專利名稱：一種定量檢測肝素的熒光探針及其合成方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)分析、生物分析領(lǐng)域，尤其是涉及一種熒光探針及其合成方法和用途。
背景技術(shù)：
眾所周知，肝素是能夠迅速達(dá)到抗凝血作用的首選藥物。它可用于外科預(yù)防血栓的形成以及妊娠者的抗凝血治療。對于急性心肌梗死患者，可用肝素來預(yù)防病人發(fā)生靜脈栓塞病，并可預(yù)防大塊的前壁透壁性心肌梗死病人發(fā)生動脈栓塞等。肝素的另一重要臨床應(yīng)用是在心臟、手術(shù)和腎臟透析時維持血液體外循環(huán)暢通。此外，肝素可用于治療各種原因引起的彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，也可用于治療腎小球腎炎、腎病綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎
坐 寸o肝素的主要不良反應(yīng)是易引起自發(fā)性出血，表現(xiàn)為各種黏膜出血、關(guān)節(jié)腔積血和傷口出血等；而肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥是一種藥物誘導(dǎo)的血小板減少癥，是肝素治療中的一種嚴(yán)重并發(fā)癥。藥物所致的血小板減少癥主要分為兩型(I)骨髓被藥物毒性作用抑制所致；(2)藥物通過免疫機(jī)制破壞血小板所致。后者中以肝素、奎寧、奎尼丁與磺胺類藥物發(fā)病較高。臨床癥狀極不一致，血小板減少至(1.0 80)\109/1，輕者無癥狀，重者可因顱內(nèi)出血或因肝素導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的免疫損害，這些副作用合并在一起會引起危及生命的肺栓塞與動脈血栓。臨床診斷主要依靠(I)藥物治療期間血小板減少；(2)停藥后血小板減少消除。嚴(yán)重患者血清中可檢出藥物依賴性血小板抗體，但敏感性不高而常呈假陰性。治療的關(guān)鍵是立即停用相關(guān)藥物，嚴(yán)重病例可使用輸注血小板、激素、丙球甚或血漿置換肝素不宜用于溶血尿毒綜合征。溶血尿毒綜合征(HUS)是小兒急性腎功能衰竭常見病因之一。兒童期典型腹瀉后HUS90%由出血性大腸桿菌0157:H7引起。目前認(rèn)為HUS發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是內(nèi)毒素啟動內(nèi)皮細(xì)胞受損，繼而出現(xiàn)凝血系統(tǒng)激活，炎癥介質(zhì)釋放，內(nèi)皮素-一氧化氮軸紊亂等多環(huán)節(jié)參與發(fā)病。全身各器官均有不同程度受損，主要是腎臟，其次是腦。治療上強(qiáng)調(diào)支持療法和早期透析，典型HUS的治療不提倡應(yīng)用肝素、抗生素和激素。不典型HUS可適用血漿置換，有一定療效。鑒于肝素的這些嚴(yán)重副作用，迫切需要發(fā)展能夠高選擇性高靈敏度的檢測肝素的熒光探針。光化學(xué)傳感器是近幾年來迅速發(fā)展起來的一個新的科學(xué)問題，它的出現(xiàn)和超分子科學(xué)的進(jìn)展諸如分子組裝，主客體化學(xué)，氫鍵作用，疏水作用，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過程，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移等特性密切相關(guān)。它的發(fā)展也和許多科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域諸如生物化學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)，藥物化學(xué)以及環(huán)境科學(xué)中涉及的大量實際問題密切相關(guān)。由于上述的種種原因，有力地推動了光化學(xué)傳感器的發(fā)展。光化學(xué)傳感器按照其信號檢測的不同，可以分為突光化學(xué)傳感器(FluorescentChemosensor)和比色化學(xué)傳感器(Colorimetric Chemosensor)。突光化學(xué)傳感器(即突光探針)主要是依靠熒光信號為檢測手段，通常有熒光的增強(qiáng)，淬滅或者發(fā)光波長的變化；比色化學(xué)傳感器則是借助于色調(diào)的變化，通過肉眼觀察就可檢測，實際應(yīng)用方便。
用來對外來物種進(jìn)行檢測的熒光化學(xué)傳感器的設(shè)計和研究，是近年來受到廣泛關(guān)注的一個課題。熒光傳感器的檢測過程是通過器件接受體部分對外來物種(包括陽離子，陰離子以及中性分子)進(jìn)行選擇性接納，然后經(jīng)過不同的機(jī)制如光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)，能量轉(zhuǎn)移(LMCT)，金屬-配體電荷轉(zhuǎn)移(MLCT)，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)，分子間的激基絡(luò)合物等，發(fā)生光學(xué)信號的變化，再通過器件的信號報告部分給出器件在接納物種過程中的信息變化。通過分子的發(fā)光現(xiàn)象和吸收光譜的變化來探測分子間的相互作用，其優(yōu)點可以概括為以下幾個方面，(I)方便快捷，具有很高的靈敏度；(2)可以利用光纖技術(shù)實現(xiàn)單細(xì)胞的實時檢測；(3)如果在吸收光譜上有比較大的變化，可以在不借助于任何儀器的情況下，直接通過顏色的變化來達(dá)到檢測的目的。許多分子結(jié)構(gòu)因素和它所處的環(huán)境因素都可用來控制熒光發(fā)光效率和吸收光譜的變化。因此，如TICT發(fā)光、MLCT發(fā)光、LMCT發(fā)光、激基締合物和激基復(fù)合物發(fā)光以及和重原子效應(yīng)、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移、電子能量轉(zhuǎn)移等相關(guān)的光物理和光化學(xué)特征等都已成功地用于化學(xué)敏感器的設(shè)計中。熒光化學(xué)傳感器由于其選擇性好，靈敏度高，響應(yīng)時間快等特點，目前在生物分子的檢測中受到越來越廣泛的關(guān)注。對于大多數(shù)肝素的熒光化學(xué)傳感器，其設(shè)計機(jī)制主要是通過陰-陽離子靜電作用，或者多點識別來實現(xiàn)熒光檢測。比率的熒光探針通常是探針分子在與被檢測物作用后，其在不同于原波長處出現(xiàn)一新的發(fā)射峰，并且該發(fā)射波長處的熒光逐漸增強(qiáng)，而原發(fā)射波長強(qiáng)度卻不斷減弱的探針分子。相對于單波長響應(yīng)的熒光探針，比率的熒光探針可以對兩個發(fā)射波長的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)測，帶有分子內(nèi)的自我校正，可以有效地消除全部或絕大部分來自于環(huán)境的干擾，同時將“on-off”型響應(yīng)的探針分子的缺點最小化，使得其被廣泛地應(yīng)用在復(fù)雜生物樣品檢測中。蒽和芘分子是非常有用的熒光團(tuán)，它不僅顯示單體的精細(xì)結(jié)構(gòu)熒光發(fā)射光譜，而且在一定條件下會在波長較長處顯示激基締合物的發(fā)射峰，顯示很好的比率信號響應(yīng)機(jī)制。目前文獻(xiàn)報道的肝素化學(xué)傳感器很少，且這些傳感器的選擇性差，靈敏度低，熒光發(fā)射波長短或者是僅用單一波長檢測，造成檢測結(jié)果不可靠，誤差大，難以避免血液中其它熒光物質(zhì)的干擾，能夠?qū)嶋H應(yīng)用的幾乎沒有。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種熒光探針；該熒光探針克服了現(xiàn)有技術(shù)中用于肝素檢測的熒光探針的性能和結(jié)構(gòu)上的不足，選擇性好，靈敏度高。本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種熒光探針的合成方法；該合成方法簡單、易操作。本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種熒光探針的用途。為解決第一個技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種熒光探針，它具有如下結(jié)構(gòu)式
權(quán)利要求
1.一種熒光探針，其特征在于，具有如下結(jié)構(gòu)式
2.如權(quán)利要求I所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，包括以下步驟 將帶有取代基為R1, R2, R3, R4, R5的單季銨鹽二胺溶解在有機(jī)溶劑中，加入鹵代烷基芳香烴，反應(yīng)后析出沉淀，得到具有下式(A)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲亞砜，乙腈，二氧六環(huán)，二氯甲烷，苯，甲苯中的一種或兩種混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，所述帶有取代基為R1, R2, R3, R4, R5的單季銨鹽二胺是按照以下步驟合成的將帶有取代基為R1, R2, R4, R5的三級二胺溶解在有機(jī)溶劑中，加入鹵代的R3化合物，在反應(yīng)溫度為30 100°C條件下反應(yīng)·0.5 12小時；反應(yīng)后將溶液濃縮，經(jīng)過柱層析，得到具有如下式(C)的化合物；所述三級二胺和所述鹵代R3化合物的摩爾比為I : 0. 5 I :
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲亞砜，乙腈，二氧六環(huán)，二氯甲烷，苯，甲苯中的一種或兩種混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，所述鹵代烷基芳香烴與所述帶有取代基為R1, R2, R3, R4, R5的單季銨鹽二胺的摩爾比為I 5 I。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，所述反應(yīng)是在溫度為30 100°C條件下反應(yīng)0. 5 80小時。
8.如權(quán)利要求I所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，包括以下步驟 將帶有取代基為R1的1，4_ 二氮雜二環(huán)[2. 2. 2]辛烷(DABCO)單季銨鹽溶解在有機(jī)溶劑中，加入鹵代烷基芳香烴，反應(yīng)后析出沉淀，得到具有下式(B)的化合物
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲亞砜，乙腈，二氧六環(huán)，二氯甲烷，苯，甲苯中的一種或兩種混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，所述帶有取代基為R1的DABCO單季銨鹽是按照以下步驟合成的將鹵代的R1化合物加入到DABCOD的有機(jī)溶劑中，在反應(yīng)溫度為30 100°C條件下反應(yīng)0. 5 12小時；反應(yīng)后將溶液濃縮，經(jīng)過柱層析方法，得到具有下式(D)的化合物；所述鹵代的R1化合物與所述DABCO的摩爾比為0. 5 1:1:
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲亞砜，乙腈，二氧六環(huán)，二氯甲烷，苯，甲苯中的一種，兩種或兩種以上混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，所述鹵代烷基芳香烴與所述帶有取代基為RJ^DABCO單季銨鹽的摩爾比值為1 5 I。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種熒光探針的合成方法，其特征在于，所述反應(yīng)是在溫度為30 100°C條件下反應(yīng)0. 5 80小時。
14.如權(quán)利要求I所述的一種熒光探針的用途，其特征在于，所述熒光探針可用于檢測血液中的肝素含量，也可用于化學(xué)模擬生物體系中肝素的檢測，以及臨床醫(yī)學(xué)上血液、血清或者組織中肝素的檢測。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的一種熒光探針的用途，其特征在于，所述熒光探針檢測肝素的過程為將探針分子溶解在生理鹽水或羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的緩沖水溶液中，然后在溶解有探針分子的溶液中加入血清，得到測試溶液，用熒光儀上逐一記錄其熒光發(fā)射光譜，根據(jù)其在雙發(fā)射波長的熒光強(qiáng)度比的變化能得到肝素的信息。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熒光探針，具有如下結(jié)構(gòu)式式中R1，R2，R3，R4，R5選自1～18個碳的烷基，芳基，酯基或醚基；n，m選自0～8；Ar選自萘，蒽或芘；X-選自F-，Cl-，Br-或I-。本發(fā)明還公開了該熒光探針的合成方法和用途，其可以用于檢測血液中的肝素，它分子結(jié)構(gòu)簡單，響應(yīng)時間短，測定靈敏度高，合成方法簡便。
文檔編號C09K11/06GK102796511SQ20111013940
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者汪鵬飛, 代青, 劉衛(wèi)敏, 趙文文, 莊曉青 申請人:中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所