專利名稱：一種用于磁光雙模生物標(biāo)記的稀土摻雜氟化釓鉀納米材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磁光雙模生物標(biāo)記材料及其制備方法，尤其是涉及稀土摻雜氟化釓鉀納米材料的制備及其在磁光雙模生物標(biāo)記領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多模生物檢測，由于其能夠同時實(shí)現(xiàn)光、核、磁、超聲等多種模式的成像檢測，而受到了科學(xué)界和社會越來越廣泛的關(guān)注，而其中磁光雙模生物標(biāo)記尤為引人注目。這是由于能夠提供檢測手段中最高的檢測靈敏度的光檢測容易受到探測深度的限制，磁共振成像雖·能夠進(jìn)行三維檢測，卻因?yàn)檩^低的探測靈敏度和分辨率而限制了其廣泛應(yīng)用。因此能夠?qū)⒋殴鈨煞N檢測模式集中在一起的磁光雙模生物標(biāo)記，就可以實(shí)現(xiàn)高分辨率、高靈敏度、和生物活體的體內(nèi)檢測。當(dāng)前的磁光雙模標(biāo)記材料大多是通過超順磁的氧化鐵納米顆粒與有機(jī)染料或量子點(diǎn)的結(jié)合來制備得到的。然而這種雜化材料在生物標(biāo)記領(lǐng)域的應(yīng)用卻面臨許多困難，如超順磁氧化鐵納米顆粒對正常細(xì)胞組織的磁誘導(dǎo)效應(yīng)不利于其在生物體內(nèi)的磁共振成像檢測；有機(jī)染料的光漂白、發(fā)射峰寬、光色度不純等弱點(diǎn)導(dǎo)致其探測信號的不穩(wěn)定；量子點(diǎn)毒性較大，制備成本較高，不適宜用作生物體內(nèi)成像標(biāo)記材料。此外，將兩種不同的顆粒結(jié)合在一起，往往會破壞它們各自的光學(xué)和磁學(xué)特性，而且必然會使顆粒尺寸增大，從而導(dǎo)致應(yīng)用效果大打折扣。(Kim, J. et al. “Multifunctional Uniform NanoparticlesComposed of a Magnetite Nanocrystal Core and a Mesoporous Silica Shell forMagnetic Resonance and Fluorescence Imaging and for Drug Delivery” AngewandteChemie-International Edition Vol. 47，8438-8441，2008 ;Huh，Y. M. et al. “Invivo magnetic resonance detection of cancer by using multifunctional magneticnanocrystals，，Journal of the American Chemical Society Vol. 127，12387-12391，2005)。稀土摻雜的含釓納米材料，由于其優(yōu)良的發(fā)光和磁學(xué)性能，而被廣泛認(rèn)為是新一代最佳的磁光雙模生物標(biāo)記材料。稀土摻雜的納米晶的熒光發(fā)射峰較窄、色度純、壽命長、光穩(wěn)定，比較適合作為生物熒光標(biāo)記材料。釓離子由于其4f電子層含有七個單電子，被認(rèn)為是元素周期表中最佳的T1磁共振成像造影劑的金屬離子。更為重要的是，由于發(fā)光的稀土離子和提供磁誘導(dǎo)效應(yīng)的釓離子來自于同一個納米顆粒，因此該方法可以避免復(fù)雜的合成程序和顆粒尺寸變大。氟化物，特別是AREF4 (A=堿金屬，RE=稀土離子)結(jié)構(gòu)的氟化物，由于其聲子能量較低并能夠?qū)崿F(xiàn)其他稀土離子的高濃度摻雜，所以被廣泛用作稀土離子摻雜的基質(zhì)。本發(fā)明通過在氟化釓鉀納米材料中摻雜不同的稀土離子可以實(shí)現(xiàn)其多色發(fā)光。同時利用納米顆粒表面的氨基可以與生物分子進(jìn)行連接而應(yīng)用于生物標(biāo)記。而利用基質(zhì)中含有的釓離子，該納米顆?？梢赃M(jìn)行T1磁共振成像標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種用于磁光雙模標(biāo)記的稀土摻雜氟化釓鉀納米材料的制備方法。本發(fā)明制備的稀土摻雜氟化釓鉀納米材料的組分為xLn3+— (1-x) KGdF4CLn=Ce,Pr, Nd, Sm, Eu, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb; x=0_60 mol% ) 本發(fā)明采用如下制備工藝將稀土氯化鹽、氯化釓、氯化鉀和聚丙烯亞胺完全溶解在蒸餾水、乙醇和乙二醇中；另將適量氟化銨溶解在蒸餾水和乙醇中并滴加到上述溶液，然后在50-230°C下水熱處理。沉淀經(jīng)過分離、洗滌、干燥后可得到表面氨基化的KGdF4 = Ln納米晶粉末。所述的稀土摻雜氟化釓鉀納米材料的表征通過X射線粉末衍射(XRD)實(shí)驗(yàn)檢測表明制備出的氟化釓鉀納米晶為純立方相結(jié)構(gòu)。透射電鏡(TEM)測試顯示得到的是25納米左右的均勻分散納米顆粒；高分辨透射電鏡(HRTEM)照片可以清楚的觀察到均勻連續(xù)的晶格條紋，表明納米顆粒結(jié)晶較好。另外，在納米晶中，可以通過摻雜不同的稀土離子實(shí)現(xiàn)所需要的特定熒光發(fā)射。選用據(jù)丙烯亞胺為表面活性劑，既可控制納米晶大小，又可實(shí)現(xiàn)其表面的氨基功能化。所得到氨基化的稀土摻雜氟化釓鉀納米材料的用途，其特征在于應(yīng)用于磁光雙模生物標(biāo)記和檢測。制備所得的稀土摻雜氟化釓鉀納米材料利用其表面的氨基與生物分子進(jìn)行連接，同時可通過稀土摻雜氟化釓鉀納米材料內(nèi)摻雜不同的稀土離子實(shí)現(xiàn)特定的發(fā)光，來對這一生物連接進(jìn)行檢測，應(yīng)用于熒光生物標(biāo)記等領(lǐng)域。本發(fā)明材料制備工藝簡單、成本低、重復(fù)性好、可以進(jìn)行大批量生產(chǎn)。本發(fā)明與目前國內(nèi)外制備的其他磁光雙模生物標(biāo)記材料相比，納米晶顆粒均一，尺寸小，發(fā)射峰窄，發(fā)光強(qiáng)度高，發(fā)光壽命長，磁馳豫率大，是一種優(yōu)良的新型的磁光雙模生物標(biāo)記材料。納米顆粒表面有氨基基團(tuán)，具有較好的水溶性，可以直接應(yīng)作磁光雙模生物標(biāo)記材料。


附圖I :KGdF4: Ln納米晶用作磁光雙模標(biāo)記材料的示意圖。附圖2 =KGdF4: Eu3+ (2. 5 mol%)納米晶 XRD 衍射圖樣。附圖3:摻KGdF4: Tb3+ (2. 5 mol%)納米晶的透射電鏡圖。附圖4:摻KGdF4: Dy3+ (2. 5 mol%)納米晶的高分辨透射電鏡圖。附圖5:胚肺成纖維細(xì)胞與不同濃度的KGdF4納米晶培養(yǎng)24小時后的活性圖。附圖6 :摻Ln3+1.5at% (Ln=Eu3+, Tb3+，Dy3+)的KGdF4納米晶的激發(fā)和發(fā)射光譜。附圖7 =KGdF4:Tb3+納米晶生物素化的流程示意圖。附圖8 :生物素化的KGdF4:Tb3+ (2. 5 mol%)對于不同濃度的抗生物素蛋白的檢測曲線。附圖9 =KGdF4納米晶的(a)磁共振馳豫率以及(b)不同濃度水溶液的磁共振成
像示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I :稱取 0. 0037 g 氯化銪(EuCl3 *6H20)、0. 8 g 氯化鉀(KCl)和 0. 37 g 氯化釓(GdCl3 *6H20)完全溶解在12 mL蒸餾水中，然后加入I mL乙醇、20 mL乙二醇、和10 mL聚丙烯亞胺溶液，攪拌得到透明溶液A ;在另一燒杯中將適量氟化銨溶解在0. 5 mL蒸餾水中，然后加入2. 5 mL乙醇，攪拌得到透明溶液B ;在攪拌狀態(tài)下，往溶液B中逐滴加入到溶液A，繼續(xù)攪拌十分鐘，將溶液轉(zhuǎn)移入水熱罐中，在170 °C下水熱處理20小時。冷卻后，將上層澄清液去掉，將下層沉淀用水和乙醇輪流洗滌三次后干燥，然后在60 °C真空條件下干燥得到KGdF4 = Eu3+納米晶粉末。將該納米晶粉末溶解在蒸餾水，可以得到無色透明溶液，在272.5 nm激發(fā)下，能夠觀察到較強(qiáng)紅色發(fā)光。實(shí)例2 :稱取0. 0037g氯化鋱(TbCl3 6H20)、I. 8g氯化鉀(KCl)和0. 37g氯化釓(GdCl3 6H20)完全溶解在5mL蒸餾水中，然后加入25mL乙醇、5mL乙二醇和5 mL聚丙烯亞胺溶液，攪拌得到透明溶液A;在另一燒杯中將適量氟化銨溶解在ImL蒸餾水中，然后加入ImL乙醇，攪拌得到透明溶液B;在攪拌狀態(tài)下，往溶液B中逐滴加入到溶液A，繼續(xù) 攪拌十分鐘，將溶液轉(zhuǎn)移入水熱罐中，在110 °C下水熱處理18小時.冷卻后，將上層澄清液去掉，將下層沉淀用水和乙醇輪流洗滌三次后干燥，然后在50°C真空條件下干燥得到KGdF4ITb納米晶粉末。將2毫克KGdF4 = Tb3+納米晶粉末溶解在20mL的蒸餾水，可以得到KGdF4 = Tb無色透明溶液。用272. 5 nm激發(fā)下，能夠看到綠色的發(fā)光。實(shí)例3 :稱取0. 0037g氯化鏑(DyCl3 6H20)、I. 8g氯化鉀(KCl)和0. 37g氯化釓(GdCl3 6H20)完全溶解在2mL蒸餾水中，然后加入28mL乙二醇和0. 5 mL聚丙烯亞胺溶液，攪拌得到透明溶液A;在另一燒杯中將適量氟化銨溶解在5mL蒸餾水中，然后加入ImL乙醇，攪拌得到透明溶液B;在攪拌狀態(tài)下，往溶液B中逐滴加入到溶液A，繼續(xù)攪拌十分鐘，將溶液轉(zhuǎn)移入水熱罐中，在140 °C下水熱處理24小時.冷卻后，將上層澄清液去掉，將下層沉淀用水和乙醇輪流洗滌三次后干燥，然后在65 °C真空條件下干燥得到KGdF4 = Dy3+納米晶粉末。將15毫克KGdF4 = Dy納米晶粉末溶解在20mL的蒸餾水，可以得到KGdF4 = Dy無色透明溶液。用272. 5nm激發(fā)下，能夠看到藍(lán)色的發(fā)光。實(shí)例4 :稱取不同質(zhì)量的KGdF4納米晶，分別加入到相同數(shù)量的胚肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，在37攝氏度，5%C02的培養(yǎng)箱中孵育24小時后，利用細(xì)胞活性檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)不同胚肺成纖維細(xì)胞在較大濃度的KGdF4納米晶水溶液中，仍然保持95%以上的活性，說明KGdF4納米晶具有生物兼容性。實(shí)例5 KGdF4:Tb納米晶連接生物素的制備。稱取0. 2 mmol生物素(biotin)以及0.2 mmol I-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和0. 5 mmol N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，溶解于20 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7. 2)，攪拌15分鐘，接著向其中加入20 mgKGdF4: Tb納米顆粒，攪拌I天，然后將沉淀離心分離，用蒸餾水和乙醇洗滌多次，在真空干燥箱中干燥，即可得到表面修飾生物素的KGdF4 = Tb無機(jī)納米晶。實(shí)例6 :將連接上生物素的KGdF4 = Tb納米晶溶解于磷酸鹽緩沖液(pH=7. 2)，分成相同體積的數(shù)份，然后與不同濃度的標(biāo)記有異硫氰酸熒光素的親和素(FITC-avidin)進(jìn)行培養(yǎng)后，在熒光讀板機(jī)上采取時間分辨光譜法進(jìn)行檢測，激發(fā)波長為253 nm，延遲時間為100 //S，門控時間為I ms。由于納米顆粒內(nèi)摻雜的稀土離子Tb3+與熒光素FITC存在的熒光共振能量傳遞(FRET)，結(jié)果顯示隨著加入的FITC-avidin濃度的增大，檢測到Tb3+對應(yīng)于489 nm波段的發(fā)光強(qiáng)度減小，同時突光素FITC對應(yīng)于520 nm波段的發(fā)光強(qiáng)度增大,在3.7-200 ( ) nM范圍內(nèi)，親和素濃度與熒光強(qiáng)度變化之間存在著較好的線性關(guān)系，說明利用納米顆粒的熒光可以應(yīng)用于檢測親和素。實(shí)例7 :將KGdF4納米晶溶解在水中，并稀釋成不同濃度 的KGdF4的水溶液。在醫(yī)用磁共振成像儀T1檢測序列下，隨著KGdF4濃度的增加，得到的圖片亮度逐漸增加，說明KGdF4可以用作T1磁共振成像造影劑。
權(quán)利要求
1.一種用于磁光雙模生物標(biāo)記的稀土摻雜氟化釓鉀納米材料的制備方法，其組分為表面氨基化的 xLn3+— (l-χ) KGdF4，其中 Ln=Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Tb, Dy, Ho, Er, Tm,Yb; X=CdOmoH
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的稀土摻雜氟化釓鉀納米材料的制備方法，其特征在于室溫下，將稀土氯化鹽、氯化鉀、氯化釓?fù)耆芙庠谡麴s水、乙醇、乙二醇和聚丙烯亞胺的水溶液中；另將適量氟化銨溶解在蒸餾水和乙二醇中，并逐滴加入上述溶液中，然后在50-230°C進(jìn)行水熱處理，最后將沉淀分離、洗滌、干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的稀土摻雜氟化釓鉀納米材料的用途，其特征在于該材料可以用作磁共振成像造影劑；利用制備所得的該材料表面的氨基與生物分子進(jìn)行連接，同時可利用摻雜的稀土離子的特定發(fā)光，來對這一生物連接進(jìn)行檢測，進(jìn)而可應(yīng)用于生物熒光標(biāo)記等領(lǐng)域。
全文摘要
一種用于磁光雙模生物標(biāo)記的稀土摻雜氟化釓鉀納米材料及其制備方法，涉及利用據(jù)丙烯亞胺為表面活性劑，在蒸餾水、乙醇、乙二醇中，將氯化釓、氯化鉀、氟化銨混合，在50-230℃下水熱處理一段時間。進(jìn)行洗滌干燥后，即可得到KGdF4:Ln納米晶，其組分為xLn3+－(1-x)KGdF4(Ln=Ce，Pr，Nd，Pm，Sm，Eu，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb；x=0-60mol％)。用本方法制備的稀土摻雜KGdF4納米熒光標(biāo)記材料，不僅可以控制納米顆粒的大小在25nm左右，而且水溶性較好，能利用其表面的氨基與生物分子進(jìn)行連接。另外通過在納米顆粒內(nèi)摻雜不同的稀土離子實(shí)現(xiàn)所需的特定熒光發(fā)射，來對這一生物連接進(jìn)行超敏檢測，說明通過這一制備方法得到的納米熒光標(biāo)記材料具有應(yīng)用于生物標(biāo)記領(lǐng)域的潛力。由于基質(zhì)中含有的釓離子，KGdF4納米晶可以進(jìn)一步用作T1磁共振成像造影劑。
文檔編號C09K11/85GK102757789SQ20111024219
公開日2012年10月31日 申請日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者朱浩淼, 李仁富, 涂大濤, 陳學(xué)元, 鞠強(qiáng) 申請人:中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所