑，充分沉淀后，收集沉淀，并充分洗滌，再以常規(guī)的酸性丙 酮法，特別是上述CN1594337A中國專利文獻及李秀玲等人所報道的酸性丙酮法，提取和分 離得到血紅素產(chǎn)物。本發(fā)明上述方法中所說的血球粉原料，可以按目前已有文獻報道/使用的各種方 法，首先由新鮮動物血液進行血球與血漿的分離，血漿用于其它有效成分提取，由收集的紅 血球部分進一步制成所說的血球粉。其中的血球粉的制備方式，除可以采用上述已有文獻 報道/使用的微波干燥，真空干燥、低溫冷凍干燥等各種方法外，由于目前常用的高溫噴霧 干燥(如一般可> 170°c)方法可以使溶液，乳濁液，懸浮液，熔融液或膏糊狀物能迅即蒸發(fā) 水分，使物料轉(zhuǎn)變?yōu)榉仙a(chǎn)要求的粉狀或顆粒狀物，特別是對粘度較高的新鮮動物血球 具有干燥速度快和能耗低等優(yōu)點，因此優(yōu)選采用的是由常用的噴霧干燥機，以噴霧干燥方 式制備得到。可以作為本發(fā)明方法使用的動物血球粉原料中，特別以使用豬血球粉為優(yōu)選，其 來源豐富，量大易得，有利于降低成本。由于以各種方式、特別是經(jīng)高溫噴霧干燥方式得到的血球粉，其紅血球都不可避 免地存在著細胞脫水，胞內(nèi)蛋白質(zhì)等均存在一定程度變性，將血紅蛋白中的血紅素包裹，導 致在提取血紅素時血球粉難以被溶解。因此本發(fā)明方法首先須用變性蛋白溶解劑，如常用 的脲或鹽酸胍等胍類化合物變性蛋白溶解劑的水溶液，將血球粉原料充分溶解。在各種變 性蛋白溶解劑中，由于脲的無毒性以及具有價廉、易得、水溶性高、遇酸易分解和安全易處 理等優(yōu)勢，因此以使用脲的水溶液為優(yōu)選。
使用變性蛋白溶解劑的目的及其作用，就是為使已變性的血紅蛋白被溶解，以釋 放和便于對血紅素的提取。因此，在能實現(xiàn)充分溶解的前提下，對所用變性蛋白溶解劑水溶 液的濃度和/或使用量，無需過多限制。試驗顯示，所說的脲、鹽酸胍等胍類化合物變性蛋 白溶解劑水溶液在濃度> lmol/1，即在lmol/1至接近飽和溶液的各種濃度下，都可以取得 所需要的溶解效果。但在兼顧溶解效果以及后續(xù)處理的洗滌、沉淀等操作過程中所需的溶 劑或試劑量等綜合考慮，所說的變性蛋白溶解劑水溶液以4 lOmol/Ι濃度的脲水溶液，或 2 6mol/l濃度的鹽酸胍水溶液為優(yōu)選。試驗顯示，血球粉質(zhì)地較細小均勻且攪拌效果較 好時，溶解血球粉時脲或鹽酸胍的水溶液用量可以相對較少，一般情況下，其用量為血球粉 質(zhì)量的7 10倍時，都可以取得滿意的效果。在上述變性蛋白溶解劑溶解后得到溶解液加入蛋白沉淀劑，使血紅蛋白充分沉淀 后，收集沉淀，并充分洗滌，除凈變性蛋白溶解劑，即得到純凈的血紅蛋白成分。所說的蛋白 沉淀劑可以選擇如前述CN1594337A文獻中所報道的各種有機、無機類的沉淀劑，如丙酮、 甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、飽和硫酸銨、33%氯化鈉鹽析液等各種常用蛋白沉淀劑中的一種。 其中，由于丙酮的毒性低、沉淀效果好，沸點低，易除去等優(yōu)點，是本發(fā)明制備方法中一種優(yōu) 選的蛋白沉淀劑。在所說的溶解液中加入蛋白沉淀劑，是使血紅蛋白能充分沉淀，與溶液分離，提高 血紅素的收得率和血紅素鐵的含量。因此對蛋白沉淀劑的加入量應(yīng)以能使沉淀充分、完全 為原則。例如，試驗顯示，在使用丙酮作為蛋白沉淀劑時，其加入量一般可為變性蛋白溶解 劑水溶液溶解后的溶解液1 2. 5倍的體積量，即可取得滿意的沉淀效果。對經(jīng)蛋白沉淀劑沉淀并收集的沉淀物，可以使用所用沉淀劑與水的適當濃度的混 合溶液進行洗滌。例如，使用丙酮作為蛋白沉淀劑時，對沉淀并收集的沉淀物，一般可以用 體積濃度50 80%的丙酮水溶液進行洗滌。上述的各步處理，通常在0°C至不高于物料體系的溶劑和試劑的沸點溫度，特別是 在室溫條件下，都可以順利進行和完成。經(jīng)上述方法得到的血紅蛋白沉淀物，即可采用前述文獻報道和使用的酸性丙酮法 繼續(xù)提取得到所說的血紅素產(chǎn)品。血紅素產(chǎn)品中的血紅素鐵作為一種高效補鐵劑，其鐵含量是一個重要的指標。 試驗結(jié)果顯示，采用本發(fā)明上述方法由豬血球粉為原料制備得到血紅素產(chǎn)品的純度可達 96 %、血紅素鐵含量可高達7. 5 %以上，顯著優(yōu)于目前文獻報道的以全豬血粉或新鮮豬血為 原料的血紅素和鐵的含量。本發(fā)明方法采用首先用變性蛋白溶解劑溶解血球粉中的變性蛋白，使血紅蛋白被 溶解釋放出來，為實現(xiàn)進一步以酸性丙酮等有機溶媒的充分提取創(chuàng)造了有利條件。特別是 采用以脲等呈弱堿性和易溶于水的變性蛋白溶解劑后，通過丙酮水溶液等后處理的洗滌可 以容易除去，在后期提取過程中的酸性環(huán)境下還可以被進一步除凈。因此，本發(fā)明方法不但 實現(xiàn)了血球和血漿有效成分的聯(lián)產(chǎn)，特別是避免了以來源豐富的鮮豬血為原料給生產(chǎn)帶來 的不便，使原料易于運輸和保存滿足集中規(guī)?；a(chǎn)，并大大提高了對豬血和豬血球粉的 利用率，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量。以下通過實施例的具體實施方式
再對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明。但 不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。
具體實施例方式實施例1血球粉制備在新鮮豬血中加入0. 8襯％檸檬酸三鈉抗凝劑，攪拌均勻(檸檬酸三 鈉先用少量蒸餾水完全溶解，并事先加入容器中，待加入鮮豬血時立即搖勻)，16600r/min 離心分離，分別收集血球和血漿。血漿用于其它有效成分提取。將收集的血球，在進風溫度 為200-220°C的條件下，用GPL型離心噴霧干燥機(成都倍力干燥設(shè)備有限公司)噴霧干燥 制得血球粉。實施例2將實施例1制備得到的，或采用前述101085777A文獻方式噴霧干燥得到的豬血球 粉7.5克，緩慢加入到6!1101/1的脲溶液60ml，攪拌溶解30min。緩慢加入2倍體積的丙酮， 調(diào)節(jié)PH近中性，攪拌3. Omin,使其充分沉淀，上清液無色透明。3000r/min離心后，收集紅色 沉淀。沉淀用70 (ν) %的丙酮水溶液80ml分3次攪拌洗滌，3000r/min離心(或抽濾、過濾 等方法)收集沉淀。按前述文獻方式，加入80ml酸性丙酮( !1<3)，攪拌提取301^11，抽濾， 并用酸性丙酮洗滌，合并濾液約110ml。濾液用1. Omol/1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6 7，析 出沉淀，用3000r/min離心IOmin分離得到沉淀。沉淀用0. lmol/1的NaOH溶液20ml溶解， 調(diào)節(jié)pH5 6，3000r/min離心lOmin，并用蒸餾水洗滌沉淀至中性，得血紅素產(chǎn)品0. 1447g。 產(chǎn)品純度為97. 51%。血紅素鐵含量為7.76%。實施例3將上述同樣的豬血球粉7. 5克，緩慢加入到6mol/l鹽酸胍溶液60ml中，攪拌溶解 30min。緩慢加入2倍體積的丙酮，調(diào)節(jié)pH近中性，攪拌3. Omin,使其充分沉淀，上清液無色 透明。后續(xù)操作同實施例2。得血紅素產(chǎn)品0. 1429g。產(chǎn)品純度為98. 01%。血紅素鐵含量 為 7. 48%。實施例4將上述同樣的豬血球粉7. 5克，緩慢加入到6mol/l的脲溶液中，攪拌溶解30min。 緩慢加入約2倍體積的乙醇，調(diào)節(jié)pH 6-8，攪拌3. Omin,使充分沉淀，上清液無色透明。 3000r/min離心，收集紅色沉淀。沉淀用70 (ν) %的丙酮水溶液80ml分3次攪拌洗滌， 3000r/min離心或抽濾、過濾等方法收集沉淀。加入80ml酸性丙酮(pH < 3)，攪拌提取 30min，抽濾，并用酸性丙酮洗滌，合并濾液約110ml。濾液用1. Omol/Ι的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 至6 7，析出沉淀，用3000r/min離心lOmin，分離得到沉淀。沉淀用0. lmol/1的NaOH溶 液20ml溶解，調(diào)節(jié)pH5 6，經(jīng)3000r/min離心lOmin，分離收集沉淀，并用蒸餾水洗滌至中 性，得血紅素產(chǎn)品0. 1417g。純度為96. 91%，血紅素鐵含量為7. 56%。實施例5將上述同樣的豬血球粉7. 5克，緩慢加入到4mol/l的脲溶液60ml，攪拌溶解 30min后，加入2. O倍體積的飽和硫酸銨溶液，調(diào)pH2_4，攪拌3. Omin。充分沉淀，上清液透 明。離心(3000r/min)收集紅色沉淀。沉淀用pH 10的70 (ν) %丙酮水溶液80ml分3次 攪拌洗滌后，加入IOOml酸性丙酮(pH < 3)，攪拌提取30min，抽濾，收集濾液。酸性丙酮
6分2洗滌沉淀，洗液并入濾液約130ml，用1. Omol/1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6 7，析出沉 淀，經(jīng)3000r/min離心lOmin，收集沉淀。沉淀用0. Imol/的NaOH溶液溶解定溶，測A385，調(diào) pH5 6，3000r/min離心lOmin，并用蒸餾水洗滌至中性，得血紅素產(chǎn)品0. 1474g。產(chǎn)品純度 為94. 78%。血紅素鐵含量為7. 18%。實施例6將上述同樣的豬血球粉7. 5克，緩慢加入到4mol/l的脲溶液60ml，攪拌溶解 30min后，加入1. 5倍體積的飽和氯化鈉溶液，調(diào)pH2_4，攪拌3. Omin。充分沉淀，上清液透 明。以后的操作同實施例5，得血紅素產(chǎn)品0. 1344g。產(chǎn)品純度為97.57%。血紅素鐵含量 為 7. 54%。
權(quán)利要求
以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，由動物血液分離得到的血球粉為原料，經(jīng)酸性丙酮法提取和分離得到血紅素，其特征是用包括脲或胍類化合物的變性蛋白溶解劑水溶液，將由動物血液分離得到的血球粉原料充分溶解后，向溶解液中加入蛋白沉淀劑，充分沉淀后，收集沉淀并充分洗滌后，以酸性丙酮法提取和分離得到血紅素產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，其特征是所說的血球 粉原料為豬血球粉。
3.如權(quán)利要求1所述的以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，其特征是所說的血球 粉原料為由新鮮動物血液分離后的血球成分經(jīng)> 170°C噴霧干燥后得到的血球粉。
4.如權(quán)利要求1至3之一所述的以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，其特征是所 說的變性蛋白溶解劑水溶液為濃度> lmol/1的脲或胍類化合物的水溶液，其用量為血球 粉質(zhì)量的7 10倍。
5.如權(quán)利要求4所述的以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，其特征是所說的變性 蛋白溶解劑水溶液為4 lOmol/1濃度的脲水溶液，或2 6mol/l濃度的鹽酸胍水溶液。
6.如權(quán)利要求1至3之一所述的以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，其特征是所 說的蛋白沉淀劑為丙酮、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、飽和硫酸銨、33%氯化鈉鹽析液中的一種。
7.如權(quán)利要求6所述的以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，其特征是所說的蛋白 沉淀劑為變性蛋白溶解劑水溶液溶解后的溶解液1 2. 5倍體積量的丙酮。
8.如權(quán)利要求1至3之一所述的以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，其特征是所 說的經(jīng)蛋白沉淀劑沉淀并收集的沉淀物，以所用沉淀劑與水的混合溶液進行洗滌。
9.如權(quán)利要求7所述的以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，其特征是所說的經(jīng)蛋 白沉淀劑沉淀并收集的沉淀物，用體積濃度50 80%的丙酮水溶液進行洗滌。
10.如權(quán)利要求1至3之一所述的以動物血球粉為原料制備血紅素的方法，其特征是所 說的用變性蛋白溶解劑水溶液溶解和在溶解液中用蛋白沉淀劑進行沉淀的操作，在0°c 低于物料體系的溶劑和試劑的沸點溫度下進行。
全文摘要
以動物血球粉為原料制備血紅素的方法。由動物血液分離得到的血球粉、特別是豬血粉為原料，經(jīng)酸性丙酮法提取和分離得到血紅素，其特征是用包括脲或胍類化合物的變性蛋白溶解劑水溶液，將由動物血液分離得到的血球粉原料充分溶解后，向溶解液中加入蛋白沉淀劑，充分沉淀后，收集沉淀并充分洗滌后，以酸性丙酮法提取和分離得到血紅素產(chǎn)物。該方法可以使血紅素由變性的血蛋白中充分釋放出來，制備得到純度為96％、血紅素鐵含量達7.5％以上的血紅素產(chǎn)品。
文檔編號C09B61/00GK101941975SQ201010257279
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者何啟富, 余蓉, 張革, 楊繼虞, 溫馨蔚, 皮桃英, 陳博 申請人:四川省德陽市生化制品有限公司