專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)鈉/鉀離子比的方法和試劑盒以及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及一種鈉/鉀離子比檢測(cè)方法和試劑盒以及系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)的鈉、鉀是維持細(xì)胞生理活動(dòng)的主要陽(yáng)離子，是保持機(jī)體的正常滲透壓及酸堿平衡，參與糖及蛋白質(zhì)代謝，保證神經(jīng)肌肉的正常功能所必需，其含量是人體生理活動(dòng)的重要指標(biāo)。尿液、血清中鈉、鉀離子的含量水平在臨床上可用于診斷一些腎臟、心臟等方面的疾病。人體內(nèi)的鈉鉀離子水平處于一個(gè)平衡狀態(tài)，其比率的改變對(duì)人體健康有著重要影響。對(duì)健康而言，監(jiān)測(cè)鈉/鉀的比例可能比二者單獨(dú)的絕對(duì)數(shù)值更重要。在臨床上，通過(guò)檢測(cè)唾液鈉/鉀比，可診斷醛固酮增多癥。此外，美國(guó)學(xué)者近日研究證實(shí)24小時(shí)尿鈉/鉀比對(duì)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值顯著優(yōu)于單純的尿鈉或尿鉀檢測(cè)。由此可見(jiàn)，鈉/鉀比的監(jiān)測(cè)對(duì)預(yù)防心血管疾病具重要意義。現(xiàn)有技術(shù)中測(cè)定鈉、鉀離子濃度的方法主要有中子活化法、同位素稀釋質(zhì)譜法、化學(xué)測(cè)定法、火焰光度法、離子選擇電極法、酶動(dòng)力學(xué)法、原子分光光度法等。目前，臨床上經(jīng)常使用的方法是火焰光度法和離子選擇電極法。(I)火焰光度法火焰光度法是一種發(fā)射光譜分析法，利用火焰中激發(fā)態(tài)原子回降至基態(tài)時(shí)發(fā)射的光譜強(qiáng)度進(jìn)行含量分析，可檢測(cè)血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，該方法屬于經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)參考法，優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果準(zhǔn)確可靠，廣為臨床采用。通常采用的定量方法有外標(biāo)準(zhǔn)法和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法。外標(biāo)準(zhǔn)法一般操作誤差較大，不常采用。內(nèi)標(biāo)法是標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液采用加進(jìn)相同濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素進(jìn)行測(cè)定，一般是加入鋰內(nèi)標(biāo)，測(cè)定的是鋰/鈉或鉀電流的比值，而不是單獨(dú)鈉或鉀的電流，這樣，可減小燃?xì)夂突鹧鏈囟炔▌?dòng)等因素引起的誤差，因而有較好的準(zhǔn)確性。(2)離子選擇電極法(ISE法):在專(zhuān)用儀器上進(jìn)行血清和尿液的鉀、鈉離子測(cè)定。因其具有標(biāo)本用量少，快速準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是目前所有方法中最為簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的方法，幾乎有取代其他方法的趨勢(shì)。其原理是離子選擇電極是一種電化學(xué)傳感器，其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)對(duì)特定離子具有選擇性響應(yīng)的敏感膜電極，將離子活度轉(zhuǎn)換成電位信號(hào)，在一定范圍內(nèi)，其電位與溶液中特定離子活度的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)與已知離子濃度的溶液比較可求得未知溶液的離子活度，按其測(cè)定過(guò)程又分為直接測(cè)定法和間接測(cè)定法，目前大部分采用間接測(cè)定法，由于間接測(cè)定法將待測(cè)樣本稀釋后測(cè)定，所測(cè)離子活度更接近離子濃度。目前主要的電極種類(lèi)有玻璃膜電極，感應(yīng)材料為玻璃膜；固相電極，由難溶金屬物質(zhì)加壓成型；液態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹(shù)脂或內(nèi)裝聚氯乙烯作為感應(yīng)膜；纈氨霉素膜制成的K+電極。這些電極都具有一定壽命，使用一段時(shí)問(wèn)后，電極會(huì)老化，且價(jià)格昂貴。(3)化學(xué)測(cè)定法目前Na+、K+的化學(xué)測(cè)定主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱(chēng)為冠醚，均為離子載體進(jìn)行測(cè)定，由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部氧原子有未共用電子對(duì)可與金屬離子結(jié)合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結(jié)合不同直徑的金屬離子，從而可達(dá)到測(cè)出離子濃度的目的。(4)酶法酶法測(cè)定鉀的原理是利用鈉依賴(lài)的β -半乳糖苷酶催化人工底物ONPG(鄰硝基酚β -D-吡喃半乳糖苷);分解釋放出有色產(chǎn)物鄰硝基酚，在波長(zhǎng)420nm處測(cè)吸光度變化。酶法測(cè)鉀的原理是利用對(duì)丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸變?yōu)槿樗嵬瑫r(shí)伴有還原型輔酶I的消耗，在波長(zhǎng)340nm處測(cè)NADH的吸光度下降。酶法的優(yōu)點(diǎn)是不需特殊儀器，缺點(diǎn)是價(jià)格較貴。(5)原子分光光度法也可用于檢測(cè)血清中鉀、鈉離子，但操作復(fù)雜，誤差較大，不及火焰光度法簡(jiǎn)便?，F(xiàn)有的這些方法都是分別測(cè)定鈉、鉀離子濃度，再在測(cè)出的數(shù)值基礎(chǔ)上計(jì)算鈉/鉀離子比。到目前為止，尚沒(méi)有直接測(cè)定鈉/鉀離子比的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種利用菁染料超分子與鳥(niǎo)嘌呤四鏈體(G-四鏈體)作用體系檢測(cè)鈉/鉀離子比的新方法，以 及應(yīng)用該方法配制而成的鈉/鉀比檢測(cè)試劑盒。利用該試劑盒中的試劑，可利用熒光光譜儀器定量分析液體中鈉/鉀離子比，測(cè)定過(guò)程不受其他元素的影響，精確度高。同時(shí)，由于該試劑靈敏度很高，對(duì)不同鈉/鉀離子比表現(xiàn)出顏色上的變化，肉眼可見(jiàn)，可實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。本發(fā)明的總體技術(shù)路線(xiàn)為通過(guò)加入鈉/鉀離子來(lái)調(diào)控G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成或構(gòu)象轉(zhuǎn)變，隨之菁染料識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu)的變化，從而反映出鈉/鉀比值水平。具體為在低鈉/鉀比的環(huán)境下，DNA序列形成反平行結(jié)構(gòu)G-四鏈體，隨鈉/鉀比降低反平行G-四鏈體則發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，隨著G-四鏈體構(gòu)象轉(zhuǎn)變，菁染料的聚集形態(tài)發(fā)生變化，從而在顏色上發(fā)生改變，達(dá)到肉眼觀測(cè)，同時(shí)在熒光光譜上也發(fā)生明顯的變化，熒光強(qiáng)度的變化程度與鈉/鉀比值成正比，從而實(shí)現(xiàn)定量反映鈉/鉀比水平。本發(fā)明的第一方面提供一種檢測(cè)液體樣品中鈉/鉀比的方法，所述方法包括以下步驟(I)用PH6. 2 8. 2的緩沖溶液和可溶性鈉鹽和鉀鹽配制鈉/鉀離子比不同的多個(gè)溶液樣本，其中每個(gè)所述溶液樣本中含有相同濃度的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA分子以及相同濃度的菁染料；(2)將所述多個(gè)溶液樣本置于熒光光譜儀下，采用540nm至570nm的激發(fā)波長(zhǎng)，檢測(cè)在采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度；(3)以各個(gè)所述溶液樣本的鈉/鉀比作為橫坐標(biāo)或縱坐標(biāo)，以步驟(2)中測(cè)得的在采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)或橫坐標(biāo)作圖，從而獲得鈉/鉀比的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；(4)在待測(cè)液體樣品中加入所述DNA分子和菁染料，并調(diào)節(jié)pH值，以使待測(cè)液體樣品中所述DNA分子的濃度、菁染料的濃度以及pH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測(cè)試溶液；(5)將步驟(4)中獲得的測(cè)試溶液置于熒光光譜儀下，采用與步驟(2)中相同的激發(fā)波長(zhǎng)，檢測(cè)波長(zhǎng)在所述采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度；(6)利用步驟(5)中測(cè)得的熒光強(qiáng)度值在步驟(3)中獲得的鈉/鉀比標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中找到對(duì)應(yīng)的測(cè)試溶液的鈉/鉀比值；其中所述采集波長(zhǎng)在570nm至700nm范圍內(nèi)。本發(fā)明的方法可以方便地用于檢測(cè)各種溶液樣品中的鈉/鉀比值，例如，可以檢測(cè)人或動(dòng)物血液、尿液、唾液、細(xì)胞或其他體液中的鈉/鉀比。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA分子為分子序列中含有下式I的結(jié)構(gòu)的DNA分子GGYGGZGGMGG式I其中式I中的G代表鳥(niǎo)嘌呤，Y、Z、M分別代表一個(gè)或多個(gè)任意堿基，G代表鳥(niǎo)嘌呤堿基。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述菁染料為下式II的化合物
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)液體樣品中鈉/鉀離子比的方法，所述方法包括以下步驟 (1)用PH6.2 8. 2的緩沖溶液和可溶性鈉鹽和鉀鹽配制鈉/鉀離子比不同的多個(gè)溶液樣本，其中每個(gè)所述溶液樣本中含有相同濃度的菁染料及在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA分子； (2)將所述多個(gè)溶液樣本置于熒光光譜儀下，采用540nm至570nm的激發(fā)波長(zhǎng)，檢測(cè)采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值； (3)以各個(gè)所述溶液樣本的鈉/鉀比作為橫坐標(biāo)或縱坐標(biāo)，以步驟(2)中測(cè)得的采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)或橫坐標(biāo)作圖，從而獲得鈉鉀離子比的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； (4)在待測(cè)液體樣品中加入所述的DNA分子，并調(diào)節(jié)pH值，以使待測(cè)液體樣品中的菁染料和DNA分子的濃度以及pH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測(cè)試溶液； (5)將步驟(4)中獲得的測(cè)試溶液置于熒光光譜儀下，采用與步驟(2)中相同的激發(fā)波長(zhǎng)，檢測(cè)波長(zhǎng)在所述采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值； (6)利用步驟(5)中測(cè)得的中測(cè)得的熒光強(qiáng)度值在步驟(3)中獲得的鈉/鉀離子比標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中找到對(duì)應(yīng)的測(cè)試溶液的鈉/鉀比值； 其中所述采集波長(zhǎng)在570nm至700nm的范圍內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體的DNA分子為分子序列中含有下式I的結(jié)構(gòu)的DNA分子GGYGGZGGMGG 式I 其中Y、Z和M獨(dú)立地代表一個(gè)或多個(gè)任意堿基，G代表鳥(niǎo)嘌呤堿基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述G-四鏈體DNA的序列選自以下序列TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、TTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGA、TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA、AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG、GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG、GGTTGGTGTGGTTGG、 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG、 GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG 或GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述菁染料為式II的化合物，
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述C1-C6的烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中R1選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基、異己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；R2、R3> R4和R5獨(dú)立地選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戍基、異戍基、正己基或異己基。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述5元至7元環(huán)結(jié)構(gòu)為含有或不含有N或S原子的飽和或不飽和環(huán)結(jié)構(gòu)。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中Y選自氟、氯、溴、碘陰離子或三乙胺陽(yáng)離子。
9.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、磷酸鈉-磷酸氫鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液或磷酸鈉緩沖液。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶液樣本中鈉/鉀離子比的范圍優(yōu)選在O至10的范圍；所述在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA分子在溶液樣本中的濃度在O. 5至30 μ mo I/L的范圍；所述菁染料在溶液樣本中的濃度在I至30 μ mo I/L的范圍。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)鈉/鉀離子比的方法和試劑盒以及系統(tǒng)。本發(fā)明涉及檢測(cè)溶液中鈉/鉀離子摩爾比的方法，包括(1)配制鈉/鉀離子比不同的多個(gè)溶液樣本，其中每個(gè)所述溶液樣本中含有相同濃度的菁染料及在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA分子；(2)檢測(cè)采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值；(3)以各個(gè)所述溶液樣本的鈉/鉀比作為橫坐標(biāo)或縱坐標(biāo)，以步驟(2)中測(cè)得的采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)或橫坐標(biāo)作圖，從而獲得鈉鉀離子比的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；(4)在待測(cè)液體樣品中加入所述的DNA分子，并調(diào)節(jié)pH值，從而得到測(cè)試溶液；(5)檢測(cè)波長(zhǎng)在所述采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值；(6)在鈉/鉀離子比標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中找到對(duì)應(yīng)的測(cè)試溶液的鈉/鉀比值。
文檔編號(hào)C09B23/06GK103063629SQ20121055312
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者孫紅霞, 唐亞林, 向俊鋒, 楊千帆, 管愛(ài)嬌, 劉巖 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所