專利名稱：野菊花類黃酮類色素的提取和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及野菊花類黃酮色素的超聲提取及制備方法，屬于食品加工學(xué)領(lǐng)域，專 用于野菊類黃酮色素的提取和制備。
背景技術(shù)：
野菊[(Chrysanthemum indicum L.)or (Dendranthema indicum(Lirne)Des Moul.)]為菊科菊屬多年生草本植物，頭狀花序在秋、冬二季花初開放時(shí)采摘，直接曬干或 蒸后曬干入藥，藥材名野菊花(Flos Chrysanthemi indici)，《中國藥典》一部(2005版) 收錄。以完整，體輕，色黃，香氣濃者為佳。類黃酮(Flavonoids)是一大類酚類化合物，屬次生代謝物，主要分三類一為 花黃素類(Xantheine)，如黃酮(Flavone)、黃酮醇(Flavonol)、黃烷醇(Flananol)、異 黃酮(Isoflavone)、查爾酮(Chalcone)等；二為花色素類(Anthocyanidins)，如天竺葵 色素(Pelargonidin)、矢車菊色素(Cyanidin)、飛燕草色素(Delphinidin)、芍藥色素 (Peonidin)、牽牛花色素(Petunidin)、錦葵色素(Malvidin)等；三為鞣質(zhì)類(Tannin)。Yoshikawa et al. (1999)指出野菊花含黃酮類化合物，目前發(fā)現(xiàn)野菊花內(nèi)類黃酮 組分主要有蒙花苷、刺槐素/金合歡素、木犀草素、槲皮素、洋芹素/芹菜素、異澤蘭素、5， 3，4，-三羥基-6，7-二甲氧基黃酮、5，3，- 二羥基_6，7，4，，5，-四甲氧基黃酮等。野菊花類黃酮類色素的提取方法有微波或超聲提取，微波提取法中，隨著處理時(shí) 間的延長和處理功率的升高，提取液發(fā)熱現(xiàn)象嚴(yán)重并易溢出，給實(shí)際操作帶來困難。響應(yīng)曲 面法(RSM)是統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的合成，它包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、建模、檢驗(yàn)?zāi)Ｐ秃线m性、因子效 應(yīng)的評估、考察以及尋求因子最佳操作條件，近年來響應(yīng)面方法已成功地應(yīng)用于生物技術(shù) 的許多方面。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種野菊花類黃酮類色素的提取和制備方法，為 野菊的深度開發(fā)利用提供原材料保障。技術(shù)方案本發(fā)明的實(shí)施方案如下1.野菊花類黃酮類色素的超聲提取方法，包括(1)原料野菊花，材料潔凈，凈度彡99% ；(2)殺青將野菊花在采后的30min內(nèi)，105°C殺青3min ；(3)干燥殺青后于40°C通風(fēng)干燥；(4)粉碎用高速粉碎機(jī)將野菊花粉碎，過100目篩備用；(5)超聲提取將上述粉碎后的野菊花以60%乙醇為提取溶劑，液料比(ν/ w)40/1，浸泡2h后，在70°C水浴中進(jìn)行IOmin的超聲提取。2.野菊花類黃酮類色素的制備方法，包括(1)除雜將1中所得提取液抽濾除雜；
(2)濃縮70°C的水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至無醇味；(3)干燥-70°C冷凍后，真空冷凍干燥。(4)保存將上述干燥后的提取物-20°C避光保存?zhèn)溆?。本申請還要求保護(hù)按照上述提取、制備方法獲得的野菊花類黃酮類色素。野菊花類黃酮類色素的提取方法，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果(提取溶劑、料液比、提取 溫度、提取時(shí)間等)，運(yùn)用 Design Expert V7. 1· 4· 0 中 Central Composite Design (CCD)， 優(yōu)化野菊花類黃酮類色素的提取工藝。其超聲提取過程中最佳參數(shù)優(yōu)化為60%乙醇，液料 比(v/w)40/l，浸泡2h后，70°C水浴中超聲提取lOmin。有益效果本發(fā)明選用超聲提取和響應(yīng)曲面法(RSM)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，通過Design Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，開展超聲提取野菊花類黃酮色素方法和主要參數(shù)的 確定并對提取方法進(jìn)行優(yōu)化。與其他提取技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是(1)微波提取法中(附圖1)，微波低火15s處理的提取液的吸光值低于對照；時(shí)間 延長至30s，其吸光值有升高，但仍低于對照。中火處理下，樣品提取液的吸光值均低于對 照，這可能是由于類黃酮在提取溫度過高時(shí)發(fā)生了分解。微波試驗(yàn)中，隨著處理時(shí)間的延長 和處理功率的升高，提取液發(fā)熱現(xiàn)象嚴(yán)重并易溢出，給實(shí)際操作帶來困難。(2)黃酮類色素提取溶劑的選擇(附圖2)，雖然50%乙醇、甲醇、50%甲醇和85% 甲醇等為提取溶劑時(shí)，顯色后測得的吸光值均較大?？紤]溶劑安全性，確定選用50%乙醇。(3)選擇了適宜的提取條件，(4)本發(fā)明提供的類黃酮類色素的提取和制備方法，生產(chǎn)上可用于對野菊花類黃 酮類的提取制備。


圖1為微波處理對野菊花提取液吸光值的影響圖2為不同溶劑提取野菊花提取液的吸光值圖3為乙醇濃度對野菊花提取液吸光值的影響圖4為超聲處理時(shí)間對野菊花提取液吸光值的影響圖5為液料比對野菊花提取液吸光值的影響圖6為黃酮苷元標(biāo)準(zhǔn)品(槲皮素、木犀草素、芹菜素、刺槐素)的液相色譜7為野菊花類黃酮類色素樣品水解液的液相色譜8為蒙花苷標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜9為蒙花苷樣品的液相色譜圖
具體實(shí)施例方式本發(fā)明根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過響應(yīng)曲面法(RSM)設(shè)計(jì)了 50%、55%、60%、 65%、70%五個(gè)乙醇提取濃度處理、601、651、701、751、801五個(gè)溫度處理、30/1、35/1、 40/1、45/1、50/1五個(gè)液料比￥/1處理、611、811、1011、1211、1411五個(gè)超聲提取時(shí)間處理，以 510nm處吸光值為指標(biāo)篩選出最佳的萃取條件。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)優(yōu)化提取參數(shù)為提取溶劑 60%乙醇，液料比40/1，樣品先經(jīng)浸泡2h后，再在70°C水浴中進(jìn)行IOmin的超聲提取。將 提取液抽濾，70°C的水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，-70°C冷凍后再經(jīng)真空冷凍干燥，得野菊花類黃酮類色素提取物，-20°C避光保存?zhèn)溆?。?shí)施例1 安徽省金寨縣野菊花類黃酮類色素提取(1)原料安徽省金寨縣野菊花，材料潔凈，凈度> 99% ；(2)殺青將野菊花在采后的30min內(nèi)，105°C殺青3min ；(3)干燥殺青后于40°C通風(fēng)干燥；(4)粉碎用高速粉碎機(jī)將野菊花粉碎，過100目篩備用；(5)超聲提取將上述粉碎后的野菊花以60%乙醇為提取溶劑，液料比(ν/ w)40/1，浸泡2h后，在70°C水浴中進(jìn)行IOmin的超聲提?。?6)除雜濃縮將(5)中所得提取液抽濾除雜，70°C的水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至無醇 味；(7)干燥-70°C冷凍后，真空冷凍干燥后-20°C避光保存?zhèn)溆谩Ｋ崛〉奶崛∥镲@色鑒定10.0%鹽酸提取液呈黃色，說明野菊花中有類黃 酮類化合物(Flavonoid-type)存在；10. 0 %鹽酸提取液不顯紅色，說明不含花色苷 (Anthocyanins)。鹽酸-鎂粉還原反應(yīng)呈紫紅色，推測類黃酮可能為黃酮類、二氫黃酮類、 黃酮醇、二氫黃酮醇等。氨水試驗(yàn)呈深黃色，說明有黃酮醇；三氯化鋁試驗(yàn)呈淡黃色，說明有 黃酮類；碳酸鈉試驗(yàn)呈淡黃色，通氣后不變色，說明無二氫黃酮醇；三氯化鐵試驗(yàn)呈黃色， 說明類黃酮分子不含酚羥基。綜合分析認(rèn)為野菊花中所含類黃酮可能為黃酮、黃酮醇、二氫 黃酮等。提取物成分鑒定采用HPLC法，將以上得到的提取物的甲醇溶液直接進(jìn)樣分析；標(biāo)準(zhǔn)品木犀草素(116K4078，^98% )、槲皮素(87K0744，彡 98% )購自 Sigma ； 蘆丁 (15724AH,彡 95% )購自 Sigma-Aldrich ；刺槐素(14707294，彡 97% )購自 Fluka ；芹 菜素(11006KH，彡95% )購自Aldrich ；蒙花苷(11158_200606，98· 3% )購自中國藥品生 物制品檢定所。供試樣品液制備0. 2g野菊花藥材中加入IOmL甲醇，稱重，超聲提取45min，甲醇 補(bǔ)重，冷至室溫后過濾，續(xù)濾液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾備用。取備用液ImL定容為IOmL作為 總黃酮的測試液；以野菊花類黃酮類色素提取物的甲醇溶液作測試液。測定方法游離槲皮素、游離木犀草素、游離芹菜素、游離刺槐素在Agilent 1120 Compact LC上，選用 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱(4. 6mmX250mm，5 μ m)，流動(dòng)相A為甲醇， B 為 0. 2%磷酸水溶液，0-20min，A :47%，B 53% ；21-30min, A 47% -70%, B 53% -30% ； 31-40min, A -.70%, B 30% ；41_45min，A 70% -100%, B 30% -0 ；46_50min，A 100%, B 0。檢測波長350nm，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20μ ，柱溫25°C。以槲皮素，木犀草素，芹 菜素及刺槐素等為標(biāo)樣，峰面積外標(biāo)法定量?？傸S酮部分備用液或野菊花類黃酮類色素提 取物的甲醇溶液直接進(jìn)樣?？傞纹に亍⒖偰鞠菟?、總芹菜素、總刺槐素在總黃酮部分備用液或60%乙醇提取 物的甲醇溶液中加入濃鹽酸(樣/酸=5/1)，置90°C水浴水解60min，甲醇定容，0. 45 μ m 膜過濾，續(xù)濾液按游離苷元測定方法進(jìn)樣。蒙花苷按《中國藥典》一部(2005版)方法，在Shimadzu Prominence LC上，選用Shim-packVP-ODS C18 柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m)，流動(dòng)相甲醇 / /K / 冰醋酸=26/23/1，檢 測波長334nm，流速1. OmL/min，進(jìn)樣量20μ L，柱溫25°C。以蒙花苷為標(biāo)樣，峰面積外標(biāo)
法定量c
權(quán)利要求
野菊花類黃酮類色素的提取和制備方法，其特征在于由以下步驟組成(1)野菊花類黃酮類色素的超聲提取方法原料野菊花Chrysanthemum indicum L.；殺青將野菊花在采后的30min內(nèi)，105℃殺青3min；干燥殺青后于40℃通風(fēng)干燥；粉碎用高速粉碎機(jī)將野菊花粉碎，過100目篩備用；超聲提取將上述粉碎后的野菊花以60％乙醇為提取溶劑，體積/重量v/w的液料比為40/1，浸泡2h后，在70℃水浴中進(jìn)行10min的超聲提取；(2)野菊花類黃酮類色素的制備方法將(1)中所述提取液70℃的水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味， 70℃冷凍后再經(jīng)真空冷凍干燥，得野菊花類黃酮類色素， 20℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 2.按照權(quán)利要求1所述提取、制備方法獲得的野菊花類黃酮類色素。
全文摘要
本發(fā)明涉及超聲提取野菊花類黃酮類色素的提取和制備方法，屬于食品加工學(xué)領(lǐng)域，專用于野菊花深度加工。其原料和工藝為，野菊花殺青、干燥，低溫密封儲(chǔ)藏，過100目篩后以60％乙醇為提取溶劑，液料比(v/w)40/1，經(jīng)浸泡2h后，在70℃水浴中進(jìn)行10min的超聲提取干基得率13.34％；60％乙醇提取液70℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，再真空冷凍干燥，其中解析成分達(dá)到干基52.01％，包括總黃酮、蒙花苷、黃酮(木犀草素，刺槐素，芹菜素)、黃酮醇(槲皮素)、酚酸(綠原酸，咖啡酸)及金屬元素等。本發(fā)明為野菊花的深度加工提供了一種新方法，可操作性強(qiáng)，安全性好，重復(fù)性好。
文檔編號C09B61/00GK101955688SQ201010515860
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者劉麗, 申海進(jìn), 郭巧生 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)