專利名稱：水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種含醚鏈結(jié)構(gòu)的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料，同時(shí)還涉及該熒光染料的制備方法。
背景技術(shù)：
Williams于1856年發(fā)現(xiàn)了菁染料(亦稱花菁)，1873年，Vogel發(fā)現(xiàn)該類染料具有異常靈敏的感光能力，從此，菁類染料在生物分析、化學(xué)分析、光譜增感、太陽(yáng)能電池等方面的應(yīng)用研究日新月異。菁類染料具有光譜范圍廣(550nm 1200nm)、摩爾消光系數(shù)高(可達(dá)IO5L.πιοΓ1.cnT1)、熒光量子產(chǎn)率較高、選擇性高以及靈敏度高等良好的特性。隨著生物技術(shù)和熒光標(biāo)示技術(shù)的飛速發(fā)展，菁染料已在DNA、蛋白質(zhì)及核酸的分析檢測(cè)中有廣泛應(yīng)用。此類化合物中最具代表性的當(dāng)屬熒光發(fā)射波長(zhǎng)不同、含有磺酸基的一系列水溶性菁染料，AmershanPharmacia Bio tech公司首先將其商標(biāo)注冊(cè)為Cy3、Cy5和Cy7,目前已作為新一代商品化熒光標(biāo)示劑，在生物芯片、分子信標(biāo)等方面都得到了重要應(yīng)用。但是，水溶性不對(duì)稱菁染料仍存在很多不足之處，比如:1)不對(duì)稱水溶性吲哚菁染料的分子極性通常較大，合成時(shí)副反應(yīng)多；副產(chǎn)物極性相近，產(chǎn)物的分離提純相當(dāng)困難。2)市售商品大都依賴國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格昂貴。3)菁染料的光穩(wěn)定性受染料的結(jié)構(gòu)、氧氣及氧濃度的大小影響。在氧的存在下，菁染料很容易發(fā)生光氧化反應(yīng)而褪色。在吲哚菁染料中，分子的共軛甲川鏈越長(zhǎng)，染料的穩(wěn)定性越差。三甲川吲哚菁染料在20°C下可保存四年之久，而對(duì)稱五甲川和不對(duì)稱五甲川菁染料暴露在空氣中顏色很容易由藍(lán)變紫，最后消失；七甲川菁染料的穩(wěn)定性更差。染料的光穩(wěn)定性差，影響了生物分析的可靠性，也不利于儲(chǔ)存。4)染料的水溶性對(duì)其熒光標(biāo)示性能有較大影響。染料的水溶性越小，染料在水中自聚集傾向越大，從而引起熒光猝滅，使染料在水中的熒光強(qiáng)度下降，熒光量子產(chǎn)率降低，不利于水相中生物分子的突光標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料，同時(shí)還提供了相應(yīng)的制備方法?；谏鲜瞿康?，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案:水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料，具有如下通式:
'0^sK,'..SO1丨丨! ^......' H I —....NN...
.!, ο..η..ο 其中 η=1，2，3。
/ ’I； !.0O
-1.-:.:0....0
IO^ O
COOHΨ所述水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料的制備方法，包括以下步驟:(I)合成N- (3，5- — (2- (2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)節(jié)基_2，3，3- 二甲基-5-磺酸基-3Η-吲哚:將2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3Η-吲哚、有機(jī)鉀鹽、3，5-二(2-(2_甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基芐溴依次加入醇溶劑中，在惰性氣體保護(hù)下回流反應(yīng)20-40h,反應(yīng)結(jié)束后蒸出溶劑，以甲醇/ 二氯甲烷混合溶劑為洗脫劑、用硅膠分離柱分離產(chǎn)物，得紅色固體；(2)合成目標(biāo)產(chǎn)物:將N-羧芐基-2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、N-(3，5_ 二(2-(2_甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)芐基_2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚以及縮合劑溶于乙酸/乙酸酐混合溶劑中，加入吡啶或嘧啶，惰性氣體保護(hù)下反應(yīng)l_6h，反應(yīng)溫度控制在60-100°C，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，加醇溶劑稀釋后加入乙酸乙酯析出沉淀，抽濾，以甲醇/乙腈混合溶劑為洗脫劑、用反相硅膠填料分離柱分離產(chǎn)物，分出三個(gè)色帶，接收第二個(gè)色帶，即得目標(biāo)產(chǎn)物；所述縮合劑為N，N' -二苯基二甲脒、β-苯胺基丙烯醛縮苯胺鹽酸鹽或戊二烯醛縮二苯胺鹽酸鹽。所述步驟(I)中2，3，3_三甲基-5-磺酸基-3Η-吲哚、有機(jī)鉀鹽以及3，5_ 二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基芐溴的摩爾比為1:1-3:1-3。所述步驟(2)中N-羧芐基-2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3Η-吲哚、N-(3, 5- 二(2-(2_甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)芐基_2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3Η-吲哚及縮合劑的摩爾比為1:1:1。所述醇溶劑為甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇。步驟(I)所用有機(jī)鉀鹽為乙酸鉀。步驟(I)中所用洗脫劑為體積比1: 2的甲醇/ 二氯甲烷混合溶劑。步驟(2)中所用洗脫劑為體積比1: 4-5的甲醇/乙腈混合溶劑。本發(fā)明在吲哚菁的“ N”原子上引入了具有醚鏈結(jié)構(gòu)的水溶性有機(jī)基團(tuán)，獲得了一種全新的化合物，其結(jié)構(gòu)已得到質(zhì)譜和核磁共振的確認(rèn)，而其熒光特性有熒光發(fā)射光譜可予以確證。水溶性有機(jī)基團(tuán)的引入賦予了吲哚菁良好的水溶性，而與其它同類材料相比，本發(fā)明提供的化合物又具有一定的脂溶性，對(duì)細(xì)胞具有很好的保護(hù)作用，因此在生物標(biāo)示領(lǐng)域更具優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，引入水溶性有機(jī)基團(tuán)后，產(chǎn)物在水中的自聚集傾向降低，具備了更強(qiáng)的光穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度以及較高的熒光量子產(chǎn)率；引入水溶性有機(jī)基團(tuán)后，產(chǎn)物與副產(chǎn)物的極性差別增大，使得產(chǎn)物的分離變得更加容易，利用反相硅膠柱就可分離得到高純水溶性11引哚菁染料。對(duì)于這種水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料，本發(fā)明還提供了相應(yīng)的制備方法，其合成與分離過(guò)程簡(jiǎn)單易操作，對(duì)促進(jìn)Cy3、Cy5和Cy7的推廣應(yīng)用和實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。具體而言，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果:I)提高了標(biāo)示生物分子時(shí)的標(biāo)示率熒光標(biāo)示物對(duì)生物分子的標(biāo)示，其標(biāo)示率取決于兩大因素:(I)標(biāo)示物中的活性基團(tuán)與生物分子中氨基等基團(tuán)的結(jié)合能力；(2)活性基團(tuán)遇水的分解速度。對(duì)于本發(fā)明的不對(duì)稱吲哚菁熒光染料，其水溶性有機(jī)基團(tuán)中的醚鏈與水可以形成分子間氫鍵，有一定的親水性，而醚鏈又具有較好的親脂性；水溶性有機(jī)基團(tuán)引入以后，不但使化合物具有良好的水溶性，而且和同類產(chǎn)品相比又有較好的脂溶性，這樣就提高了化合物中活性基團(tuán)與生物分子中氨基等基團(tuán)的結(jié)合能力，降低了遇水分解反應(yīng)的反應(yīng)速度，提高了標(biāo)示率。所合成的Cy5-671與同類化合物(N-對(duì)羧卞基_2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚-N-磺酸丙基-2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚五甲川)在同樣條件下標(biāo)示牛血清白蛋白，前者D/P值為:1.57 ;而后者D/P值為:1.23。標(biāo)示率顯著提高。2)簡(jiǎn)化了化合物的純化分離方法由于不對(duì)稱菁染料的合成副反應(yīng)多，副產(chǎn)物極性相近，產(chǎn)物的分離提純相當(dāng)困難，需采用HPLC純化，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室一般沒(méi)有相應(yīng)的條件。本發(fā)明化合物中帶有長(zhǎng)醚鏈有機(jī)基團(tuán)，增大了產(chǎn)物與副產(chǎn)物的極性差別，利用C18反相硅膠填料分離柱即可分離得到純品。該方法操作簡(jiǎn)單，后續(xù)分離簡(jiǎn)便。3)提高了熒光染料的穩(wěn)定性、熒光強(qiáng)度及熒光量子產(chǎn)率水溶性有機(jī)基團(tuán)中醚鏈的扇形結(jié)構(gòu)可以屏蔽化合物分子中的帶電基團(tuán)，降低染料在水中的自聚集傾向，使其具有相對(duì)較高的光穩(wěn)定性、較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度及較高的熒光量子產(chǎn)率。所合成的熒光染料Cy5-671與同類化合物(N-對(duì)羧卞基_2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚-N-磺酸丙基-2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚五甲川)相比，前者的摩爾消光系數(shù)為=LeXlO5L^mor1.cnT1,最大突光發(fā)射波長(zhǎng)為:671nm,最大突光發(fā)射強(qiáng)度為:358330，熒光量子產(chǎn)率為:0.20 ;后者的摩爾消光系數(shù)為:1.3 X IO5L.moF1.cnT1，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為:668nm，最大熒光發(fā)射強(qiáng)度為:293049，熒光量子產(chǎn)率為:0.15。可見(jiàn):Cy5_671的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，熒光量子產(chǎn)率增大。


圖1是實(shí)施例1的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料Cy5_671的質(zhì)譜圖；圖2是實(shí)施例1的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料Cy5_671的HNMR譜圖；圖3是實(shí) 施例1的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料Cy5_671的熒光發(fā)射光譜；圖4是實(shí)施例2的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料Cy3_567的質(zhì)譜圖；圖5是實(shí)施例2的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料Cy3_567的HNMR譜圖；圖6是實(shí)施例2的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料Cy3_567的熒光發(fā)射光譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料(Cy5_671)，其結(jié)構(gòu)為:
權(quán)利要求
1.水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料，具有如下通式:
2.權(quán)利要求1所述的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料的制備方法，其特征在于，該法包括以下步驟: (1)合成N-(3，5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)節(jié)基-2，3,3-二甲基-5-橫酸基-3H-吲哚:將2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、有機(jī)鉀鹽、3，5-二(2_(2_甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基芐溴依次加入醇溶劑中，在惰性氣體保護(hù)下回流反應(yīng)20-40 h，反應(yīng)結(jié)束后蒸出溶劑，以甲醇/ 二氯甲烷混合溶劑為洗脫劑、用硅膠分離柱分離產(chǎn)物，得紅色固體； (2)合成目標(biāo)產(chǎn)物:將N-羧芐基-2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、N-(3,5- 二(2-(2_甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)芐基_2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚以及縮合劑溶于乙酸/乙酸酐混合溶劑中，加入吡啶或嘧啶，惰性氣體保護(hù)下反應(yīng)1-6 h，反應(yīng)溫度控制在60-100°C，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，加入乙酸乙酯析出沉淀，抽濾，以甲醇/乙腈混合溶劑為洗脫劑、用反相硅膠填料分離柱分離產(chǎn)物，分出三個(gè)色帶，接收第二個(gè)色帶，即得目標(biāo)產(chǎn)物；所述縮合劑為N，N' - 二苯基二甲脒、β -苯胺基丙烯醛縮苯胺鹽酸鹽或戊二烯醛縮二苯胺鹽酸鹽。
3.如權(quán)利要求2所述的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料的制備方法，其特征在于，步驟(I)中2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3Η-吲哚、有機(jī)鉀鹽以及3，5-二(2_(2_甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基芐溴的摩爾比為1:1-3:1-3。
4.如權(quán)利要求2所述水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中N-羧芐基-2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3Η-吲哚、N- (3，5- 二(2- (2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)芐基_2，3，3-三甲基-5-磺酸基-3Η-吲哚及縮合劑的摩爾比為1:1:1。
5.如權(quán)利要求2或3或4所述的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料的制備方法，其特征在于，所述醇溶劑為甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇。
6.如權(quán)利要求5所述的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料的制備方法，其特征在于，步驟(I)所用有機(jī)鉀鹽為乙酸鉀。
7.如權(quán)利要求6所述的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所用洗脫劑為體積比1: 2的甲醇/ 二氯甲烷混合溶劑。
8.如權(quán)利要求6或7所述的水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所用洗脫劑為體積比1: 4-5的甲醇/乙腈混合溶劑。
全文摘要
水溶性不對(duì)稱吲哚菁熒光染料，通式為，n=1，2，3；制備步驟包括(1)合成N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)芐基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚將2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、有機(jī)鉀鹽、3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基芐溴依次加入醇溶劑中，在惰性氣體保護(hù)下回流反應(yīng)20-40h，反應(yīng)結(jié)束后蒸出溶劑，柱分離得紅色固體產(chǎn)物；(2)將N-羧芐基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚、上述產(chǎn)物以及縮合劑溶于乙酸/乙酸酐混合溶劑中，加入吡啶或嘧啶，惰性氣體保護(hù)下反應(yīng)1-6h，反應(yīng)溫度控制在60-100℃，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，加入乙酸乙酯析出沉淀，抽濾，以甲醇/乙腈混合溶劑為洗脫劑、用反相硅膠填料分離柱分離產(chǎn)物，分出三個(gè)色帶，接收第二個(gè)色帶，即得目標(biāo)產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C09B23/08GK103073909SQ20131003639
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者張付利, 湯昆, 賈春輝, 胡海廷, 邱娜, 張瀟晗, 王運(yùn)聚 申請(qǐng)人:河南大學(xué)