一種檢測(cè)線粒體中一氧化氮的熒光探針及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)線粒體中一氧化氮的熒光探針及其應(yīng)用。所述的熒光探針具有分子通式為BDP-NO或BDP-NO-T，BDP-NO的結(jié)構(gòu)通式如(Ⅰ)所示。本發(fā)明的熒光探針能夠快速的定位于線粒體中，并能夠?qū)ζ渲械囊谎趸M(jìn)行原位實(shí)時(shí)的檢測(cè)，另外，該探針還具有較好的化學(xué)、光穩(wěn)定性，較好的溶解性和生物兼容性，較高的一氧化氮選擇性，不受其他活性氧和活性氮等物種的干擾。激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)表明這類探針具有較好的細(xì)胞通透性，對(duì)細(xì)胞和生物體無(wú)明顯的毒副作用。
【專利說(shuō)明】一種檢測(cè)線粒體中一氧化氮的熒光探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一類可定位于線粒體，并檢測(cè)線粒體中一氧化氮的熒光探針。
【背景技術(shù)】
[0002]一氧化氮在生命科學(xué)中扮演重要角色，是一個(gè)重要的信使分子。自20世紀(jì)80年代，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在生物體生命活動(dòng)中會(huì)產(chǎn)生一氧化氮分子。一氧化氮不僅具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞、血壓生理調(diào)控和血小板凝聚的抑制等生理功能，而且還與很多疾病，包括基因突變、癌變、動(dòng)脈硬化等疾病密切相關(guān)。然而，生物體中產(chǎn)生的一氧化氮由于其生成量較少并且半衰期較短，對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)、原位、定量的檢測(cè)，將有助于我們進(jìn)一步了解一氧化氮的生理功能，有助于了解某些疾病的致病原因，并最終找到合適的治療方法。
[0003]生命體中的一氧化氮主要由處于線粒體中的一氧化氮合成酶生成，線粒體中的一氧化氮對(duì)于心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。目前對(duì)一氧化氮進(jìn)行檢測(cè)的熒光探針?lè)N類很多，例如商品化的一氧化氮探針DAF-FM(InvitrogenTM)，但是所有的這些探針都不具有線粒體定位功能，更無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體中所產(chǎn)生的一氧化氮進(jìn)行檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體中產(chǎn)生的一氧化氮進(jìn)行實(shí)時(shí)原位的檢測(cè)，急需開(kāi)發(fā)具有線粒體定位功能的一氧化氮熒光探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明提供一種可以檢測(cè)線粒體中一氧化氮的高靈敏度熒光探針。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種檢測(cè)線粒體中一氧化氮的熒光探針，所述的熒光探針的分子通式是BDP-NO或BDP-NO-T，BDP-NO的結(jié)構(gòu)通式如(I )所示，BDP-NO-T的結(jié)構(gòu)通式如(II )所示:
[0006]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)線粒體中一氧化氮的熒光探針，其特征在于:所述的熒光探針的分子通式是BDP-NO或BDP-NO-T，BDP-NO的結(jié)構(gòu)通式如(I )所示，BDP-NO-T的結(jié)構(gòu)通式如(II )所示:
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)線粒體中一氧化氮的熒光探針，其特征在于:所述的BDP-NO熒光探針的制備方法包括如下步驟:將3-硝基-4-氨基苯酚和氟硼吡咯類化合物加入到四氫呋喃中，再加入KI和碳酸鉀，加熱回流反應(yīng)22-26小時(shí)，除去溶劑，用二氯甲烷或甲醇為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析，得到中間產(chǎn)物；將中間產(chǎn)物溶于四氫呋喃和甲醇的混合液中，在還原劑存在下，反應(yīng)4-24小時(shí)，得到目標(biāo)產(chǎn)物BDP-NO ;或者，在2.5MPa的氫氣和催化劑催化下，反應(yīng)4-24小時(shí)，得到目標(biāo)產(chǎn)物BDP-N0。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)線粒體中一氧化氮的熒光探針，其特征在于:所述的催化劑為鈀碳或雷尼鎳；所述的還原劑為鐵粉和鹽酸的混合物，或氯化亞錫和鹽酸的混合物。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)線粒體中一氧化氮的熒光探針，其特征在于:所述的BDP-NO-T的制備方法包括如下步驟:將BDP-NO溶于甲醇和水的混合液中，加入飽和一氧化氮水溶液，室溫?cái)嚢?0-40分鐘，以二氯甲烷或甲醇為洗脫劑，經(jīng)硅膠柱層析，得到目標(biāo)產(chǎn)物 BDP-NO-T。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)線粒體中一氧化氮的熒光探針在檢測(cè)生理體系中一氧化氮的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光探針在檢測(cè)活細(xì)胞線粒體中一氧化氮的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的活細(xì)胞為Hela細(xì)胞株、MCF-7細(xì)胞株、或RAW264.7細(xì)胞株。
8.如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于方法如下:取濃度為0.05-0.1M的BDP-NO的二甲基亞砜溶液，加入到含有活細(xì)胞線粒體的培養(yǎng)皿中，與細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻后，使BDP-NO在培養(yǎng)液中的終濃度達(dá)到l_50uM，將該培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24小時(shí)，分別取上清液和細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C09K11/06GK103923641SQ201410189357
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】于海波, 宋有濤, 李紅玲, 王杰瓊, 王寧, 曹珍 申請(qǐng)人:遼寧大學(xué)